Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
Невирусные системы доставки геновВ опосредованной вирусами доставке генов участвуют клеточные рецепторы, с помощью которых вектор проникает в клетку-мишень, не разрушаясь лизосомными ферментами, и векторная Генная терапия 499
ДНК попадает в ядро. Однако вирусные векторы имеют ряд недостатков: они дорогостоящи и часто обладают ограниченной клонирующей емкостью, что не позволяет регулировать экспрессию «терапевтического» гена с помощью тканеспецифичных последовательностей. Кроме того, вирусные белки могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Поэтому были разработаны невирусные системы доставки генов. Самая простая из них — прямое введение ДНК-конструкций в клетки ткани-мишени. Если в скелетную мышцу мыши инъецировать плазмидную ДНК, то она проникнет в некоторое число клеток, о чем свидетельствует экспрессия гена-ре портера в течение по крайней мере 50 сут. Однако применение этого подхода ограничивается тем, что не все ткани доступны для инъекций, а кроме того, нужны большие количества ДНК. Можно бомбардировать с помо- 500 ГЛАВА 21
Генная терапия 501 щью генного «ружья» клетки кожи или — через надрез — клетки подкожной опухоли конъюгированными с ДНК частицами золота диаметром 1—3 мкм. Введенные таким образом «терапевтические» гены экспрессируются в тканях-мишенях, а их продукты поступают в кровь. Это может облегчить доставку терапевтического белка в ткань-мишень, прямой доступ к которой затруднен. Однако большинство белков, в норме не присутствующих в крови, инактивируются или разрушаются ее компнентами. Для решения этой проблемы нужны дополнительные исследования. Проникновение ДН К через клеточную мембрану можно облегчить, окружив генетическую конструкцию искусственной липидной оболочкой, образующей липидную сферу (липосому) с водным содержимым. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, например катион-ные липосомы, поверхность которых заряжена положительно; они связываются с отрицательно заряженной молекулой ДНК, образуя ДНК-липидный комплекс (липоплекс). Липоплексы легко образуются, относительно нетоксичны и неиммуногенны, но эффективность переноса генов с их помощью невысока, поскольку большая часть ДНК после попадания в клетку захватывается лизосомами и разрушается. Так, в одном из клинических испытаний по генной терапии муковисцидоза с использованием комплекса липосома— CFTR-генчастота трансфекции клеток назального эпителия оказалась довольно низкой, а экспрессия гена - непродолжительной. Для доставки в клетки крупных генетических конструкций (>10 т. п. н.) с помощью эндосомного клеточного транспорта, позволяющего избежать лизосомного разрушения ДНК, образуют конъюгат ДНК с другими молекулами. Для этого поли-L-лизин ковалентно сшивают с молекулой, связывающейся со специфическим клеточным рецептором, а затем добавляют ДНК. В результате получается компактная, плотно скрученная структура (тор), на внешней поверхности которой располагаются сайты связывания с клеточным рецептором (рис. 21.11). К сожалению, подобный конъюгат, несмотря на свою специфичность, обладает низкой эффективностью трансфекции. Все созданные к настоящему времени невирусные системы доставки имеют два основных недостатка: I) низкая частота трансфекции, не позволяющая достичь нужного терапевтического эффекта; 2) непродолжительное время экспрессии «терапевтического» гена, не обеспечивающее эффективного лечения. Возможно, подходящим терапевтическим вектором станет искусственная хромосома человека. Это связано с; 1) возможностью включения в нее протяженных сегментов чужеродной ДНК вместе с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких «терапевтических» генов; 2) возможностью использования геномного варианта «терапевтического» гена, обеспечивающего высокую эффективность его экспрессии; 3) стабильностью «терапевтического» гена и его длительной экспрессией как в пролиферирующей, так и в неделящейся клетке-мишени. Искусственная хромосома содержит три основных элемента: концевые участки (теломеры), центромеру и точки инициации репликации. Свойства теломерных областей хромосом человека хорошо изучены, чего нельзя сказать о центромерах и точках инициации репликации, и существовали опасения, что искусственную хромосому человека не удастся сконструировать, пока не будут досконально изучены все ее элементы. Однако уже