Курсач (3). Характеристика рНметрії у виробництві кормового хлортетрацикліну
 Скачать 0.9 Mb.
|
|
МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ Національний авіаційний університет Факультет екологічної безпеки інженерії та технологій Кафедра біотехнології Курсова робота Із дисципліни: «Методи аналізу біотехнологічних виробництв» На тему: «Характеристика рН-метрії у виробництві кормового хлортетрацикліну» Виконала: студентка ІІ курсу 202-ї групи Кускова Валерія Віталіївна Перевірив: кандидат технічних наук, доцент Косоголова Л. О. Київ-2019 ЗМІСТ ВСТУП……………………………………………………………………… 3 РОЗДІЛ 1. ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ОДЕРЖАННЯ ХЛОРТЕТРАЦИКЛІНУ………………………………….. 5 Характеристика продуцента Streptomyces aureofaciens………… 6 Підготовка і стерилізація поживного середовища…………….. 7 Підготовка посівного матеріала………………………………… 9 Основний процес ферментації………………………………….. 11 Аерація культуральної рідини у стерильних умовах... 14 Регулювання параметрів процесу біосинтезу………... 15 Регулювання рівня піни………………………………... 18 Обробка, сушіння та фасування………………………………… 19 РОЗДІЛ 2. МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ рН…………………………………. 20 2.1 Електрометричний метод визначення………………………….. 20 2.2 Визначення рівня рН за допомогою рН-метра ЛПУ-01………. 25 2.3 Колориметричний метод визначення рН………………………. 28 2.4 Визначення рН за допомогою індикаторних папірців………… 29 РОЗДІЛ 3. ЗАСТОСУВАННЯ МЕТОДУ РН – МЕТРІЇ НА РІЗНИХ СТАДІЯХ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ОДЕРЖАННЯ ХЛОРТЕТРАЦИКЛІНУ. 31 ВИСНОВКИ………………………………………………………………….. 33 СПИСОВ ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ……………………………….. 34 ДОДАТКИ…………………………………………………………………….. 36 ВСТУП Актуальність теми. Антибіотики — продукти життєдіяльності (або їхні синтетичні аналоги і гомологи) живих клітин (бактеріальних, грибкових, рослинного і тваринного походження), які вибірково пригнічують функціонування інших клітин — мікроорганізмів, пухлин. Ця група включає сотні препаратів різної хімічної структури, що вирізняються спектром і механізмом дії, побічними ефектами і показаннями до застосування. Антибіотики знайшли широке застосування в наукових дослідженнях в якості речовин, що використовуються при вивченні окремих сторін метаболізма організмів, розшифровки тонких молекулярних механізмів біосинтеза білка, механізму функціонування мембран та інших біохімічних перетворень як специфічні інгібітори визначених реакцій. Наприклад, одні антибіотики специфічно інгібують окремі етапи синтезу білка на рибосомах , інші - синтез на різних рівнях нуклеїнових кислот, треті утворення клітинних стінок. Вивчення шляхів отримання антибіотиків сприяє глибокому проникненню в механізми синтетичної діяльності продуцентів цих біологічно активних сполук, розкриття основних етапів їх метаболізму. Тетрацикліни — одна з найбільш застосовуваних груп бактеріостатичних антибіотиків широкого спектра дії. В основі хімічної структури — ядро октагідронафтацену. Хлортетрациклін був першим із виділених тетрациклінів. Тетрациклінові антибіотики являють собою амфотерні з’єднання , здатні утворювати солі як із кислотами так і з лугами. Вони погано розчинні у воді і водних розчинах при рН 4,5-7,5. При рН нижче 2,0 і вище 8,0 можна приготувати водні розчини високої концентрації. Хлортетрациклін нестійкий до дії окислювача, в тому числі кисню. Характерною особливістю є здібність флуоресціювати при УФ-світлі, це дозволяє застосовувати його в аналітичних цілях. Метою роботи є дослідити технологічний процес виробництва кормового хлортетрацикліну та дати характеристику рН метрії у цьому виробництві. Завданнями роботи є: Дослідити технологічний процес одержання кормового хлортетрацикліну; Охарактеризувати будову рН – метра та принцип його дії; Дати характеристику використання методу рН – метрії у виробництві хлортетрацикліну. Об’єкт дослідження- характеристика рН – метрії при виробництві хлортетрацикліну. Предмет дослідження - технологічний процес одержання хлортетрацикліну. РОЗДІЛ 1 ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ОДЕРЖАННЯ ХЛОРТЕТРАЦИКЛІНУ Технологічний процес одержання хлортетрацикліну (додаток 1, рис.1.1) полягає у тому, що для цього використовують споровий матеріал недосконалого гриба Streptomyces aureofaciens. Виробництво відбувається шляхом глибинного культивування продуцента Streptomyces aureofaciens в стерильних умовах. Воно включає вирощування посівного матеріалу на поживному середовищі, приготування ферментаційного середовища, внесення посівного матеріалу в ферментаційне середовище для вирощування промислової культури, підлужування культуральної рідини, фільтрацію з відокремленням міцеліальної маси і її сушіння. Детальну схему стадій технологічного процесу одержання кормового хлортетрацикліну наведено у таблиці1.1.
