Аналитическая химия. Исследование отравлений отдельными лекарственными препаратами
 Скачать 3.31 Mb.
|
Химико-токсикологическое исследование отравлений отдельными лекарственными препаратамиПроизводные барбитуровой кислотыИспользуются в качестве седативно-снотворных, противоэпилептических и средств для наркоза, для усиления действия нейролептиков, антидепрессантов и других психофармакологических ЛС. Депрессанты ЦНС. Взаимодействуют со специфическим участком ГАМК-барбитуро-бензодиазепининовых рецепторов, повышают чувствительность ГАМК-рецепторов к ГАМК и тормозят нейрональную передачу в различных отделах ЦНС, оказывая неселективное угнетающее действие. В высоких концентрациях влияют на ток Na+ и Са2+ через мембрану. Противосудорожный эффект обусловлен влиянием на потенциал-зависимые натриевые каналы, подавлением активности глутамата и др. Снижают возбудимость эпилептоидного очага. Обладают прямым угнетающим действием на дыхательный центр (снижают чувствительность к углекислому газу) Структура токсикологически значимых барбитуратов
Токсикокинетические параметры барбитуратов
Схема метаболизма фенобарбиталаСхема метаболизма этаминала натрияСхемы метаболизма барбамила и циклобарбиталаТерапевтические , токсические и летальные концентрации производных барбитуровой кислоты в крови
Токсикокинетические свойства барбитуратов
Выделение из биологических объектовТрупный материал: печень, почки, мозг, желудок с содержимым, кишечник – Изолирование подщелоченной водой – по методу Валова Изолирование из крови и мочи - эфиром (хлороформом) при значениях рН 2 - 4 Химико-токсикологическое исследование на барбитураты
Мурексидная проба С солями кобальта в спиртовом растворе щелочи С пиридином и солями меди ТСХ Подтверждающие: Микрокристаллические реакции: Кислотная форма барбитуратов, С Хлор-цинк-йод С дийодкупратом калия в растворе йода УФ-спектроскопия ГЖХ ВЭЖХ
ГЖХ, ВЭЖХ ТСХ барбитуратовОбщая система : Ацетон – хлороформ ( 1 : 9 ) Частные системы : Этилацетат-метанол-25% раствор аммиака (85:10:5) Изопропанол-хлороформ-25% раствор аммиака (9:9:2) Хлороформ – ацетон ( 8 : 2 ) бензол-этилацетат (2:1) Проявление : последовательно Раствор сульфата ртути в серной кислоте Раствор дифенилкарбазона в хлороформе ( или этаноле) Сине-фиолетовые пятна на сиреневатом фоне Чувствительность 1-5 мкг барбитуратов в пятне Принцип УФ-спектрофотометрии барбитуратовУФ-спектры барбитуратов при различных значениях рН среды и соответствующие им молекулярные структуры: А - неионизированная форма в 0,1М растворе НС1, Б - моно-анион в 0,05М боратном буфере (рН 9,2) ; В - ди-анион в 0,5 М растворе гидроксида натрия (рН 13) А Б В Количественное определение барбитуратов методом УФ-спектрометрииК 1 мл крови (плазмы, сыворотки) или 0,5 мл мочи добавляют 0,24 мл смеси насыщенного раствора щавелевой кислоты с 50% фосфорно-вольфрамовой кислоты (1:1), 2,5 г безводного сульфата натрия и экстрагируют хлороформом. Объединенные хлороформные экстракты промывают водой, затем добавляют 4 мл боратного буфера (рН13)и проводят экстракцию барбитуратов в водную фазу (в виде солей). После центрифугирования 3 мл водной фазы (боратный буфер) переносят в кювету с толщиной слоя 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 260 нм (DрН13), раствор сравнения – боратный буфер. Далее к обоим растворам прибавляют 2 капли конц. Соляной кислоты до рН10, и измеряют оптическую плотность (DрН10). Находят разность оптической