Никиян. Конспект лекций Рекомендовано Ученым советом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет
 Скачать 0.65 Mb.
|
|
Активный транспорт Активный транспорт веществ через биологические мембраны имеет огромное значение. За счет активного транспорта в организме создаются разности концентраций, разности электрических потенциалов, давления, поддерживающие жизненные процессы, то есть с точки зрения термодина- мики активный перенос удерживает организм в неравновесном состоянии, поддерживает жизнь, так как равновесие - это смерть организма. Существо- вание активного транспорта веществ через биологические мембраны впер- вые было доказано в опытах Усинга (1949 год) на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки. Экспериментальная камера Усинга, заполненная нормальным раство- ром Рингера, была разделена на две части свежеизолированной кожей ля- гушки. В опыте исследовали однонаправленные потоки ионов натрия через 59 кожу лягушки в прямом и обратном направлениях. В случае пассивного транспорта отношение этих потоков описывается уравнением Усинга- Теорелла: RT нар м, вн м, j j е С С вн нар . (5.9) На изолированной коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, воз- никает разность потенциалов φ вн -φ нар (внутренняя сторона кожи положитель- на по отношению к наружной). В установке имелось специальное устройст- во: электрическая батарея с потенциометром - делителем напряжения, с по- мощью которых компенсировалась разность потенциалов на коже лягушки: φ вн -φ нар = 0, что контролировалось вольтметром. Кроме того, концентрация ионов натрия с внешней и внутренней сторон поддерживалась одинаковой. При этих условиях, как видно из уравнения Усинга-Теорелла, j м, вн = j м, нар . Суммарный поток ионов через мембрану должен был бы отсутствовать. Его наличие свидетельствовало бы о переносе ионов против перепада кон- центрации, то есть об активном переносе. Для доказательства этого в одну часть экспериментальной камеры были добавлены радиоактивные изотопы 22 Na, а в другую - 24 Na. 22 Na распадается с излучением жестких γ-квантов, излучение 24 Na фиксировалось по мягким β-лучам. Было показано, что поток 22 Na больше потока 24 Na. О наличии тока в цепи свидетельствовали и пока- зания миллиамперметра. Эти экспериментальные данные неопровержимо свидетельствовали о том, что перенос ионов натрия через кожу лягушки не подчиняется уравне- нию пассивного транспорта. Более того, оказалось, что суммарный поток ионов натрия исключительно чувствителен к факторам, влияющим на энер- гетический обмен в клетках кожи: наличию кислорода, действию разобщи- телей окислительного фосфорилирования, действию низких температур. Следовательно, речь должна идти об особом способе переноса ионов, на- званном впоследствии активным. Позднее было установлено, что активный 60 перенос ионов натрия в коже лягушки обеспечивается ионными насосами, локализованными в клетках базального эпителия. Работа насоса блокирова- лась специфическим ингибитором оуабаином. Дальнейшие исследования показали, что в биологических мембранах имеется несколько разновидностей ионных насосов, работающих за счет свободной энергии гидролиза АТФ, представляющих собой специальные системы интегральных белков, работающих как ферменты аденозинтрифос- фатазы (АТФазы). Задачей этих ферментов является расщепление АТФ на АДФ и неорганический фосфат. Процесс распада сопровождается выделени- ем энергии, которая расходуется на транспорт ионов в сторону увеличения электрохимического потенциала. Расщепление АТФ стимулируется ионами натрия и калия и зависит от наличия магния. Активный транспорт возможен только за счет сопряжения транспорта какого-либо вещества с реакцией гид- ролиза АТФ. В настоящее время известны три типа электрогенных ионных насосов: K + -Na + насос, кальциевый насос и протонная помпа (водородный насос). Натрий-калиевый насос поддерживает градиент концентраций ионов натрия и калия по обе стороны мембраны. Механизм сопряжения оконча- тельно не выяснен. Вероятнее всего, энергия АТФ расходуется на изменение конформации транспортного белка, что изменяет его сродство (константу связывания) к тем или иным ионам. Транспорт всегда осуществляется в ту сторону, где сродство ниже. В клетке константа связывания переносчика с Na + значительно выше, чем с K + . Поэтому ионы натрия в клетке связываются с белком и транспортируются во внеклеточную среду. По другую сторону мембраны конформация белка меняется таким образом, что константа свя- зывания с Na + уменьшается, а с K + - увеличивается. Структура ионсвязы- вающего участка белка в этом случае такова, что к нему могут присоеди- няться уже не три, а два иона калия, которые и переносятся в клетку. Согласно современным представлениям, процесс активного транспор- та Na + и K + происходит в следующие семь этапов. 61 1 В присутствии Mg 2+ на внутренней стороне мембраны образуется комплекс фермента АТФазы с АТФ. 2 Присоединение АТФ изменяет конформацию фермента таким обра- зом, что к образовавшемуся комплексу присоединяются три иона натрия. 3 Происходит фосфорилирование Na + ,K + - АТФазы и отщепление АДФ. 4 Ионсвязывающий центр фермента перемещается относительно толщины мембраны, в результате чего ион натрия оказывается на внешней стороне клетки. 5 Снаружи клетки вследствие уменьшения сродства фермента к ио- нам натрия и повышения сродства к калию происходит обмен этими ионами. 6 После отщепления фосфата фермент с присоединенными ионами калия снова изменяет положение относительно мембраны. 7 Ионы калия и неорганический фосфат высвобождаются в цито- плазму, и фермент возвращается в исходное состояние. Таким образом, энергии, выделяющейся при гидролизе одной молеку- лы АТФ достаточно, чтобы вынести из клетки три иона натрия и внести два иона калия. Натрий-калиевый насос способствует не только повышению градиентов концентраций ионов, но и возрастанию градиента электрическо- го потенциала, то есть является электрогенным, так как сумма вносимых за- рядов неравна сумме выносимых. Межклеточная среда приобретает «более положительный» заряд по сравнению с клеткой за счет выноса одного «лиш- него» положительного иона. В мембранах саркоплазматического ретикулума мышечных клеток и цитоплазматических мембранах кардиомиоцитов существует Ca 2+ -насос, ра- бота которого во многом сходна с механизмом переноса ионов Na + ,K + - насосом. За один цикл, в процессе которого расходуется одна молекула АТФ, переносится два иона кальция. Активный транспорт протонов может осуществляться как с помощью подвижных переносчиков, так и через мембранные каналы. Протонные ка- 62 налы представляют собой интегральные белки, образующие внутреннюю пору, где содержатся участки, к которым могут присоединяться протоны. Энергия АТФ расходуется на изменение конформации белковых молекул, вследствие чего сродство одних участков связывания к протонам понижает- ся, а других - увеличивается, что заставляет протон перескочить на другой участок канала, сродство которого к протону на данный момент выше. Пу- тем таких перескоков с одного участка связывания на другой ион водорода пересекает мембрану. Перенос Н + против градиентов их концентраций осуществляется не только за счет энергии, выделяющейся при гидролизе АТФ, но и за счет энергии фотонов. Этот способ используется галофильными бактериями, ко- торые на свету выкачивают протоны из клетки, а энергию создавшегося гра- диента концентраций используют для синтеза АТФ. 5.7 Вторичный активный транспорт ионов Помимо ионных насосов, рассмотренных выше, известны сходные системы, в которых накопление веществ сопряжено не с гидролизом АТФ, а с работой окислительно-восстановительных ферментов или фотосинтезом. Транспорт веществ в этом случае является вторичным, опосредованным мембранным потенциалом и/или градиентом концентрации ионов при нали- чии в мембране специфических переносчиков. Такой механизм переноса по- лучил название вторичного активного транспорта. В плазматических и суб- клеточных мембранах живых клеток возможно одновременное функциони- рование первичного и вторичного активного транспорта. Примером может служить внутренняя мембрана митохондрий. Ингибирование АТФазы в ней не лишает частицу способности накапливать вещества за счет вторичного активного транспорта. Такой способ накопления особенно важен для тех ме- таболитов, насосы для которых отсутствуют (сахара, аминокислоты). 63 В настоящее время достаточно глубоко исследованы три схемы вто- ричного активного транспорта. Для простоты рассмотрен транспорт однова- лентных ионов с участием молекул-переносчиков. При этом подразумевает- ся, что переносчик в нагруженном или ненагруженном состоянии одинаково хорошо пересекает мембрану. Источником энергии служит мембранный по- тенциал и/или градиент концентрации одного из ионов. Однонаправленный перенос иона в комплексе со специфическим пере- носчиком получил название унипорта. При этом через мембрану переносит- ся заряд либо комплексом, если молекула переносчика электронейтральна, либо пустым переносчиком, если перенос обеспечивается заряженным пере- носчиком. Результатом переноса будет накопление ионов за счет снижения мембранного потенциала. Такой эффект наблюдается при накоплении ионов калия в присутствии валиномицина в энергизованных митохондриях. Встречный перенос ионов с участием одноместной молекулы- переносчика получил название антипорта. Предполагается при этом, что молекула-переносчик образует прочный комплекс с каждым из переносимых ионов. Перенос осуществляется в два этапа: сначала один ион пересекает мембрану слева направо, затем второй ион - в обратном направлении. Мем- бранный потенциал при этом не меняется. Движущей силой этого процесса является разность концентраций одного из переносимых ионов. Если исход- но разность концентрации второго иона отсутствовала, то результатом пере- носа станет накопление второго иона за счет уменьшения разности концен- траций первого. Классическим примером антипорта служит перенос через клеточную мембрану ионов калия и водорода с участием молекулы антибио- тика нигерицина. Совместный однонаправленный перенос ионов с участием двухмест- ного переносчика называется симпортом. Предполагается, что в мембране могут находиться две электронейтральные частицы: переносчик в комплексе с катионом и анионом и пустой переносчик. Поскольку мембранный потен- циал в такой схеме переноса не изменяется, то причиной переноса может 64 быть разность концентраций одного из ионов. Считается, что по схеме сим- порта осуществляется накопление клетками аминокислот. Калий-натриевый насос создает начальный градиент концентрации ионов натрия, которые за- тем по схеме симпорта способствуют накоплению аминокислот. Из схемы симпорта следует, что этот процесс должен сопровождаться значительным смещением осмотического равновесия, поскольку в одном цикле через мем- брану переносятся две частицы в одном направлении. 65 6 Биоэлектрические потенциалы Одна из важнейших функций биологических мембран – генерация и передача биопотенциалов. Это явление лежит в основе возбудимости клеток, регуляции мышечного сокращения, рецепции. В процессе жизнедеятельно- сти в клетках и тканях могут возникать разности электрических потенциа- лов: 1) окислительно-восстановительные потенциалы – вследствие перено- са электронов от одних молекул к другим; 2) мембранные – вследствие градиента концентрации ионов и переноса ионов через мембрану. Биопотенциалы, регистрируемые в организме, – это преимущественно мембранные потенциалы. Мембранный потенциал – разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны. В исследовании биопотенциалов используют: 1) микроэлектродный метод внутриклеточного измерения потенциа- лов; 2) специальные усилители биопотенциалов; 3) исследование крупных клеток (аксон кальмара). Стеклянный микроэлектрод представляет собой стеклянную микропи- петку с оттянутым очень тонким кончиком. Металлический электрод такой толщины (0,1-0,5 мкм) пластичен и не может проколоть мембрану, кроме то- го, он поляризуется. 6.1 Потенциал покоя в клетках Потенциал покоя – стационарная разность электрических потенциалов, регистрируемая между внутренней и наружной поверхностями мембраны в невозбужденном состоянии. Потенциал покоя определяется разной концен- 66 трацией ионов по разные стороны мембраны и диффузией ионов через мем- брану. Если концентрация какого-либо иона внутри клетки отлична от кон- центрации этого иона снаружи и мембрана проницаема для этого иона, воз- никает поток заряженных частиц через мембрану, вследствие чего наруша- ется электрическая нейтральность системы, образуется разность потенциа- лов внутри и снаружи клеток. При установлении равновесия выравниваются значения электрохимических потенциалов по разные стороны мембраны: т.к. μ = μ 0 + RTlnC + ZFφ: RTlnC вн + ZFφ вн = RTlnC нар + ZFφ нар . (6.1) Тогда формула Нернста для равновесного мембранного потенциала: нар вн нар вн м C C ZF RT ln (6.2) Согласно Бернштейну (1902), причина мембранного потенциала покоя – диффузия ионов калия из клетки наружу. По формуле Нернста равновес- ный мембранный потенциал составляет 120 мВ, что несколько больше моду- ля экспериментально измеренных значений потенциала покоя. Следует учи- тывать одновременную диффузию через мембрану ионов натрия, калия и хлора. В таком случае используют уравнение Гольдмана: o Cl i Na i K i Cl o Na o K м Cl P Na P K P Cl P Na P K P F RT ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ln , (6.3) где P K , P Na , P Cl – проницаемость мембраны для соответствующих ио- нов; [K + ] 0 , [Na + ] 0 , [Cl - ] 0 – концентрации ионов снаружи клетки; [K + ] i ,[Na + ] i ,[Cl - ] i – концентрации ионов внутри клетки. В состоянии покоя проницаемость мембраны для ионов калия больше, чем для ионов хлора и значительно больше, чем для ионов натрия. 67 Мембранный потенциал, рассчитываемый по уравнению Гольдмана, по абсолютной величине меньше мембранного потенциала, рассчитанного по уравнению Нернста, ближе к экспериментальным данным в крупных клетках. И формула Нернста, и уравнение Гольдмана не учитывают активно- го транспорта ионов через мембрану, наличие в мембранах электрогенных ионных насосов, играющих важную роль в поддержании ионного равновесия в мелких клетках. В цитоплазматической мембране работают калий- натриевые АТФ-азы, перекачивающие калий внутрь клетки, а натрий из клетки. С учетом работы электрогенных ионных насосов для мембранного потенциала было получено уравнение Томаса (1972): i Na i K o Na o K м Na P K mP Na P K mP F RT ] [ ] [ ] [ ] [ ln , (6.4) где m – отношение количества ионов натрия к количеству ионов калия, перекачиваемых ионными насосами через мембрану. Чаще всего натрий-калиевая АТФ-аза работает в режиме, когда m = 3/2, но всегда >1. (для хлора нет ионных насосов). Коэффициент m>1 усиливает вклад градиента концентрации калия в создание мембранного потенциала, поэтому мембранный потенциал, рассчитанный по Томасу, дает совпадение с экспериментальными значениями для мелких клеток. 6.2 Потенциал действия Потенциал действия – это электрический импульс, обусловленный из- менением ионной проницаемости мембраны и связанный с распространени- ем по нервам и мышцам волны возбуждения. В опытах по исследованию потенциала действия использовали 2 мик- роэлектрода, введенных в аксон. На первый микроэлектрод подается им- пульс от генератора прямоугольных импульсов, меняющий мембранный по- 68 тенциал. Мембранный потенциал измеряется при помощи второго микро- электрода высокоомным регистратором напряжения. Возбуждающий импульс вызывает лишь на короткое время смещение мембранного потенциала, которое быстро пропадает с восстановлением по- тенциала покоя. Когда возбуждающий импульс смещается еще дальше в от- рицательную сторону, он сопровождается гиперполяризацией мембраны. Потенциал действия не формируется, когда возбуждающий импульс поло- жительный (деполяризующий), но его амплитуда ниже порогового значения. Однако если амплитуда положительного деполяризующего импульса ока- жется больше порогового значения, то мембранный потенциал становится выше порогового потенциала и в мембране развивается процесс, в результа- те которого происходит резкое повышение мембранного потенциала и он становится положительным. Достигнув некоторого положительного значения – потенциала ревер- сии, мембранный потенциал возвращается к значению потенциала покоя, со- вершив нечто вроде затухающего колебания. В нервных волокнах и скелетных мышцах длительность потенциала действия составляет около 1 мс, в сердечной мышце – около 300 мс. После снятия возбуждения еще в течение 1-3 мс в мембране наблюдаются некото- рые остаточные явления, во время которых мембрана рефрактерна (невозбу- дима). Новый деполяризующий потенциал может вызвать образование нового потенциала действия только после полного возвращения мембраны в со- стояние покоя. Причем амплитуда потенциала действия не зависит от ам- плитуды деполяризующего потенциала. Если в покое мембрана поляризова- на (т.е. потенциал цитоплазмы отрицателен по отношению к внеклеточной среде), то при возбуждении происходит деполяризация мембраны (потенци- ал внутри клетки положителен) и после снятия возбуждения происходит ре- поляризация мембраны. Характерные свойства потенциала действия: 69 1) наличие порогового значения деполяризующего потенциала; 2) закон «все или ничего», т.е., если деполяризующий потенциал больше порогового, то развивается потенциал действия, амплитуда которого не зависит от амплитуды возбуждающего импульса; если деполяризующий потенциал меньше порогового, то потенциал действия не развивается; 3) есть период рефрактерности, невозбудимости мембраны во время развития потенциала действия и остаточных явлений после снятия возбуж- дения; 4) в момент возбуждения резко уменьшается сопротивление мембраны. Положительный потенциал реверсии имеет натриевую природу, т.к. именно диффузия натрия создает положительную разность потенциалов ме- жду внутренней и наружной поверхностями мембраны. Можно менять амплитуду импульса потенциала действия, изменяя концентрацию натрия в наружной среде. При уменьшении наружной кон- центрации натрия амплитуда потенциала действия уменьшается, т.к. меняет- ся потенциал реверсии. Если из окружающей клетку среды полностью уда- лить натрий, то потенциал действия вообще не возникает. Если в состоянии покоя соотношение коэффициентов проницаемости мембраны аксона кальмара для разных ионов: P К : P Na : P Cl =1 : 0,04 : 0,45, то в состоянии возбуждения: P К : P Na : P Cl =1 : 20 : 0,45, То есть при возбуждении коэффициент проницаемости для натрия увеличивается в 500 раз. Возбуждение мембраны описывается уравнением Ходжкина-Хаксли: 70 i m m m I dt d C I (6.5) где I m – ток через мембрану; C m – емкость мембраны; ΣI i – сумма ионных токов через мембрану. Электрический ток через мембрану складывается из ионных токов: ио- нов калия, натрия и других ионов (в том числе хлора), тока утечки, а также емкостного тока. Емкостный ток обусловлен перезарядкой конденсатора, ко- торый представляет собой мембрана, перетеканием зарядов с одной ее по- верхности на другую. Его величина определяется количеством заряда, пере- текающего с одной обкладки на другую за единицу времени. Каждый ион- ный ток определяется разностью мембранного потенциала и равновесного нернстовского потенциала, создаваемого диффузией ионов данного типа. В целом, согласно теории Ходжкина-Хаксли, возбуждение элемента мембраны связано с изменением проводимости мембраны для ионов натрия и калия. Проводимости мембраны сложным образом зависят от мембранного потенциала и времени. Если в каком-либо участке возбудимой мембраны сформировался по- тенциал действия, мембрана деполяризована, возбуждение распространяется на другие участки мембраны. Локальные токи образуются и внутри клетки и на наружной ее поверх- ности. Локальные электрические токи приводят к повышению потенциала внутренней поверхности невозбужденного участка мембраны и к пониже- нию наружного потенциала невозбужденного участка мембраны, оказавше- гося по-соседству с возбужденной зоной. Таким образом, отрицательный по- тенциал покоя уменьшается по абсолютной величине, т.е. повышается. В об- ластях, близких к возбужденному участку, мембранный потенциал повыша- ется выше порогового значения. Под действием изменения мембранного по- тенциала открываются натриевые каналы, и дальнейшее повышение проис- ходит уже за счет потока ионов натрия через мембрану. Происходит деполя- 71 ризация мембраны, развивается потенциал действия. Затем возбуждение пе- редается дальше на покоящиеся участки мембраны. Экспериментальной базой для создания модели генерации потенциала действия явились результаты опытов по разделению ионных токов возбуж- денного аксона. Для разделения токов использовали блокатор натриевого тока – тетродотоксин и блокатор калиевого тока – тетраэтиламмоний. Изме- рение входящих и выходящих токов проводилось в режиме фиксации потен- циала. При введении в раствор тетродотоксина регистрировали временную зависимость выходящего тока калия при данном фиксированном значении мембранного потенциала. Затем величину фиксированного деполяризующе- го потенциала изменяли и снова регистрировали зависимость. То же самое делали для натрия. В результате выяснено: 1) чем ближе смещается фиксированный потенциал к значению равно- весного потенциала, определяемого по уравнению Нернста для ионов натрия и калия, тем меньше значение соответствующего тока; 2) меняется временной ход токов калия и натрия. Таким образом, экспериментально была показана зависимость токов натрия и калия от мембранного потенциала и от времени. В серии опытов на аксоне кальмара было показано: 1) образование потенциала действия связано с переносом натрия и ка- лия через мембрану; 2) проводимость мембраны для этих ионов меняется в зависимости от величины мембранного потенциала и времени. В дальнейшем Ходжкин и Хаксли предложили математическую мо- дель, которая описывала изменения проводимостей, а, следовательно, и то- ков ионов натрия и калия через мембрану в процессе возбуждения. Основные постулаты модели Ходжкина и Хаксли: 1) в мембране существуют отдельные каналы для переноса ионов на- трия и калия; 72 2) во внутренней структуре мембраны существуют некоторые заря- женные частицы, управляющие проводимостью каналов. В зависимости от величины напряженности приложенного электрического поля эти гипотети- ческие частицы могут передвигаться в мембране, и тем самым увеличивать или уменьшать потоки ионов натрия и калия через каналы. Таким образом, Ходжкин и Хаксли обосновали ионную теорию возбу- димых мембран и смогли удовлетворительно описать в рамках этой теории изменения ионной проводимости и процесс генерации потенциала действия нервной клетки. Модель Ходжкина-Хаксли не объясняла природу активи- рующих и блокирующих частиц и механизм их влияния на проводимость ионного канала. Физическая интерпретация модели Ходжкина-Хаксли требует наличия внутри мембраны заряженных частиц, причем эти частицы должны передви- гаться в зависимости от внешнего электрического поля. Таким образом, для подтверждения второго постулата модели необходимо зарегистрировать пе- ремещения заряженных частиц внутри мембраны при изменении мембран- ного потенциала, т.е. зарегистрировать т.н. воротные токи. Трудность обна- ружения воротных токов заключалась в том, что активирующих частиц внутри мембраны очень мало и, следовательно, низкое значение воротного тока по сравнению с ионными токами, проходящими через мембрану. |