Таблиця 1.1 Стадії одержання хлортетрацикліну 1.1 Характеристика продуцента Streptomyces aureofaciens У 1948 р з грунтів штату Міссурі Б. Дуггар виділив новий вид стрептоміцетів - Streptomyces aureofaciens, який утворює антибіотик ауреоміцин. Своє найменування Ауреоміцин отримав за видовим назвою продуцента цього антибіотика і золотистої забарвленням кристалічного продукту. Потім цьому антибіотику, виходячи з його хімічної будови, було дано загальноприйняту назву - хлортетрациклін. У промисловості хлортетрациклін випускається під назвами «біоміцин», «ауреоміцин», «дуоміцин». S. aureofaciens - аеробний мікроорганізм, добре розвивається при температурі 26-28 ° С як на твердих (щільних), так і в рідких середовищах. Крім хлортетрациклина цей організм в значній кількості (до 0,5-0, 7 мкг / мл) утворює вітамін 12, тетрациклін, а також деякі інші антибіотичні речовини. Для виробництва хлортетрацикліну використовують споровий матеріал S. Aureofaciens , який одержують із його міцелію. На рисунку 1.1 наведено електронну мікрофотографію міцелію S. Aureofaciens , з якого виготовляють кормовий антибіотик хлортетрациклін.  Рис. 1.1 Мікрофотографія міцелію Streptomyces aureofaciens 1.2Підготовка і стерилізація поживного середовища Стадія підготовки поживного середовища та його стерилізація відіграють дуже важливу роль при виробництві хлортетрацикліну, хоча і не є головною. Щоб отримати бажаний результат потрібно правильно підібрати склад поживного середовища та створити оптимальні умови для вирощування продуцента. Streptomyces aureofaciens в якості джерела енергії може використовувати різні вуглеводи, однак для промислового виробництва цікаві лише сахароза, крохмаль і глюкоза. Максимальний вихід антибіотика достигають у результаті обмеження неорганічного азоту у середовищі і заміною його складними речовинами біологічного походження(борошно олійного насіння, арахісом, ядром кокосового горіха). Поживне середовище для виробництва кормового хлортетрацикліну повинно складатися із таких компонентів: крохмаль, сахароза, мука із олійного насіння, м’ясні відходи, кукурудзяний екстракт, амонієві солі, вапно, поварена сіль. Також у середовищі необхідна присутність катіонів мікроелементів( Со, Сu, Zn, Mn, Fe). Відсоткові співвідношення компонентів для приготування поживного середовища наведено у таблиці 1.2 Таблиця 1.2
Для того, щоб у середовище не попали інші небажані мікроорганізми, необхідно стерелізувати поживні середовища. У біотехнології найбільшого поширення набула термічна стерилізація. В технічних системах, що працюють в асептичних умовах, повинна забезпечуватися стерилізація всіх точок внутрішніх об’ємів апаратів, комунікацій, арматури, контрольно-вимірювальних приладів, які безпосередньо стикаються з чистими культурами цільових мікроорганізмів або зі стерильними матеріальними потоками. Для цього в кожній точці необхідно створити необхідну температуру і підтримувати її на протязі заданого проміжку часу. Найбільшим бактерицидний ефект має насичена водяна пара під тиском. При стерилізації насиченою водяною парою спори найбільш стійких термофілів гинуть при температурі 121° C і часу експозиції 25 хв, при 132° С-за 4 хв. При використанні сухого пару час загибелі спор становить при 160° С - 60 хв., а при 180° С - 10 хв. Інактивація спор в киплячій воді при 100 ° С відбувається повільно, вони гинуть через 8-9 годин. Велике значення має вміст води в клітині мікроорганізму - чим більше води, тим нижче температура коагуляції білків. Саме цим пояснюється високий стерилізуючий ефект насиченої водяної пари - він не тільки нагріває, а й зволожує клітини, що підвищує їх термостійкість. Стерилізацію поживних середовищ при роботі з невеликими обсягами потрібно вести в періодичному режимі в кілька етапів: стерилізація всіх комунікацій і ферментера гострим або глухим паром; наповнення апарату прогрітим гомогенезируючим середовищем; нагрівання живильного середовища до температури стерилізації; витримування при температурі стерилізації протягом часу, необхідного для загибелі всіх мікроорганізмів; охолодження стерильного живильного середовища в цій же ємності. Цей спосіб стерилізації тривалий, і тому, щоб уникнути суттєвих змін в складі середовища, процес ведуть при надмірному тиску 0,5-1 атм при температурі 110-120° C протягом 1-1,5 годин з моменту досягнення заданої температури. Особливу увагу слід приділяти стерилізації апаратури і комунікацій, призначених для подачі піногасника (125-135° С протягом 1,5-2 годин). Стерилізацію здійснюють в наступній послідовності: вхідний і вихідний фільтри тонкого очищення, трубопроводи, арматура; ферментери; живильне середовище при наступних режимах: температура - 120-124° C, час витримки після досягнення заданої температури – 40-60 хвилин. 