плотности растворов при рН13 и рН10 ΔD и рассчитывают концентрацию (мкг/мл) по формуле С = ΔD*Kx / V, где V – объем пробы, Кх – приведенный коэффициент экстинкции, равный: для барбитала – 180, фенобарбитала – 200, барбамила – 255, этаминала натрия – 340, в среднем – 260. ГХ исследование барбитуратовКапиллярные колонки с неполярными фазами типа НР-1, НР-5 Изотерма 180С, 200С для барбитала, барбамила, нембутала, 230С для фенобарбитала, или программирование температуры колонки. Без дериватизации Дериватизация : метилирование в аминогруппе, для метаболитов – ацилирование или силилирование Детекторы : ПИД, азотно-фосфорный, МСД Подготовка пробы : в образец вводят равные количества 0,25 М серной кислоты и очищенного хлороформа, встряхивают, центрифугируют при 8000 об/мин. На анализ отбирают 1–5 мкл хлороформного извлечения. Для ГХ-МС – элюаты с ТСХ пластин. ВЭЖХ барбитуратовОбращенно-фазные колонки типа С8 или С18 Подвижная фаза: смесь ацетонитрил-дистиллированная вода (35:65) или 0,05 М водный двузамещенный фосфат аммония – метанол (60:40). Детектирование в УФ-свете при 220 нм или 240 нм. Подготовка пробы : осаждение белков 40% перхлоруксусной кислотой, центрифугирование и анализ депротеинизированной плазмы или экстракция хлороформом, смесью хлороформ-изопропанол или эфиром, упаривание и растворение в подвижной жидкой фазе Методы ГЖХ и ВЭЖХ с различными детектирующими системами используются как для идентификации конкретных барбитуратов, так и для их количественного определения. Время детектирования в моче барбитуратов короткого действия 24 часа, среднего действия (циклобарбитал, пентабарбитал) 48-72 часа, длительного действия ( фенобарбитал) – до 7 суток. Производные 1,4- бензодиазепина
*Вместо С = О в положении 2 стоит группа СН2; ** Вместо С = О в положении 2 стоит группа С-NH(CH3), в положении 4 стоит NO, двойная связь N(1) = C(2). Механизм терапевтического действия взаимодействие со специфическими бензодиазепиновыми рецепторами постсинаптических ГАМК-рецепторных комплексах. Повышают чувствительность этих рецепторов к ГАМК. В результате усиливается действие ГАМК и тормозится нейрональная передача в соответствующих отделах ЦНС. Анксиолитическая активность - способность купировать беспокойство, страх, напряжение. Антипаническое и амнестическое действие. Центральный миорелаксирующий эффект связан с торможением полисинаптических спинальных рефлексов. Противосудорожное действие Облегчают засыпание. В токсической дозе : психотропное, нейротоксическое действие, обусловленное торможением ЦНС, ослаблением процессов возбуждения подкорковых образований, вставочных нейронов спинного мозга и таламуса. Развиваются атаксия, нарушение ориентации и координации, Судороги, Угнетение сознания до комы, Угнетение дыхания, Тахикардия, Гипотония. Токсикокинетические параметры производных 1,4-бензодиазепина
Метаболизм диазепамаМетаболизм хлордиазэпоксида и оксазепамаМетаболизм нитразепамаМетаболизм гидазепамаТерапевтические, токсические и летальные концентрации бензодиазепинов в крови