получены и поддерживаются в трансфицированной культуре клеток стабильные линейные искусственные хромосомы человека (микрохромосомы), состоящие из множества ДНК-повторов (длиной около 1 м. п. н.) центромерной области Y-хромосомы, высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК и теломерных участков. В их центромерную область был встроен ген устойчивости к неомицину, что позволило использовать среду G4I8 в качестве селективной, В нескольких G418-устойчивых клетках были обнаружены микрохромосомы длиной от 6 до 10 м. п. н. Две из трех микрохромосом были получены «усечением» существующей хромосомы. В одном случае исходная центромера была сохранена, а в другом заменена трансфицированной центромерной областью. Третью, полностью искусственную микрохромосому получили лигированием in vitro трех трансфицированных 502 ГЛАВА 21 ДНК-элементов. Ясно, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей «терапевтический(е)» ген(ы), вполне реально, но основной проблемой станет доставка этой огромной молекулы ДНК в ядро клетки-мишени. Кроме того, экспрессия генов, входящих в состав ДНК-блоков, из которых построена искусственная хромосома, может оказывать вредные воздействия на клетки-мишени. Для начала в ткани пациента можно попытаться имплантировать инкапсулированные клетки с искусственными хромосомами.
Генная терапия 503 Активация предшественника лекарственного вещества («пролекарства»)Несмотря на широкое применение хирургических методов лечения, лучевой и химиотерапии, злокачественные новообразования по-прежнему остаются одной из основных причин смерти людей, поэтому задача разработки новых способов их лечения является весьма актуальной. Одним из таких способов является уничтожение пролиферирующих опухолевых клеток с помощью ганцикловира [GCV; 9-(1,3-Дигидрокси-2-пропоксиметил)гуанина], активированного продукта гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk). Для этого проводят in vivo трансдукцию или трансфекцию опухолевых клеток геном HSVtk, находящимся под контролем активного промотора, а через несколько дней вводят ганцикловир. Вирусная тимидинкиназа фосфорилирует ганцикловир с образованием ганцикловирмонофосфата. Киназы клетки-хозяина почти не фосфорилируют ганцикловир, зато охотно присоединяют фосфатные группы к его монофосфату с образованием ганцикловир-трифосфата, который ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, вызывая гибель пролиферирующих клеток. Кроме того, через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может проникать в нетрансфицированные опухолевые клетки, приводя и к их гибели. Одна экспрессирующая ген HSVtk опухолевая клетка может уничтожить до 10 немодифицированных клеток. Это явление называется «эффектом свидетеля». Ген, вызывающий при определенных условиях гибель собственной клетки, называют геном «самоубийства», а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества, которая аюлвируется с помощью другого компонента терапевтической системы. Разработаны и другие комбинации «пролекарство» — ген-активатор, но система GCV—HSVtk используется чаще других. Эффективность системы GCV-HSVtk доказана целым радом доклинических испытаний. Однако I фаза ее клинических испытаний, в которых участвовали больные с терминальной стадией рака, не показала регресса опухоли. Возможно, ген HSVM был трансдуцирован в слишком малое число опухолевых клеток и, несмотря на «эффект свидетеля», не мог подавить рост опухоли. В настоящее время разрабатываются новые подходы, которые смогут повысить частоту трансдукции и доставить ген HSVtk в клетки по всему объему опухоли. Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются GCV—НSVtk-терапия и генная иммунотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSVtk, другую -клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интерлейкин-12 и другие) играют роль сигнала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена «самоубийства», взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. Этот подход к генной терапии рака был проверен экспериментально: в печень животных имплантировали клетки рака толстой кишки, раздельно трансдуцированные генами HSVtkодного из цитокинов. Введение ганцикловира останавливало рост опухоли в печени. Опухоль не возникала и при введении нетрансдуцированных опухолевых клеток в другие ткани такого животного. У контрольных животных в аналогичных условиях происходило развитие опухолей во всех местах введения нетрансдуци-рованных клеток рака толстой кишки. Несмотря на столь многообещающие результаты, прежде чем приступать к клиническим испытаниям терапии с использованием гена «самоубийства» или различных комбинаций генной терапии, необходимо установить, какие опухоли будут поддаваться такому лечению и не вызовет ли оно побочных эффектов. Лекарственные средства на основе олигонуклеотидовВ большинстве протоколов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания 504 ГЛАВА 21
человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические системы с использованием олигонуклеотидов. Небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «антигенным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, — «антисмысловым». Снизить уровень транскрипции и трансляции гена-мишени может также олигонуклеотид, который связывается с фактором транскрипции, контролирующим экспрессию специфического гена. Для предотвращения активации транскрипции специфических генов можно использовать и двухцепочечные олигонуклеотиды, присоединяющиеся к ДНК-связывающим белкам. Можно создать также синтетические молекулы ДНК, которые присоединяются к специфическим белкам-мишеням, исходно не являющимся ДНК-связывающими, и тем самым блокируют их функционирование. Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно модифицировать рибозимы — природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их. В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут «антисмысловые» последовательности и особенно — «антисмысловые» олигонуклеотиды. Синтез «антисмысловых» мРНК in vivo«Антисмысловая» РНК, которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, должна связываться с определенной мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис. 21.13). Для получения таких РНК использовали экспрессирующие векторы, несущие ДНК-вставки в такой ориентации, чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНК, В качестве примера можно привести эписомные экспрессирующие векторы, в которые встроены кДНК инсулиноподобного фактора роста l (IGF-1) или его рецептора Генная терапия 505
506 ГЛАВА 21 (IGF-IR), находящиеся в обратной ориентации под контролем металлотионеинового промотора, активируемого ZnSO4. IGF-l вырабатывается в избыточном количестве клетками злокачественной глиомы, наиболее распространенной опухоли головного мозга, a IGF-1R — клетками карциномы предстательной железы. Вектор, обусловливающий синтез «антисмысловой» мРНК IGF-1, трансфицировали в культуру клеток глиомы. Если ZnSO4 в культуральной среде отсутствовал, то гиперпродукция IGF-1 опухолью сохранялась, если же в среду добавляли ZnSO4, то она исчезала. В другом эксперименте изучали последствия введения крысам нетрансфицированных клеток глиомы и клеток, трансфицированных «антисмысловой» кДНК IGF-1. В первом случае опухоли развивались, а во втором — нет. Если клетки карциномы предстательной железы крыс, трансфицированные «антисмысловой» кДНК IGF-IR, вводили мышам, то у них образовывались лишь небольшие опухоли или не образовывались совсем. Если же им вводили нетрансфицированные или трансфицированные нормальной кДНК IGF-1R клетки, то развивались опухоли большого размера. По-видимому, в обоих случаях «антисмысловая» РНК гибридизуется с комплементарной ей мРНК и ингибирует трансляцию IGF-1 и IGF-1R, предотвращая пролиферацию опухолевых клеток. «Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средстваТерапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклеотидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15—20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5'- или 3'-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Олигодезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримиаиновые основания и дезоксирибозу (рис. 21.14). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфогруппу (рис. 21.14, Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК—ДНК-дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов — лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний. Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями (рис. 21.14, В и Г). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2'-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 1.14, Д и Е). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются. Проникновение «антисмысловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высоко- Генная терапия 507
эффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с сайтами связывания, специфичными для определенных клеток, то можно будет осуществлять адресную доставку олигонуклеотидов. Проведенные доклинические испытания показали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекарственными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарных и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 мес вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили «антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного цикла млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами. «Антисмыдовые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов, В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита. В принципе « антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклестидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств. 508 ГЛАВА 21 Олигонуклеотиды, связывающиеся с белками: антитромбиновый аптамерБлокировать экспрессию гена-мишени можно не только с помощью «антисмысловой» терапии, но и введением в клетку олигонуклеотида, связывающегося с фактором транскрипции или трансляции, однако этот подход пока недостаточно изучен. Далее, поскольку нуклеиновые кислоты способны связываться с белками, можно синтезировать такой олигонуклеотид (так называемый аптамер), который будет присоединяться к определенному белку, в норме не связанному ни с какими нуклеиновыми кислотами, и блокировать его функцию. Так, анти-тромбиновый аптамер может стать недорогим средством профилактики тромбообразования при различных хирургических вмешательствах. Для его получения использовали набор химически синтезированных олигонуклеотидов, состоящих из 18-нуклеотидных фланкирующих областей (праймеров) и центрального 60-нуклеотидного участка, где в каждом из 60 положений может находиться любой из четырех нуклеотидов. Теоретически такой набор содержит примерно 1,3 · 1036 (460) олигонуклеотидов с разной центральной последовательностью. Образец пропустили через колонку, содержащую связанные молекулы тромбина, присоединившиеся к тромбину олигонуклеотиды элюировали и повторно пропустили через колонку со связанным тромбином. Эту процедуру повторяли не менее трех раз. Конечный набор тромбиновых аптамеров амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали, после чего определили физические и биологические свойства каждого из них. Те аптамеры, которые обладали высокими сродством, специфичностью и антитромбиновой активностью, отбирали для более детального анализа. Таким образом был получен эффективный антитромбиновый аптамер, К сожалению, вследствие малого времени жизни in vivo его можно использовать только для временного ингибирования функции тромбина (например, при кардиопульмонарном шунтировании), а в тех случаях, когда необходимо длительное введение противосвертывающих веществ (например, при ангиопластике), он неприменим. Очевидно, что описанную процедуру идентификации аптамеров можно использовать и в случае других белков-мишеней. Рибозимы как лекарственные средстваРибозимы — это природные РНК, обладающие каталитической активностью (РНК-ферменты); их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплементарной РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а каталитический расщепляет ее в специфическом сайте. Модифицируя субстратсвязывающую последовательность, можно получить рибозим, специфичный в отношении определенной мРНК (рис. 21.15). Создание «терапевтического» рибозима — сложный процесс. Связано это с трудностью получения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. В одном из экспериментов синтезировали олигодезоксинуклеотид, который содержал каталитический домен (примерно 20 нуклеотидов), фланкированный гибридизующимися с мРНК-мишенью последовательностями (они же выступали в роли праймеров), амплифицировали его, встроили в эукариотический экспрессирующий вектор и трансфицировали полученной конструкцией клетки. Образовавшийся после транскрипции рибозим расщеплял мРНК-ми-