1.3Підготовка посівного матеріалу У біотехнологічних виробництвах, де відбувається посів на стерильні поживні середовища, дуже важливо правильно підготувати посівний матеріал. Це роблять для того, щоб одержана при вирощуванні культура була чистою і щоб з нею можна було виділити потрібний нам матеріал. Посівний матеріал готують із пророщих спор продуцента Streptomyces aureofaciens. В умовах глибинного вирощування культури актиноміцетів розмножуються вегетативно, тобто частинами міцелію, шляхом відділення частин гіфів, у вигляді коротких ниток, паличок. На твердих поживних середовищах актиноміцети утворюють колонії міцелія, на поверхні яких потім розвиваються спорангії, які містять овальні або циліндричні спори. В якості посівного матеріалу використовують спори, які при температурі 2-6°C можна зберігати до трьох місяців. Для розмноження культури в колбах використовують більш просте середовище(борошно та 3% кукурудзяний екстракт). Процес відбувається при рН 6,7-6,8, температурі 28-30° C на протязі 24 30 годин.  Вегетативний міцелій Розмноження посівного матеріалу (отримання міцеліальної маси) проводять в дві генерації в колбах (на 750 мл з 200 мл живильного середовища) на качалці (160-180 об / хв) і в посівному апараті. Тривалість кожної генерації 2-3 доби, температура вирощування 26-28 ° С(рис.1.2).          Посівний апарат із посівною культурою V=3.2-5 м3 Повітря Інокулятор із мішалкою V=1000 л Спори Повітря Маточна культура Качалка Споровий матеріал ІІ генерації Музейна культура(спори)  Рис.1.2 Схема підготовки посівного матеріалу для одержання кормового хлортетрацикліну Міцеліальна маса, отримана після другої генерації, служить для засіву живильного середовища посівних апаратів з розрахунку 600-800 мл на 1 м3. Далі посівний матеріал розмножується в посівних апаратах (при постійній аерації, температури 26-28° С, протягом 45-50 год.) до кількості, рівного 10-12% робочого об'єму основного ферментатора. Підвищення якості та продуктивності культури досягається за рахунок оптимального складу поживного середовища для посівних апаратів та за- стосування більш ефективних піногасників, як беруть в меншій кількості. Так, застосування пропінолу або свинячого жиру набагато покращує процес піногасіння, що дає змогу ефективно засвоювати культурою кисень ,повітря. Це в свою чергу впливає на якість і швидкість росту культури в посівному апараті. Підбір оптимального складу ферментаційного середовища є головним фактором, який забезпечує високий рівень активності культуральної рідини. Запропонований склад ферментаційного середовища дозволяє підвищити активність культуральної рідини до 5300 - 5800мкг/см3, що приводить до збільшення об'єму препарату і економії сировини та допоміжних матеріалів. 1.4 Основний процес ферментації У біотехнологічному процесі одержання кормового хлортетрацикліну основним є процес ферментації. Ферментація (також зброджування) — це анаеробний метаболічний розпад молекул за допомогою мікроорганізмів. На рисунку 1.3 показано будову ферментатора із механічним перемішування.         Злив охолодженої води або конденсатора Продування стерильного повітря Інокуляція Злив Лопаті мішалки Нагрів-охолод.