Методы изолирования производных 1,4-бензодиазепинаПроявляют свойства как кислоты, так и основания, поэтому для выделения нативных бензодиазепинов из трупного материала используют общие методы изолирования, и ведут обнаружение как в кислых, так и в основных экстрактов Диагностика отравлений производными 1,4 -бензодиазепинаАнализ по двум направлениям : бензофенонам и по нативным веществам Первое направление обеспечивает оценку суммарного количества бензодиазепинов и метаболитов без разделения на индивидуальные вещества. Кислотный гидролиз биообъекта (6 н. НС1 при 140С в течение 60 мин), экстракция образующихся аминобензофенонов (рН = 6 – 8, гептаном) , анализ экстрактов хроматографическими методами. Схема кислотного гидролиза 1,4-бензодиазепиновI - 1,4-бензодиазепин ; II – промежуточный продукт ; III – аминобензофенон ; IV – аминохинолон ТСХ анализ бензодиазепинов
Гексан – метанол – ацетон (15:3:1); Бензол – ацетон – этанол (8:1:1); Гексан – ацетон (3:2); Бензол – изопропанол – 25% раствор аммиака (85:15:1). Обнаружение бензофенонов Собственная окраска Свечение в УФ – свете Реакция Браттона-Маршала. 0,1% раствор NaNO2, 0,5% раствор сульфамата аммония, 0,1% раствором N--нафтилэтилендиамина. Предел обнаружения 1 – 5 мкг в пятне. Обнаружение нативных соединений и метаболитов производных 1,4 бензодиазепинаРеактив Драгендорфа образует оранжевые или желто-оранжевые пятна, бурые; Подкисленный йодплатинат образует пятна темного цвета; FPN-реактив образует продукты окисления желтого цвета; Реактив Марки образует продукты желтого цвета; Эффективно проводить гидролиз на пластинке и обнаруживать по бензофенонам, при этом значения Rf будут соответствовать таковым для нативных веществ ГЖХ определение производных 1,4-бензодиазепинаНабивные колонки с неполярными или слабополярными фазами типа SE-30 или OV-17 или капиллярные колонки (25 м х0,25 мм) фаза типа НР 1, НР-5, толщина пленки 0,25 мкм. Температура колонки : 230С для феназепама 250С для нитразепама, программирование температуры 230 – 280 °С Детекторы : азотно-фосфорный, ЭЗД, МСД, ПИД. По нативным веществам – необходима дериватизация ГХ-МС проводят в элюатах с ТСХ-пластин по нативным соединениям или дериватам ВЭЖХ определение производных 1,4-бензодиазепинаВЭЖХ-анализ производных бензодиазепина по нативным веществам или продуктам гидролиза. Колонка с обращенно-фазным сорбентом типа С18. Подвижная фаза: Ацетонитрил – 0,05 М водный раствор двузамещенного фосфата аммония 35:65 (для нативных) 55:45 (для бензофенонов). Метанол – вода - 0,1М фосфатный буфер ( 55:25:20) рН 7,25. или (70:10:20), рН 7,67 Детектирование в УФ-свете при 240-220 нм. Количественное определение по внешнему стандарту Количественное определение производных бензодиазепина по продуктам гидролиза методом спектрофотометрииПринцип метода - колориметрия после кислотного гидролиза бензодиазепинов до аминобензофенонов по продуктам реакции образования азокрасителя. Концентрация расчитывается по калибровочному графику, Методика определения. К 10 мл мочи или 2 мл крови добавляют равный объем концентрированной соляной кислоты, гидролиз на глицериновой бане 125-130°С 30 мин или кипящей водяной бане – 1 час. Гидролизат охлаждают, подщелачивают раствором гидроксида натрия до рН = 8 – 9 и экстрагируют дважды хлороформом. Объединенный хлороформный экстракт упаривают в токе теплого воздха. Сухой остаток растворяют в 5 мл 2 н. НС1, добавляют 1 мл 0,1% раствора нитрита натрия, а через 5 минут – 0,5 мл 1% раствора сульфамата аммония (или насыщенного раствора мочевины). Раствор встряхивают до удаления пузырьков газа, добавляют 1 мл 0,1% раствора N-α-нафтилэтилендиаминдихлорида. Оптическую плотность измеряют через 15 минут на фотоколориметре с зеленым светофильтром, раствор сравнения – смесь реактивов для проведения реакции. Калибровочный график строят, измеряя