Генная терапия 509 шень и подавлял трансляцию белка, ответственного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций. Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезированы олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их получения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития. Коррекция генетических дефектов с помощью олигонуклеотидовМногие генетические дефекты можно скорректировать, заменив связанную с данным дефектом пару нуклеотидов в мутантном гене на «правильную» пару. В одном из экспериментов для этой цели использовался 68-членный химерный (ДНК-РНК) олигонуклеотид, который образует шпильку с двумя головками и содержит метилированный кислород при 2'-углерод-ном атоме рибозы (рис. 21.16). Выбор такого необычного олигонуклеотида основывается на следующих экспериментальных данных: 1) ге-теродуплексы РНК-ДНК легче, чем двухцепочечные ДНК, спариваются с гомологичными нуклеиновыми последовательностями; 2) го- ловки шпилек, не участвующие в спаривании, защищают олигонуклеотид от экзонуклеаз; 3) 2'-О-метилирование предотвращает разрушение молекулы РНКазой Н. Важно и расположение нуклеотидов в химерной молекуле: десять рибонуклеотидов фланкируют пять центральных дезоксирибонуклеотидов, причем этот сегмент имеет одинаковую с мишенью последовательность и содержит нормальную пару нуклеотидов. Возможность коррекции мутаций с помощью химерных олигонуклеотидов изучали с использованием как кДНК, входящей в состав плазмиды, так и хромосомной ДНК. В обоих случаях мутантный сайт с высокой частотой заменялся нормальным. Но для того чтобы химерные олигонуклеотиды стали эффективными лекарственными средствами, необходимы дополнительные исследования. Если мутация в интроне распознается системой процессинга РНК как аутентичный сайт сплайсинга, то в процессированную мРНК включается часть интрона (рис. 21.17, А). Это приводит к сдвигу рамки считывания и образованию укороченного белка. При этом количество нормального белка снижается, что может стать причиной заболевания. Разумно предположить, что если «антисмысловой» олигонуклеотид, комплементарный мутантному интрону, гибридизуется с ним, то ошибочный сплайсинг блокируется, что повысит вероятность сплайсинга в нормальном сайте. Это предположение проверили на ß-глобиновом гене с мутацией во
510 ГЛАВА 21
втором интроне (рис. 21.17, Б), обусловливающей одну из форм ß-талассемии, наследственного заболевания крови, которое приводит к разрушению эритроцитов (анемии). В клетки, гомозиготные по мутантному гену (1VS2-654), ввели содержащий тиофосфатные связи «антисмысловой» 2'-О-метилолигонуклеотид, комплементарный мутантному сайту сплайсинга. В результате число нормальных ß-глобиновых цепей увеличилось на 50%. Дальнейшие исследования покажут, является ли этот подход достаточно эффективным для лечения талассемии и других состояний, вызванных подобными мутациями. ЗАКЛЮЧЕНИЕДля многих наследственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов (часто в виде кДНК) были предприняты попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ex vivo и генная терапия in vivo. При генной терапии ex vivo «терапевтический» ген переносят в изолированные клетки больного с помощью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению «терапевтического» генного продукта. При генной терапии in vivo «терапевтический» ген вводят непосредственно в клетки ткани-мишени больного. Для этого разработаны разные системы доставки: вирусные (ретрови- Генная терапия 511 русные, аденовирусные, аденоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса) и невирусные (инъекция чистой ДНК, бомбардировка ткани-мишени частицами, конъюгированными с ДНК, захват клетками ДНК, заключенной в липидную оболочку). Кроме того, разработаны вирусные и невирусные системы доставки генов, специфичные для определенных клеток. Весьма перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. При этом наиболее широко используется подход, включающий последовательное введение в опухолевые клетки гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и ганциклови-ра. В результате образуется ганцикловиртрифосфат, токсичный для быстроделящихся клеток. Погибают и нетрансформированные клетки, контактирующие с HSVtk-модифицированными клетками («эффект свидетеля»). В качестве лекарственных средств можно использовать не только генные продукты, но и олигонуклеотиды. С помощью так называемых «антисмысловых» олигонуклеотидов можно подавить полностью или частично экспрессию гена того или иного наследственного заболевания. В одном из вариантов такой терапии клонированный ген встраивают в экспрессирующий вектор в обратной ориентации, в результате чего образуется комплементарный нормальной мРНК ДНК-транскрипт, который спаривается с ней и ингибирует трансляцию. В более распространенном варианте введенный в клетку-мишень «антисмысловой» олигонуклеотид гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов и время их жизни повышаются в результате модификаций, затрагивающих фосфодиэфирную связь, пиримилины и остатки Сахаров. В настоящее время изучается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифицированных с помощью генной инженерии рибозимов, расщепляющих специфические мРНК; аптамеров, которые связываются со специфическими белками и блокируют их функции; олигонуклеотидов, с помощью которых можно корректировать замену одной нуклеотидной пары и мутации, приводящие к неправильному сплайсингу. ЛИТЕРАТУРАAgrawal S. (ed.) 1996. Anlisense Therapeutics. Humana Press Inc., Totowa, N. J. Altmail S. 1993. RN A enzyme-directed gene therapy. Proc. Nat/. Acad. Sei. USA 90: 10898-10900. Anderson W. F. 1992. Human gene therapy. Science 256: 808-813. Blaese R. M., K. W. Culver, A. D. Miller, C. S. Carter, T. Fleisher, M. Clerici, G. Shearer, L. Chang, Y. Chiang, P. Tolstnshcv, J. J. GreenMatt, S. A. Rosenberg, 11. Klein, M. Berger, С. A. Mullen, W. J. Ramsey, L. Muul, R. A. Morgan, W. F. Anderson. 1995. Т lymphocyte-directed gene therapy for ADA" SCID: initial trial results after 4 years. Science 27«: 475- 480. Bordignon C., L. D. Nntarangelo, N. Nobili, (т. Ferrari, G. Casorati, I1. Panina, F. Mazznlari, D. Maggioni, C. Rossi, P. Servida, A. G. Lgazio, F. Mavilio. 1995. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA immunodeficient patients. Science 270:470—475. Breaker R. R. 1997. DNA enzymes. Nat. Biatechnol 15:427-431. Burfeind P., C. L. Chernicky, F. Rininsland, J. Han, J. Han. 1996. Antisense RNA to the type I insulin-like growth factor receptor suppresses tumor growth and prevents invasion by rat prostate cancer cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7263-7268. Caplen N. J., E. W. F. W. Alton, P. G. Middlelnn, J. R. Dorin, B. J. Stevenson, X. Gao, S. R. Durham, K. Jeffery, M. F. Hndson, C. Coutelle, L. Huang, D. J. Porteus, R. Williamson, D. M. Geddes. 1995. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibro&ih. Nat. Med. 1: 39-46. Cole-Strauss A., K. Yoon, Y. Xiang, B. C. Bryne, M. C. Rice, J. Gryn, W. K. Hollouian, E. B. Kmiec. 1996. Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA-DNA oligonu-cleotide. Science 273: 1386-1389. Cornetta K., R. A. Morgan, W. F. Anderson. 1991. Safety issues related to retroviral-mediated gene transfer in humans. Hum. Gerte Ther. 2: 5—14. Crystal R. G. 1995. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success. Science 270: 404-410. 512 ГЛАВА 21 Culver K. W., F. W. Anderson, R. M. Blaese. 1991. Lymphocyte gene therapy. Hum. Gene Ther. 2i 107-109. Culver K. W., Z. Ram, S. Wallbridge, H. Ishii, E. H. Oldficld, R. M. Blaese. 1992. In vivotrans-ver with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256: 1550-1552. Ellington A. D., R. Conrad. 1995. Aptamers as potential nucleic acid pharmaceutical«. Biotechnol. Annu. Rev. 1: 185-214. Emerich D. F., S. R. Winn, P. M. Hantraye, M. Peschanski, E.-Y. Chen, Y. Chu, P. M с Demon, E. E. Baetge, J. H. Kordower. l'J'J?. Protective effect of encapsulated cells producing neurotrophic factor CNTF in a monkey model of Huntington's disease. Nature 386: 3[J5-3[J[J. Fender P., R. W. H. Ruigrok, E. Gout, S. Buffet, J. Chroboczek. 1997. Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat. Biotechnol. 15: 52-56. flotte T. R., В. J. Carter. 1995. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. Gene Ther. 2: 357-362. Grossman M., S. E. Kaper, K. Kozarsky, E. A. Stein, J. F. Engelhardt, D. Muller, P. J. Lupien, J. M. Wilson. 1994. Successful ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolaemia. Net. Genet. 6: 335-341. Harrington J. J., G. V. Bnkkelen, R. W. Mays, K. Gustashaw, H. F. Willard. 1997. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. Nat. Genet. 15: 345-355. Ishii-Morita H., R. Agbaria, C. A. Mullen, H. Hirano, D. A. Koeplin, 7. Kam, E. H. OMfieW, D. G. Johns, R. M. Blaese. 1997. Mechanism of 'bystander effect' killing in the herpes simplex thymidine kinase gene therapy model of cancer treatment. Gene Ther. 4: 244-251. Jiao S., P. Williams, R. K. Berg. B. A. Hodgeman, L. Liu, G. Repetto, J. A. Wolff. 1992. Direct gene transfer into nonhuman primate myofibres in vivo. Hum. Gene Ther. 3: 21-33. Kochanek S., P. R. Clemens, K. Mitani, H.-H. Chen, S. Chan, C. T. Caskey. 1996. A new adenoviral vector: replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and ß-galactosidase. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93: 5731-5736. Koeberl D. D., I. E. Alexander, C. L. Haibert, D. W. Russell, A. D. Miller. 1997. Persistent expression of human clotting factor IX from mouse liver after intravenous injection of adeno-associated virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sei. VSA94: 1426-1431. Lanza R. P., J. L. Hayes, W. L. Chick. 1996. Encapsulated cell technology. Nat. Biotechnol. 14: 1107-1111. Leib D. A., P. D. Olivo. 1993. Gene delivery to neurons: is herpes simplex virus the right tool for the job? BioEssays 15: 547-554. Lewis J. G., K.-Y. Lin, A. Knthavale, W. M. Flangan, M. D. Matteucci, R. B. De Prince, R. A. Mook, Jr., R. W. Hendren, R. W. Wagner. 1996. A serum-resistant cytofectin for cellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides and plasmid DNA. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93: 3176-3181. Lyon J-, P. Corner. 1995. Altered Fates: Gene Therapy and the Retooling of Human Life. W. W. Norton & Company, Inc., New York, N.Y. Michael S. L, D. T. Curiel. 1994. Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor-mediated endocytosis pathway. Gene Ther. 1: 223-232. Miller A. D. 1992. Human gene therapy comes of age. Nature 357: 455-460. Mulligan R. C. 1993. The basic science of gene therapy. Science 260: 926-932. Pochon N. A.-M., B. Heyd, N. Déglon, J.-M. Joseph, A. D. Zürn, E. E. Baetge, J. P. Hamming, M. Goddard, M. Lysaght, F. Kaplan, A. C. Kato, M. Schluep, L. Hirt, F. Regli, F. Porchet, N. De Tribolet. 1996. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) using a polymer encapsulated xenogenic cell line engineered to secrete hCNTF, Hum. Gene Ther. 7: 851-860. Putnam D. A. 1996. Antisense strategies and therapeutic applications. Am. J. Health-Syst. Pharm. 53: 151-160. Santoro S. W., G. F. Joyce. 1997. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4262-4266. Генная терапия 513 Sierakowska H., M. J. Sambade, S. Agrawal, R. Kole* 1996. Repair of thalassemic human-ß-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 12840-12844. Sun W. H., J. K. Burkholder, J. Sun, J. Culp, J. Turner, X. G. Lu, T. D. Pugh, W. B. Ershler, N.-S. Yang. 1995. In vivo cytokine gene transfer by gene gun reduces tumor growth in mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 2889-2893. Tone T., M. Kashani-Sabet, T. Funato, T. Shitara, E. Yoshida, В. I. Kashfian, M. Horng, O. Fodstadt, K. J. Scanion. 1993. Suppression of EJ cells tumorigenicity. In Vivo 7:471—476. Trojan J., B. K. Blosscy, T. R. Johnson, S. D. Rudin, M. Tjkocinski, J. Dan, J. Dan. 1992. Loss of tumorigenicity of rat glioblastoma directed by episome-based antisense cDNA transcription of insulin-like growth factor 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4874-4878. Wagner R. W. 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature 372: 333—335. Yoon K., A. Cole-Strauss, Б. B. Kmiec. 1996. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA-DNA oligonucleotide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:2071-2076. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ1. Что такое генная терапия ex vivo? 2. Опишите использование неаутологичных клеток, модифицированных с помощью генной инженерии, для генной терапии ex vivo. Почему этот подход представляется весьма перспективным? 3. Что такое генная терапия in vivo? 4. Опишите подробно по крайней мере две вирусные системы адресной доставки генов. 5. Опишите подробно по крайней мере три невирусные системы доставки генов. 6. Что такое терапия с использованием «антисмысловых» олигонуклеотидов? 7. С помощью каких модификаций можно увеличить время жизни и повысить эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов как лекарственных средств? 8. Опишите способ лечения злокачественных новообразований с помощью гена HSVtk. 9. Как нужно модифицировать рибозим, чтобы его можно было использовать в качестве лекарственного средства? 10. Как выделяют «терапевтический» аптамер? В чем преимущества аптамеров перед другими видами лекарственных средств? ЧАСТЬ IV. |
