Коллоквиум. Коллоквиум 2 Классификация патологических процессов с участием иммунной системы
 Скачать 98.22 Kb.
|
|
ИФА в иммунологии. Постановка и оценка. Иммуиоферментный анализ, или метод (ИФА) - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазной и или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики сальмонеллеза, микоплазмозов и др. В настоящее время используется огромное количество всевозможных разновидностей и модификаций ИФА. Широкое распространение получили разные варианты твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Твердофазный ИФА был предложен в 1971 году. Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компонентов иммунной -реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Основные принципы твердофазного ИФА, независимо от модификации, заключаются в следующем: 1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. 2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием. 3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности. ИФА успешно применяется для: • массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним); • выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах; • определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена; • выявления иммунных комплексов; • выявления онкомаркеров; • определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.); • определения общего IgE и специфических IgE антител; • скрининга моиоклональных антител; • определения цитокинов в биологических жидкостях. Иммуноэлектрофорез. Модификации и применение. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологи-ческих материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть и модификация метода заключается в следующем: - в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; - проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; - в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; - разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации. Иммуноблотинг. Модификации и применение. Иммуноблоттинг (иммуноблот) - высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РИГА или ИФА. Иммуноблоттинг - разновидность гетерогенного иммунного анализа. Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов -появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов. Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки. Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами. Применяется для выявления спектра антител к антигенным смесям Относится к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции. Радиоиммунный анализ. Применение. Радиоиммунный анализ (РИА) - метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела. В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для радиоиммунного анализа выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Спектр применения метода достаточно широкий, причем, часто именно он является «истиной в последней инстанции», поскольку без затруднений позволяет определить уровень содержания гормонов. Сегодня его используют для измерения концентрации самых разных гормонов: гормоны поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта, гипофиза, щитовидной железы , а также для измерения негормональных веществ: ферментов, опухолевых антигенов, белков сыворотки крови и др. Генетические методы исследований в иммунологии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - экспериментальный метод молекулярной биологии, который представляет собой специфическую амплификацию нуклеиновых кислот, индуцируемую синтетическими олигонуклеотидными праймерами in vitro. Суть метода. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК при помощи фермента Taq- ДНК-полимеразы. Полимеразная цепная реакция позволяет получить амплификаты длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Для увеличения длины ПЦР-продукта до 20-40 тыс. пар нуклеотидов применяют смесь различных полимераз, но все равно это значительно меньше длины хромосомной ДНК эукаротической клетки. Исследование экспрессии генов методом микрочипов Биологические микрочипы - один из новейших инструментов биологии и медицины. Прообразом современных микрочипов стал саузерн-блоттинг, изготовленный в 1975 г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке. Точнее всего биочипы описывает английское название «DNAmicroarrays», что означает «организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе-платформе». В качестве платформы используют пластинку из стекла, иногда и другие материалы, например кремний, различные гели. На платформу наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. В зависимости от того, какие макромолекулы используются и каковы цели исследования, выделяют различные виды биочипов: ДНК-микрочипы и белковые микрочипы. Получение мышей с нокаутом (knock-out) и нокином (knockin) генов -(т.е. удаления или добавления определенного гена или генов в геном организма) - это метод получения клеток или целых организмов (мышей), в которых целенаправленно разрушен определенный ген или встроен дополнительный ген. Для осуществления подобного необходимо иметь:
1) клонированный заданный ген; 2) два «методических» гена для селекции искомых клеток с удачно инактивированным геном и соответствующую селективную среду культивирования; 3) особую уникальную линию перевивных стволовых эмбриональных мышиных клеток - ES (embryonic stem cell line), сохраняющих способность дифференцироваться в надлежащих условиях во все типы клеток организма мыши, включая гаметы; 4) здоровых мышей и трудолюбие примерно на год упорной работы. Принципы иммунокорегирующая терапии. Иммунокорректоры – средства и воздействия (в том числе и лекарственные), обладающие иммунотропностью, которые нормализуют конкретное нарушенное то или иное звено иммунной системы (компоненты или субкомпоненты Т–клеточного иммунитета, В–клеточного иммунитета, фагоцитоза, комплемента). Таким образом, иммунокорректоры – это иммуномодуляторы «точечного» действия. Меры иммунокоррекции бывают специализированными (прямыми), т.е. направленными непосредственно на иммунную систему, либо неспециализированными. К последним относят нормализацию образа жизни, отказ от вредных привычек, стабилизацию психоэмоционального стояния. К этой же группе мер относят и процедуры закаливания, позволяющие усилить неспецифическую резистентность организма к разного вида воздействиям, включая стресс. В зависимости от используемых средств, иммунокоррекция может быть лекарственной, физиотерапевтической, климатической, физической (физические нагрузки увеличивают продукцию интерферонов). Максимальной эффективностью, безусловно, обладает лекарственная иммунокоррекция, тогда как другие виды её имеют преимущественно вспомогательное значение. Лекарственная иммунокоррекция проводится с помощью иммунотропных лекарственных препаратов, или иммунокорригирующих препаратов. Эти препараты имеют разное происхождение – растительное, бактериальное, животное, синтетическое. Кроме этого ряд иммунокорригирующих препаратов изготавливают с применением генноинженерных методов и гибридомной технологии. В зависимости от направленности выделяют следующие виды иммунокоррекции: 1) заместительную; 2) иммуносупрессирующую (иммунодепрессантную); 3) иммуностимулирующую. Принципы иммунокоррекции основываются на этиологии и патогенезе заболевания и включают в себя проведение диагностики и использование по показаниям методов детоксикации, заместительной иммунотерапии, иммунокоррекции и программной иммунореабилитации под контролем показателей иммунитета в динамике. Также важно проводить лечение осложнений и сопутствующих заболеваний. Иммуностимулирующая терапия. Иммуностимуляторы - препараты, преимущественно усиливающие иммунитет, доводя пониженные показатели до нормальных значений. Иммуностимулирующая терапия предназначена для стимуляции функций иммунной системы при вторичных иммунодефицитах различной этиологии и степени выраженности, а также при самых различных заболеваниях, в патогенез которых вовлечена иммунная система. Как правило, иммуностимулирующая/иммуномодулирующая терапия не проводится при декомпенсированных иммунодефицитах. Часто используют комплексную классификацию, учитывающую как происхождение препаратов, так и их преимущественную направленность действия: - препараты растительного происхождения, оптимизирующие взаимодействие гомеостатических систем организма (настойки элеутерококаа, солодки и др.); - препараты микробного происхождения: а) мини-вакцины – содержат рибосомные фракции, антигены клеточной стенки микроорганизмов или лизаты микробов и способны усиливать развитие антигенспецифического иммунитета при длительном (до 6 мес.) применении (бронхомунал, рибомунил, ИРС-19, имудон – для профилактики и лечения частых респираторных инфекций; уросолковакс, трихосолковакс – для профилактики и терапии урогенитальных инфекций); б) вакцины – БЦЖ, помимо основного эффекта – создания иммунитета к возбудителям туберкулёза, стимулирует развитие клеточных реакций иммунной системы, что используется в терапии некоторых видов рака; в) препараты-пробиотики (лактобактерин, бифидумбактерин, колибактерин, линекс, бактисубтил, биофлор и др.) нормализуют аутомикрофлору кишечника, защищая слизистые оболочки от внедрения патогенных видов, стимулируют иммунную систему слизистых оболочек ЖКТ по принципу «тренировки» антигенной нагрузкой, не обладающей патогенностью; г) препараты клеточной стенки бактерии (Pseudomonas aeruginosa) – пирогенал, продигиозан. При введении в организм стимулируют фагоцитарную и цитокинпродуцирующую активность макрофагов, активируют воспаление, что используется для лечение латентно протекающих инфекций; д) препараты синтетического происхождения – аналоги или производные клеточной стенки бактерий (ликопид). В низких дозах стимулируют функциональную активность макрофагов и натуральных киллеров, в высоких – снижают цитокинпродуцирующую активность этих клеток, что используется в терапии аутоиммунных заболеваний. - препараты тимуса - оптимизируют функцию Т-лимфоцитов и связанные с ними функционально реакции иммунитета; - препараты селезёнки (спленин, диасплен), крови (плазмол, солкосерил, актовегин, диавитол и др) оптимизируют функцию эффекторных популяций лимфоцитов, а также способствуют регенерации тканей; - препарат костного мозга (миелопид) усиливает функцию В-лимфоцитов; - препараты синтетического происхождения – низкомолекулярные индукторы эндогенных интерферонов – неовир, циклоферон, амиксин и др. - синтетические препараты, обладающие разнообразными эффектами стимуляции иммунной системы (полиоксидоний, диуцифон, декарис и т.д.). Вакцинация. Вакцинация - целенаправленное введение в организм человека заданного антигена в неагрессивной форме и неагрессивных, но иммуногенных дозах с целью индукции защитного иммунного ответа и формирования иммунологической памяти для профилактики реального инфекционного заболевания в будущем. Ниже рассмотрены некоторые моменты, требующие внимания врача. Иммуногенность вакцинного препарата зависит от ряда параметров как собственно препарата, так и способа его введения в организм. Доза: для каждого антигена нужно подбирать конкретные оптимальные дозы. Очень низкие и очень высокие дозы менее иммуногенны, чем средние. Что такое «очень» в весовых единицах, зависит от конкретного препарата. Путь введения в организм: наиболее интенсивен иммунный ответ при подкожном введении препарата, менее - при внутрибрюшинном (в эксперименте), ещё менее - при внутривенном и приёме внутрь. Агрегатное состояние препарата: корпускулярные и денатурированные формы более иммуногенны, чем растворимые и нативные. Адъюванты: медленное высвобождение иммуногена из комплекса с адъювантом способствует более сильному иммунному ответу, чем быстрое рассасывание иммуногена из очага. Адъюванты, содержащие бактериальные вещества, как правило, существенно более эффективны, чем адъюванты, не имеющие отношения к бактериальным продуктам. Живые вакцины. Другая проблема скрыта в применении живых аттенуированных (т.е. ослабленных - in vitro или на животных) вакцин. Дело в том, что аттенуированный в лабораториях, но живой патоген при попадании в человеческую популяцию продолжает эволюционировать с возрастанием патогенности. Отсутствующие вакцины. Традиционными методами изготовления вакцинных препаратов пока не удалось получить протективных вакцин против многих инфекционных заболеваний (в частности, большинства венерических, паразитарных, многих вирусных). Кроме того, многие применяемые вакцинные препараты, помимо целевого антигена, содержат значительное количество примесей (иногда до 90%). Требования к вакцинам. Цель разработчиков вакцин - разумное решение проблем и создание вакцинирующих препаратов, удовлетворяющих необходимым критериям: • вакцина не должна быть источником побочной биологической опасности; • вакцина не должна индуцировать патогенные иммунные процессы (например, образование антител, повреждающих собственные ткани); • вакцина должна эффективно индуцировать протективный иммунитет; • если целью вакцинации, напротив, является подавление какого-либо нежелательного иммунного процесса в организме, то вакцинный препарат должен индуцировать антигенспецифическую иммунологическую толерантность (т.е. ареактивность или делецию клона лимфоцитов); • врач аллерголог-иммунолог должен иметь возможность контролировать формирование заданного иммунитета у человека с помощью лабораторных методов. Иммунодепрессивная терапия. Иммуносупрессирующая (иммунодепрессантная) терапия – это терапия, направленная на подавление функции иммунной системы. Этот эффект всегда сопровождается созданием иммунодефицита, т.е. существенным увеличением риска развития инфекционных и опухолевых процессов, поэтому иммунодепрессантная терапия имеет жёсткие рамки показаний, когда на первое место выходит задача – сохранение жизни. Таким абсолютным показанием для назначения иммунодепрессантной терапии является лишь одна ситуация - предотвращение отторжения трансплантата. Однако, иммунодепрессантная терапия нужна для коррекции многих других состояний - аутоиммунных заболеваний, лимфопролиферативных процессов, системных и генерализованных аллергических реакций. В этих случаях врач тщательно анализирует соотношение опасности самого заболевания и опасности развития иммунодефицита. Иммунодепрессантная терапия в настоящее время осуществляется с помощью лекарственных препаратов, ранее для целей иммуносупрессии применялось и ионизирующее излучение. Классификацию иммунодепрессантов проводят преимущественно по направленности их иммуносупрессирующей активности: 1) лекарственные препараты, обладающие общей супрессирующей активностью (ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, белков и проч.), для которых иммуносупрессирующий эффект является дополнительным или, фактически, побочным. К этой группе относятся глюкокортикоидные гормоны (гидрокортизон, преднизолон, дексаметазон и др.) и цитостатики (азатиоприн, метотрексат и др.), которые были разработаны для терапии онкозаболеваний; 2) специализированные иммунодепрессанты с разным уровнем селективности эффекта, активность которых направлена преимущественно на иммунную систему. К этой группе иммунодепрессантов принадлежат лекарственные вещества-антибиотики, продуцируемые некоторыми стрептомицетами и морскими грибами (циклоспорин А - сандиммун, сиролимус и др.), а также новые препараты для таргетной терапии, представляющие собой моноклональные антитела к конкретным молекулам. Создание таких препаратов основано на методах генной инженерии и гибридомной технологии: вариабельный фрагмент моноклональных антител (ответственный за связь с антигеном клетки) имеет животное происхождение (мыши, крысы, кролика), а константный (ответственный за связь с иммунокомпетентными клетками) – является человеческим, поэтому такие моноклональные антитела называют гуманизированными антителами. При их введении в организм они взаимодействуют с соответствующими клеточными рецепторами. Далее лечебный эффект препаратов связан с активацией комплемента по классическому пути с последующим разрушением клетки, либо с активацией цитотоксических Т-лимфоцитов с последующей инициацией апоптоза. Эти препараты созданы для терапии онкологических процессов, включая лимфопролиферативные, но в последующем некоторые их этих препаратов стали применяться и в целях иммуносупрессии (для предотвращения отторжения трансплантата и т.д.). К таким препаратам относят: - Кэмпас (алемтузумаб) - моноклональные антитела к, CD52, который экспрессируется на поверхности нормальных и малигнизированных B- и T-лимфоцитов крови. Препарат используют для терапии хронического лимфолейкоза, а также для предотвращения отторжения трансплантата; - АТГ-Фрезениус С - иммуноглобулин антитимоцитарный, эффективен для профилактики и терапии кризов отторжения при трансплантации органов и тканей, а также для лечения апластической анемии. Экспериментальные модели иммунодефицитных состояний. Иммунология экспериментальная — раздел иммунологии, разрабатывающий экспериментальные модели изучения функционирования иммунной системы (иммунодефицитных состояний — линии трансгенных животных, животных с нокаутом генов, аллергии, аутоиммунных процессов, онкозаболеваний), а также клеток и молекул иммунной системы in vivo и in vitro. Создает математические модели развития иммунного ответа и иммунологических процессов, выдвигает новые концепции и теории. Экспериментальные модели иммунодефицита позволяют анализировать характер нарушений иммунных механизмов и способствуют раскрытию причин нарушений в иммунной системе, что значительно расширяет возможности клинической терапии в диагностике, профилактике и лечении данной патологии, Известно несколько способов моделирования иммунодефицитного состояния. |