оптическую плотность стандартных растворов бензодиазепина, после гидролиза и реакции Браттона-Маршала. Методы ГЖХ и ВЭЖХ с различными детектирующими системами используются как для идентификации конкретных производных бензодиазепина, так и для их количественного определения. Время детектирования в моче бензодиазепинов короткого действия ( триазолам) 24 часа, среднего действия (темазепам, хлордиазэпоксид) 40 – 80 суток, длительного действия ( диазепам, нитразепам) – до 7 суток. Нейролептики. Производные фенотиазина
Фармакокинетические свойства фенотиазинов
Метаболизм производных фенотиазина- N-деалкилирования - гидроксилгидроксилирование в положении 3- и 7-, и другие - N-окисление - образование конъюгатов путем конъюгирования с глюкуроновой и серной кислотами Терапевтические, токсические и летальные концентрации производных фенотиазина в крови
Изолирование фенотиазинов из трупного материалаМетод В.Ф. Крамаренко Метод Е.М. Соломатина: 100 г измельченного биоматериала настаивают 3 раза по 2 часа с этанолом, подкисленным щавелевой кислотой, рН 2-3. Спиртовые вытяжки упаривают на водяной бане до густоты сиропа. Примеси осаждают этанолом и фильтруют. Затем упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 100 мл воды (40-60◦). Охлаждают, фильтруют. Фильтрат подкисляют щавелевой кислотой до рН 2-3, экстракция эфиром, отбрасывают эфир. Водную фазу подщелачивают 50% NaOH до рН 13. Экстракция эфиром. Реэкстракция из эфира 0,5Н Н2SO4. Водные вытяжки объединяют , упаривают, подвергают анализу. Диагностика острых отравленийПредварительная проба в моче : FNP – реактив (смесь водных растворов хлорида железа (III), хлорной кислоты и азотной кислоты (1:9:10). окраска от розового до сине-фиолетового цвета свидетельствует о возможном присутствии фенотиазинов или их метаболитов. Ложные реакции – например, имипрамин (трициклический антидепрессант) дает зеленое окрашивание, сонопакс не дает окраски с FNP. Гидролиз (или анализируют без гидролиза) Извлечение из мочи при рН = 9 – 10 хлороформом Обнаружение фенотиазиновПредварительные пробы с FNP-реактивом Конц. H2SO4 – пурпурно-красная Конц. HNO3 – пурпурно-фиолетовая Конц. HCl – розовая, переходящая в красно-фиолетовую Реактив Марки – пурпурная Реактив Манделина – зеленая, переходящая в пурпурную Р-я Витали-Морена (для дипразина и тизерцина) ТСХ определение фенотиазиновСистемы: бензол – диоксан – 25% раствор аммиака (60:35:5) этилацетат – ацетон – 25% раствор аммиака (50:45:4), общие системы для веществ основного характера: толуол – ацетон – этанол – 25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) диоксан – хлороформ – ацетон – 25 % раствор аммиака (47,5:45:5:2,5). Для обнаружения фенотиазинов и их метаболитов : FPN-реактив образует пятна с окраской от розовой до сине-фиолетовой; 57% раствор хлорной кислоты, с тремя процентами 0,5% раствора нитрита натрия – пятна с окраской от розовой до зелено-голубой; Подкисленный йодплатинат дает окраску пятен от желтой до серо-зеленой; Спиртовой раствор конц.H2SO4 (9:1) - пятна различной окраски. Количественное определение производных фенотиазинаСпектрофотометрия продукта реакции производного фенотиазина с метилоранжем. Без предварительной очистки при отсутствии в биообъекте других веществ основного характера. При их наличии необходимы предварительное выделение и очистка (методом ТСХ) ГЖХ неполярная или слабополярная ЖФ типа НР-1, НР-5 Температура колонки изотерма 230С, или