Никиян. Конспект лекций Рекомендовано Ученым советом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет
 Скачать 0.65 Mb.
|
|
3 Основы молекулярной биофизики 3.1 Предмет, задачи и объекты изучения молекулярной биофизики Молекулярная биофизика изучает физическую структуру биологиче- ски важных молекул и физические процессы, лежащие в основе их функцио- нирования. Основными объектами молекулярной биофизики являются бел- ки и нуклеиновые кислоты. Кроме этого молекулярная биофизика изучает полисахариды. Под структурой молекулы понимают расположение в про- странстве всех её атомов. В молекулярной биофизике характеристика моле- кулы включает в себя структурную химическую формулу, длины всех связей и углы между связями, распределение зарядов на поверхности, подвижность отдельных участков и изменчивость структуры в зависимости от параметров среды: температуры, ионной силы, рН, наличия определенных ионов. Ос- новная задача молекулярной биофизики – выяснение связи физической структуры и свойств биологически важных молекул с выполняемой ими в организме функцией. 3.2 Общая характеристика структуры биополимеров Первая особенность молекул, синтезируемых в живой клетке – их сте- реоспецифичность (хиральность). Стереоспецифические молекулы могут существовать в виде двух зеркально симметричных форм – стереоизомеров: правой (D-форма «+») и левой (L-форма «-»). Асимметрия определяет спе- цифичность биохимических реакций. Стереоизомеры обладают одинаковой химической активностью, однако в живой природе хиральные соединения существуют обычно в какой-то одной форме. Организм различает L – и D- изомеры при поглощении извне и синтезируют соединения в одной стерео- конфигурации. В живых организмах аминокислоты присутствуют в L-форме, а углеводы в D-форме. 25 Макромолекулы обладают несколькими видами изомерии. Различные изомеры одного и того же соединения, переход между которыми возможен только при условии разрыва и образования новых ковалентных связей, назы- ваются конфигурациями этого соединения. Примером конфигураций явля- ются L- и D-изомеры. Если же переход из одного изомера в другой осущест- вляется за счет поворота вокруг одинарных ковалентных связей без их раз- рыва, то такие изомеры называются конформациями. Вокруг одинарных атомных связей в молекуле может осуществляться вращение. Установлено, что не все значения углов поворота равновероятны. Наиболее вероятны значения углов поворота кратные 120°. В этом случае молекула находится в транс-конформации. Наименее вероятными считают- ся значения углов поворота – 60°, 180°, 300°. В этом случае молекула нахо- дится в цис-конформации. Причины, по которым транс-конформация являет- ся более выгодной, чем цис-, имеют квантово-механическую природу и за- ключаются в отталкивании близко расположенных валентно не связанных атомов, а также во взаимодействиях связей, примыкающих к оси вращения (эффект ориентации связей). Энергетически выгодные конформации, воз- никающие при поворотах вокруг единичных связей, называют- ся поворотными изомерами. Молекула будет переходить из выгодной кон- формации в другую со скоростью, которая определяется высотой потенци- ального барьера, отделяющего эти конформации. Так, при высоте потенци- ального барьера около 12,5 кДж/моль время превращения одного поворот- ного изомера в другой составляет 10 -10 секунды. Белки и нуклеиновые кислоты представляют собой информационные макромолекулы, кодирование информации в которых осуществляется ами- нокислотным или нуклеотидным алфавитом. Макромолекулы полисахари- дов состоят из одинаковых звеньев и поэтому не несут информации. Они выполняют либо опорную функцию, либо служат в качестве депо необходи- мых веществ. 26 Структура макромолекул имеет несколько уровней организации. Важ- ная особенность структуры белков и нуклеиновых кислот заключается в ста- билизации положения химических групп в пространстве с минимальной внутренней энергией. Это достигается за счет ковалентных, водородных связей и других связей. Первичной структурой называется последователь- ность мономеров, образующих полимерную цепь. В белках это последова- тельность аминокислот, в нуклеиновых кислотах – нуклеотидов. Первичная структура стабилизирована ковалентными связями, в то время как все ос- тальные уровни организации – в основном слабыми связями (водородными, гидрофобными, электростатическими). Регулярное расположение в про- странстве химических групп (пептидных в белках, пуриновых и пиримиди- новых оснований в нуклеиновых кислотах) создает вторичную структуру биополимеров. Например, вторичная структура ДНК представляет собой двойную спираль, стабилизированную водородными связями между ком- плементарными азотистыми основаниями образующих спираль цепей. Как известно из химии, вращение в молекулах вокруг одинарных свя- зей приводит к появлению поворотных изомеров, то есть молекул с различ- ной конформацией. В белках вращение вокруг пептидной связи С–N за- труднено, так как эта связь имеет на 30-40 % характер двойной связи вслед- ствие резонанса. Поэтому белок можно рассматривать как цепь из связанных друг с другом плоских пептидных звеньев. Вращение этих звеньев возможно вокруг одинарных связей α углерода аминокислот. Угол поворота вокруг связи С α –С обозначается ψ, а вокруг N–С α - φ. Полинг и Корн установили два основных варианта вторичной структуры белковой цепи: α-спираль и β– форму. α-Спирали могут быть правозакрученными (φ=132 о , ψ=123 о ) и лево- закрученными (φ=228 о , ψ= 237 о ). β–Формы могут быть параллельными (φ=61 о , ψ= 239 о ) и антипараллельными (φ=380 о , ψ= 325 о ). Кроме того, в бел- ках встречаются участки, не образующие регулярной структуры, так назы- ваемые неупорядоченные структуры, в которых одноименные углы φ и ψ неодинаковы. Например, в гемоглобине 75 % аминокислот образуют право- 27 закрученные α-спирали, а остальные участки являются неупорядоченными, они располагаются преимущественно в местах пространственных изгибов спирализованной цепи. Возможность изгибов в цепи и наличие в молекулах белков различных взаимодействий между группами, далеко отстоящими друг от друга в поли- пептидной цепи, приводят к компактной укладке этой цепи. Расположение в пространстве элементов вторичной структуры и неупорядоченных звеньев полипептидной цепи называется третичной структурой белка. Различие между вторичной и третичной структурами условно, так как в действитель- ности мы имеем дело с единственной пространственной структурой (кон- формацией) белка, состоящей из регулярных участков и неупорядоченных звеньев. Нативная молекула белка может состоять из нескольких полипеп- тидных цепей, каждая из которых имеет определенную третичную структуру. Такие отдельные полипептидные цепи, не связанные друг с другом кова- лентно, называются субъединицами. Структура, которая образуется при ас- социации субъединиц, называется четвертичной структурой белка. Число субъединиц в нативной молекуле белка постоянно. Этим четвертичная структура отличается от агрегатов молекул белка, образующихся при дена- турации. Изменение свойств окружающей среды: температуры, ионного состава, рН, концентрации малых молекул – может изменить баланс сил, опреде- ляющих данную конформацию белка, и вызвать переход белка в новую кон- формацию, стабильную в новых условиях. Такие перестройки в молекуле белка называют конформационными переходами. 3.3 Виды взаимодействий в макромолекулах В биологически важных молекулах существуют несколько типов свя- зей и энергии взаимодействий. 28 1 Ионные связи образуются между заряженными атомами. Энергия ионной связи определяется по формуле: W ион = - q 1 q 2 /4πε 0 εr, где q 1 и q 2 – заряды взаимодействующих ионов; ε 0 = 8,85∙10 -12 Ф/м – электрическая постоянная; ε – относительная диэлектрическая проницаемость среды; r – расстояние между ионами. Ионные связи в макромолекулах обусловлены присутствием ионоген- ных групп: карбоксильных и аминогрупп в белках, фосфатных групп в нук- леиновых кислотах. В биомембранах ионогенными группами являются фос- фаты, а также карбоксилы свободных жирных кислот. За счет ионных связей образуются комплексы различных ионов с макромолекулами. Например, многие белки связывают ионы кальция, а нуклеиновые кислоты еще и ионы магния. Для многих явлений в организме (мышечное сокращение, свертывание крови) важно образование комплексов ионов с макромолекулами. Образо- вание этих комплексов происходит за счет ион-ионных и ион-дипольных взаимодействий. Например, связывание ионов кальция с фосфолипидами мембраны обусловлено ион-ионными взаимодействиями, а связывание мем- бранных ионов кальция с лекарственным препаратом – ион-дипольным взаимодействием. 2 Ион-дипольные взаимодействия возникают между ионами и молеку- лами или атомными группами, обладающими дипольным моментом. Атомы, находящиеся на небольшом расстоянии друг от друга, взаимодействуют за счет ван-дер-ваальсовых связей, которые включают следующие виды взаи- модействий: 1) ориентационные (диполь-дипольные) связи возникают между моле- кулами, обладающими дипольным моментом; 29 2) индукционное взаимодействие возникает тогда, когда молеку- ла, имеющая постоянный дипольный момент, способна индуцировать его в соседней молекуле; 3) дисперсионные взаимодействия возникают между нейтральными или неполярными группами и имеют квантово-механическую природу. На- пример, взаимодействие углеводородных цепей друг с другом в липидной части биомембран. Важную роль в формировании структуры макромолекул играют водо- родные связи. 3 Водородные связи образуются между группами, содержащими атом водорода, и атомами кислорода, азота, фтора, хлора за счет электростатиче- ских и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Эти связи обусловлены способ- ностью самого малого атомного ядра протона проникать в электронные обо- лочки соединяемых им электроотрицательных атомов и их стягивать. Водо- родная связь является направленной и образуется только в том случае, когда все три атома, участвующие в её образовании, лежат на одной прямой. Во- дородные связи играют важнейшую роль в поддержании определенной вто- ричной структуры не только белков, но и нуклеиновых кислот. Одновремен- ное образование большого числа водородных (слабых) связей в макромоле- кулах лежит в основе явления комплементарности, то есть строго структур- ного соответствия и специфичности связывания больших участков молекул. 4 Гидрофобные взаимодействия способствуют отталкиванию друг от друга неполярных незаряженных групп и молекул воды. Эти силы опреде- ляют формирование структуры биологических мембран и глобулярных бел- ков. 3.4 Структура воды и гидрофобные взаимодействия Большинство биополимеров функционирует в водной среде, и взаимо- действие составляющих их мономеров с водой во многом определяет про- 30 странственную конфигурацию макромолекулы в целом. Причина столь важ- ной роли воды в биологических процессах кроется в следующем. В отличие от гидридов элементов VI группы (H 2 S, H 2 Se, H 2 Te) моле- кула H 2 O является диполем из-за своей асимметрии: линии, соединяющие центры атома кислорода с центрами атомов водорода, образуют угол 104,28°. Атом кислорода в молекуле воды расположен как бы в центре тетраэдра, в двух вершинах которого находятся атомы водорода. Две пары электронов кислорода, не участвующих в образовании ковалентных связей, находятся на вытянутых орбиталях, оси которых направлены к двум другим углам тетра- эдра. Эти электронные пары несут локальный отрицательный заряд и обу- славливают электростатическое притяжение между данной молекулой воды и атомами водорода соседних молекул. Благодаря этим взаимодействиям в жидкой воде формируются ассоциации молекул, называемые кластерами. Структура кластеров сходна со структурой льда. В кристаллах льда каждая молекула воды связана водородными связями с 4 соседями, при этом атомы кислорода соседних молекул также располагаются в вершинах тетраэдров. Такая кристаллическая решетка отличается рыхлостью: в кристаллах льда атомы расположены сравнительно далеко друг от друга, поэтому лед имеет довольно низкую плотность, более низкую, чем жидкая вода, в которой часть молекул располагается в полостях тетраэдрической кристаллической струк- туры. Вместе с тем даже после полного таяния льда в жидкой воде сохраня- ются льдоподобные структуры – кластеры. Между кластерами и неструкту- рированной частью воды постоянно существует обмен молекулами, так что в среднем каждый кластер живет всего 10 -10 – 10 -11 секунд. При 20 ̊С доля не связанных в кластеры молекул составляет 29,5 %. С повышением температу- ры средний размер кластеров уменьшается, и доля несвязанных молекул возрастает. Именно с плавлением кластеров связана аномально высокая теп- лоёмкость воды. В воде хорошо растворяются те органические соединения, которые со- держат полярные группы и способны вступать в диполь-дипольные взаимо- 31 действия с молекулами воды или образовывать с ними водородные связи. Таковы, например, группы –ОН, >С=О, –NH 2 . Напротив, неполярные моле- кулы углеводородов плохо растворяются или совсем не растворяются в воде. Это объясняется тем, что при растворении молекулы углеводородов «вти- скиваются» в полости внутри тетраэдрических ячеек кластеров, вытесняя от- туда неструктурированную воду. Последняя образует новые кластеры, и упорядоченность системы увеличивается, а значит, энтропия уменьшает- ся. Поэтому гидрофобные взаимодействия являются результатом свойств воды, а не каких-то особых сил, связывающих неполярные группы друг с другом. Таким образом, ассоциация неполярных молекул в воде за счет гид- рофобных взаимодействий определяется выталкивающим действием воды на неполярные соединения, что обусловлено тенденцией молекул воды к дос- тижению состояния максимальной неупорядоченности (максимальной эн- тропии). 3.5 Роль гидрофобных взаимодействий в формировании структуры белка Аминокислотные остатки, входящие в состав полипептидной цепи, мо- гут быть разделены на две группы: неполярные (гидрофобные) и полярные (гидрофильные). В формировании пространственной структуры белка опре- деляющую роль играют гидрофобные взаимодействия. Эту идею впервые высказали советские ученые Бреслер С.Е. и Толмуд Д.Л. в 1944 году. Идея состояла в том, что гибкая макромолекула белка в воде сворачивается в гло- булу. Так как неполярные остатки белка стремятся к минимальному кон- такту с водным окружением, они начинают сворачиваться в шарообразную каплю. Полярные же радикалы белка стремятся к максимальному контакту с водным окружением, поэтому они образуют гидрофильную оболочку во- круг гидрофобной капли. В результате образуется глобула, которая имеет гидрофобное ядро и гидрофильную поверхность. 32 В 1964 году Фишер установил, что: 1) если количество полярных остатков в белке равно количеству непо- лярных, то молекула белка имеет шаровидную форму (глобула); 2) если количество полярных остатков в белке больше, чем необходи- мо для того, чтобы покрыть гидрофобное ядро гидрофильным слоем, то гло- була вытягивается в эллипсоид (фибрилла); 3) если количество полярных остатков в белке меньше, чем необходи- мо для того, чтобы покрыть гидрофобное ядро гидрофильным слоем, то гид- рофобные взаимодействия ведут к агрегации белков и возникновению над- молекулярных структур. Формирование гидрофобного ядра в глобулярных белках имеет прин- ципиальное значение для их функционирования. Благодаря гидрофобным взаимодействиям белки при большой молекулярной массе обладают сравни- тельно компактной структурой, при этом компактно упакованная глобула находится в одной, наиболее устойчивой конформации. 3.6 Связывание лигандов с макромолекулами В основе функционирования многих биополимеров лежит образование комплексов между малой молекулой (ионом, гормоном, метаболитом) - ли- гандом - и центрами связывания, лежащими на макромолекуле. Образование комплекса лиганд-макромолекула можно рассматривать как химическую ре- акцию, которая характеризуется константой образования комплекса, то есть константой связывания. В ходе исследований выяснилось, что константа связывания обратно пропорциональна концентрации свободного лиганда в условиях 50 % заполнения центров связывания. Из всех реакций связывания лиганда с макромолекулой наиболее хорошо изучено образование ком- плекса кислорода с гемосодержащими белками. На основе теоретических выкладок была разработана методика определения степени насыщения ки- слородом разных типов гемоглобинов человека и миоглобина. Для этого 33 строятся кривые насыщения кислородом. Для построения этих кривых поль- зуются не концентрацией кислорода, а его парциальным давлением, кото- рое прямо пропорционально концентрации кислорода в растворе. Тогда ве- личина парциального давления, при котором 50 % гемоглобина оксигениро- вано, будет являться мерой сродства гемоглобина к кислороду (Р 50 ). Умень- шение значений Р 50 означает увеличение константы связывания, то есть уве- личение способности гемоглобина связывать кислород. По результатам ис- следований оказалось, что нормальный гемоглобин (HbA) будет отдавать кислород гемоглобину плода (HBF) и миоглобину мышц (Mb), то есть мера сродства к кислороду у нормального гемоглобина ниже, чем у фетального гемоглобина и миоглобина. 3.7 Кооперативное связывание лигандов В 1909 году Хилл предложил модель связывания кислорода с гемогло- бином. Согласно модели Хилла, центры связывания кислорода на молекуле гемоглобина не являются независимыми. Присоединение первой молекулы кислорода к одному из центров увеличивает сродство к кислороду других центров, а связывание двух молекул кислорода еще более облегчает связы- вание третьей молекулы кислорода и т.д. Такое связывание, при котором константы связывания идентичных центров изменяются по мере заполнения центров, называется кооперативным связыванием. Хилл рассмотрел модель с максимальной кооперативностью, то есть когда связывание первого лиганда увеличивает сродство остальных центров настолько, что они заполняются практически мгновенно. Это предположение эквивалентно тому, что в любой равновесной смеси лиганда и макромолекул присутствуют в значительных концентрациях либо только макромолекулы с незанятыми центрами связывания, либо комплексы лиганда с макромолеку- лой, где все центры заполнены. Константа связывания в этом случае опреде- ляется выражением: 34 K = [ML n ]/c n [M], (3.1) где [ML n ], c n , [M] – соответствующие концентрации комплексов, сво- бодного лиганда и свободных центров связывания. В этой условной реакции константа связывания представляет собой произведение соответствующих констант связывания K = (K 1 …..K n ). Поэто- му, для удобства расчета, Хилл преобразовал выражение (3.1) в выраже- ние: lg [Y/(1-Y)] = lgK + nlgc, (3.2) где Y – степень насыщения. Это уравнение называется уравнением Хилла, а прямая, являющаяся графическим представлением зависимости lg[Y/(1-Y)] от lgc, называется графиком Хилла; её наклон равен n. Хотя уравнение (3.2) было выведено для случая полной кооперативности связывания лиганда всеми n центрами, тем не менее, графиками Хилла часто пользуются для анализа процессов, коо- перативность которых не является полной. В этих случаях кооперативность характеризуют коэффициентом Хилла (h), который численно равен макси- мальному тангенсу угла наклона графиков Хилла. Так, связывание кислоро- да с нормальным гемоглобином, имеющим 4 гема, характеризуется h=2,9, а с эритрокруорином (аналогом гемоглобина) кольчатого червя пескожила, имеющим 96 гемов, расположенных по 8 в 12 субъединицах, характеризует- ся h=6. По коэффициенту Хилла определяют характер и степень кооператив- ности. Если h=1, то кооперативность отсутствует (например, миоглобин). При h<1 кооперативность отрицательная, то есть происходит уменьшение сродства при последовательном связывании лигандов. При h>1 имеет место положительная кооперативность, то есть усиление сродства по мере связы- вания лиганда. Кооперативность связывания лигандов является лишь одним из примеров кооперативных процессов в биологии, к числу которых отно- |