(рубашка) Нагрів-охолодження(спіраль) Вихід газу  Рис.1.3 Ферментатор із механічним перемішуванням Ферментацію здійснюють у ферментаторі із нержавіючої сталі, який містить механічну мішалку із лопатями. Протягом біосинтезу практично завжди спостерігається значне піноутворення, тому ступінь заповнення ферментерів рідко перевищує 50%, а в посівний і основний апарати передбачається періодична подача стерильного синтетичного піногасника. Процес вирощування клітин продуцента можливо проводити в широкому інтервалі значень рН, проте накопичення антибіотика залежно від використовуваного штаму-продуцента здійснюється в строго контрольованих умовах: при певних значеннях рН середовища, температурі і аерації. Повний час біосинтезу хлортетрацикліну при 26-28°С складає 100-120 год. У перший період спостерігається інтенсивне зростання міцелію, швидко споживаються джерела вуглецю, азоту і фосфору, потрібна підвищена аерація. Утворення антибіотика на цій стадії практично не відбувається. У культуральній рідині в невеликих кількостях накопичуються піровиноградна і оцтова кислоти, які надалі клітина використовує в біосинтезі тетрацикліну. У другому періоді спостерігається різке зниження швидкості росту клітин і споживання живильних речовин, накопичення піровиноградної і оцтової кислот не відбувається, здійснюється активний біосинтез антибіотика. Покращення асептики виробництва досягається за рахунок того, що посівний матеріал та ферментаційне середовище подають в ферментатор з ліній, які знаходяться нижче купола ферментатора, що дає змогу не інфікувати культуральну рідину в процесі росту промислової культури. Отриманий посівний матеріал передають на стадію основної ферментації в кількості 10-15% від об'єму середовища основних ферментерів. Технологічні параметри проведення процесу виробничої ферментації залишаються практично тими ж, що і на стадії культивування в посівному апараті. На всіх етапах культивування підтримуються строго асептичні умови. Перед поданням культуральної рідини на ферментацію її додатково нагрівають до 60°С. Це дає змогу скоротити час ферментації до 4-8 годин, а також знизити втрати активності. В процесі росту культури в ферментаторі може порушитись масообмін (змінюється густота, недостатньо повітря, розбалансування складу фе- рментаційного середовища). В результаті може знизитися рН культуральної рідини до значення 5,0 - 5,2 при нормі 5,7 - 6,0. При низькому значенні pH купьтуральна рідина стає рідкою, припиняється нагромадження антибіотика, її слід передати на фільтрацію. Згідно запропонованого способу, pH культура- льної рідини контролюють в процесі росту промислової культури, і стабілізують значення рH до 5,7- 6,0 шляхом внесення в ферментатор необхідної кількості крейди. Це дає змогу продовжувати процес бioсинтезу до кінця і досягти активності культуральної рідини до 5000мкг/см3. Культуральну рідину із ферментатора розсіваютъ на чашки Петрі з агаризованим середовищем. Чашки поміщають в термостат і вирощують на протязі 12-14 діб при температур 28°C. Відбирають чашки, на поверхні aгapy яких виросло 30 - 40 окремих колоній. Спори з поверхні кожної колонії переносять в пробірку з скошеним агаризованим середовищем. Пробірки поміщають в термостат на 12 - 14 діб і вирощують при температурі 28°С. Кожний моноізолят перевіряють на продуктивність шляхом ферментації культури в колбах з ферментаційним середовищем. Колби поміщають на качалки з обертами 240 - 260об/xв. Ферментацію ведуть на протязі 7- 8 діб при температурі 28°С. Визначають активність культуральної рідини однієї із колб і відбирають високоактивні моноізоляти. Активність моноізолятів досягає 11000мкг/см3. Високоактивні моноізоляти використовують для наробки робочих партій, які потім застосовують у виробництві. Оскільки основним етапом мікробіологічного виробництва антибіотиків є процес ферментації продуцента, який здійснює синтез цільового продукту, особливу увагу необхідно приділяти конструкції ферментаторів їх автоматизації і забезпечення надійності виробничого процесу. Ферментатори повинні бути оснащені електронними стійками, які автоматично управляють процесом ферментації в автоматичному режимі і контролювати такі технологічні параметри, як значення рН, рівень розчиненого кисню, тем- перату, тиск, число оборотів мішалки, рівень піни в апараті, витрату повітря, яке подається на аерацію. Також необхідно враховувати можливість послідовної передачі біологічного матеріалу з апаратів меншого обсягу в апарати більшого обсягу. Для забезпечення стерильних умов ферментації і захисту навколишнього середовища в складі ферментера повинні бути присутніми стерилізуючі фільтри тонкого очищення, наприклад, фірми РАLL або МILLIPORE (DURAPORE, MILIDISK), що забезпечують подачу в ферментер стерильного повітря і очищення відпрацьованого повітря, що викидається в атмосферу. | ||||||||||||||||||||||||||||