программирование от 130 до 290С, 20/мин, инжектора 250С. Детектор ДИП, азотнофосфорный, ТИД, МСД Очистка – ТСХ, дериватизация – ацетилирование ВЭЖХ – с УФ детектором 245 -260 нм Клозапин (азалептин, лепонекс)Период элиминации клозапина (Т1/2) от 10 до 105 ч, Характерна энтерогепатическая циркуляция. Связь с белками до 90 – 95%. Абсолютная биодоступность – 50–60%. Выведение в основном в виде метаболитов, примерно 50% с мочой и 30% с калом,. носит волнообразный характер. Концентрации (мкг/мл) в крови: терапевтические 0,06 – 0,6, токсические 0,5 – 1,3, летальные 1,2 – 13,0. Метаболизм клозапинаИдентификация клозапинаЭкстракция при рН = 8 – 9 хлороформом ТСХ в общих системах для веществ основного характера. Проявление: в УФ-свете –поглощает = черный на светлом фоне, капельно азотная кислота - оранжевое окрашивание ВЭЖХ, ГЖХ, ГХ-МС по общим схемам Масс-спектр клозапина: М 326(27%), 243(100%), 256(75%), 192(36%), 70 (30%). Определяется также N-дезметил-клозапин со спектром: М 312 (44%), 269 (22%), 256 (42%), 243 (100%), 192 (36%). Рекомендована дериватизация анализируемых компонентов. Определение клозапина в сыворотке крови больного с использованием ВЭЖХ-УФ (REMEDI) и GC-MS Chromatogram of the serum : 10 - clozapine, 8 - clozapine,N-desmetyl, 7 – clozapine metab.#2 Chromatogram of the same serum & mass-spectra of clozapine : 1 - clozapine, 2 - clozapine, N-desmetyl; Карбамазепин (финлепсин, тагретол)Биодоступность при пероральном приеме 60-85% Связь с белками плазмы 65-95% Т1/2 30-40 час, при хроническом приеме 8-17 час. Индуктор микросомального окисления Особенность - широкая вариабельность концентраций при лечебном приеме и близкие, порой перекрывающиеся, значения концентраций (мкг/мл): терапевтические 4,5-9,0, токсические 6,4–24,6 фатальные 19,0-67,4. Метаболизм карбамазепинаКачественный и количественный анализ карбамазепинаЭкстракция при рН 8-9. Обнаруживается во фракциях веществ кислого и основного характера. ТСХ в общих системах растворителей. Проявление по собственной флюоресценции - голубая, метаболиты – зеленовато-голубая, усиливающееся после обработки раствором серной кислоты - «северное сияние» ГЖХ с различными детектирующими системами ГХ-МС Масс-спектр: 193(100%), М 236(85%), 165(30%). ВЭЖХ ПФИА в сыворотке (по сумме с метаболитами) Антидепрессанты трициклические
Метаболизм амитриптилинаТерапевтические , токсические и летальные концентрации трициклических антидепрессантов в крови
Качественное исследование амитриптилинаТСХ. Экстракция из мочи при рН = 9 – 10 хлороформом или эфиром. Системы: этилацетат – ацетон – этанольный аммиак (50:45:5), бензол – диоксан – 25% раствор аммиак (60:35:5), бензол – ацетон (80:20) или других подобных. Проявление капельно концентрированной серной кислотой – оранжево-кирпичная окраска. Чувствительность 0,1 мкг в пятне. Иммуно-химические методы на ТАД (суммарно) Количетвенное определение амитриптилинаэкстракционно-фотометрический метод по комплексу с бромфеноловым синим после экстракционной и хроматографической очистки. Определяется сумма веществ. Чувствительность 1 мкг/мл (определение летальных, а не токсических концентраций ) ГЖХ с ДИП (свободные основания). ПрО 1 мкг/мл. Дериваты - трифторацетатные производные Чувствительность 0,2 мкг/мл. ГХ – ТИД и МСД чувствительность 0,01-0,05 мкг/мл даже при анализе свободных оснований. ПФИА и ИФА (суммарно с метаболитами) БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ |