Никиян. Конспект лекций Рекомендовано Ученым советом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет
 Скачать 0.65 Mb.
|
|
3.8 Ферментный катализ Одной из основных функций белка является ферментативная. Белки- ферменты способны ускорять биохимические реакции в 10 8 – 10 10 раз по сравнению с тем, если бы эти реакции происходили бы без участия фермен- тов. Ферменты никогда не сдвигают химическое равновесие. Роль ферментов сводится к уменьшению энергии активации реакции, а, следовательно, к уве- личению константы скорости. Ферменты обладают высокой специфично- стью и катализируют только определенные реакции или реакции с участием узкого класса соединений. Первой моделью, объясняющей специфичность фермента, явилась модель Фишера, согласно которой субстрат стерически соответствует активному центру фермента. Эта модель получила название ключ-замок. Согласно более поздней модели Кошланда – модели индуциро- ванного соответствия, - присоединение определенного субстрата вызывает конформационные перестройки в ферменте, в результате чего его каталити- ческие группы ориентируются в пространстве таким образом, что оказыва- ются способными осуществить превращение субстрата в продукт. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации суб- страта определяется уравнением Михаэлиса-Ментен: m k S S v v max , где v max - максимальная скорость реакции; k m - константа Михаэлиса, равная концентрации субстрата, при ко- торой скорость реакции составляет половину от максимальной; S - концентрация субстрата. 36 Некоторые вещества, связываясь с ферментом, уменьшают скорость ферментативной реакции (ингибиторы) или увеличивают (активаторы). В качестве ингибиторов и активаторов могут выступать естественные физио- логические вещества, регулирующие ферментативную активность, и лекар- ственные препараты. Различают конкурентные и неконкурентные ингибито- ры. Конкурентные ингибиторы связываются с активным центром фермента, образуя комплекс фермент-ингибитор, но в продукт не превращаются. При этом максимальная скорость ферментативной реакции не изменяется. Не- конкурентный ингибитор связывается с фермент-субстратным комплексом, образуя продукт - неактивный комплекс – фермент-субстрат-ингибитор. При этом максимальная скорость ферментативной реакции уменьшается. Но существует ряд ферментов, кинетика которых не подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. Эти ферменты состоят из нескольких субъединиц, име- ют несколько центров связывания субстрата и проявляют свойства коопера- тивности. 37 4 Биофизика мембран Биологическими мембранами называют функциональные структуры клеток толщиной в несколько молекулярных слоев, ограничивающие цито- плазму и большинство внутриклеточных структур, а также образующие еди- ную внутриклеточную систему канальцев, складок и замкнутых полостей. Толщина биологических мембран редко превышает 10 нм, однако вследст- вие сравнительно плотной упаковки в них основных молекулярных компо- нентов (белки и липиды), а также большой общей площади клеточных мем- бран они составляют обычно более половины массы сухих клеток. Биологические мембраны построены в основном из белков, липидов и углеводов. Белки и липиды составляют основную часть сухой массы мем- бран. Доля углеводов обычно не превышает 10-15 %, причем они связаны либо с молекулами белка (гликопротеины), либо с молекулами липидов (гликолипиды). В мембранах различного происхождения содержание липи- дов колеблется от 25 % до 75 % по массе по отношению к белку. Липиды, входящие в состав биологических мембран, относятся глав- ным образом к трем основным классам: глицерофосфатидам (фосфолипиды), сфинго- и гликолипидам, а также стероидам. 4.1 Структура и функции биологических мембран Первая модель биологической мембраны была предложена в 1902 году. Было замечено, что через мембраны лучше всего проникают вещества, хо- рошо растворимые в липидах, следовательно, биологические мембраны со- стоят из тонкого слоя фосфолипидов. В 1925 году Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липи- дов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в 2 раза больше суммарной площади эритроцитов. Была высказана идея, что липиды в мембране распо- лагаются в виде молекулярного бислоя. 38 В 1935 г. Ф. Даниэлли и Г. Девсон выдвинули первую гипотезу о строении биологических мембран, согласно которой мембрана состоит из двойного липидного слоя, покрытого с двух сторон слоями глобулярных белков («бутербродная» модель). В том же году Коул и Кертис определили электрические параметры биологических мембран: высокое электрическое сопротивление (≈10 7 Ом∙м 2 ) и большая электрическая емкость (≈0,5∙10 -2 Ф/м 2 ). В целом, биологическую мембрану можно рассматривать как электри- ческий конденсатор, в котором пластинами являются электролиты внекле- точного раствора и цитоплазмы с погруженными в них головками липидных молекул. Проводники разделены диэлектрическим слоем, образованным не- полярной частью липидных молекул - двойным слоем их хвостов. Липиды - диэлектрики с диэлектрической проницаемостью ε ≈ 2. Емкость плоского конденсатора C = εε о S/d, где ε 0 – электрическая постоянная = 8,85∙10 12 Ф/м; d – расстояние между пластинами конденсатора; S – площадь пластины. Удельная емкость (на единицу площади) C уд = εε о /d. Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, соответствующее тол- щине липидной части мембраны d = εε о /C уд =3,5 нм. В 1964 г. Дж. Робертсон предложил унитарную схему асимметричного строения мембраны. В соответствии с этой схемой белки могут разворачи- ваться на поверхности двойного липидного слоя под действием сил электро- статического взаимодействия с заряженными головками фосфолипидов мембран; на наружной поверхности мембраны располагаются еще и молеку- лы гликопротеинов. Однако под влиянием новых фактов, и в первую очередь обнаружения зернистой структуры мембран, которая просматривалась на 39 снимках, полученных при большом увеличении, первоначальные представ- ления о трехслойности мембран были пересмотрены. В настоящее время считают, что белки не выстилают поверхность ли- пидного слоя мембран, а «плавают» на поверхности в виде отдельных глобу- лярных молекул или частиц, в большей, или меньшей степени погруженных в мембрану. Эта жидкомозаичная модель, предложенная Дж. Николсоном и С. Сингером (1972), позволяет удовлетворительно объяснить целый ряд фак- тов, в частности зависимость многих физиологических функций мембран и активности отдельных мембранных ферментов от фазового состояния липи- дов в мембране, ее текучести (вязкость). Более поздняя белково- кристаллическая модель отличается от жидкомозаичной модели фактически лишь постулированием существовании в мембране жесткой белковой струк- туры, возникающей в результате дальнодействующих белок-белковых связей. На сегодняшний день наибольшее распространение получили различные ва- рианты жидкомозаичной модели. Согласно современным представлениям, все клеточные и внутрикле- точные мембраны устроены сходным образом: основу мембраны составляет двойной молекулярный слой липидов (липидный бислой) на котором и в толще которого находятся белки. Белки мембран принято делить на интегральные и периферические. Интегральные белки имеют обширные гидрофобные участки на поверхно- сти и нерастворимы в воде. С липидами мембран они связаны гидрофобны- ми взаимодействиями и частично погружены в толщу липидного бислоя, а зачастую и пронизывают бислой, оставляя на поверхности сравнительно не- большие гидрофильные участки. Отделить эти белки от мембраны удается только с помощью детергентов, типа додецилсульфата или солей желчных кислот, которые разрушают липидный слой и переводят белок в раствори- мую форму (солюбилизируют его) образуя с ним ассоциаты. Все дальнейшие операции по очистке интегральных белков осуществляются также в присут- ствии детергентов. Периферические белки связаны с поверхностью липидно- 40 го бислоя электростатическими силами и могут быть отмыты от мембраны солевыми растворами. Молекулы фосфолипидов, согласно данным рентгеноструктурного анализа, имеют форму сплюснутого с боков цилиндра, а по длине как бы де- лятся на две неравные части: небольшую "голову", состоящую из полярных групп, и длинный "хвост", образованный углеводородными цепями жирных кислот, входящих в состав фосфолипида. Можно выделить три основные функции биологических мембран: 1) барьерная функция обеспечивает селективный, регулируемый, пассивный и активный обмен веществ клетки с окружающей средой (селек- тивный - значит избирательный: одни вещества переносятся через биологи- ческие мембраны, другие нет; регулируемый - проницаемость мембраны для определенных веществ меняется в зависимости от функционального состоя- ния клетки; активный - перенос от мест, где концентрация вещества мала, к местам с большей концентрацией); 2) матричная функция обеспечивает взаимное расположение и ори- ентацию мембранных белков, обеспечивает их оптимальное взаимодействие (например, взаимодействие мембранных ферментов); 3) механическая функция обеспечивает прочность и автономность клеток и внутриклеточных структур. Кроме того, биологические мембраны выполняют функции: 1) энергетическую - синтез АТФ на внутренних мембранах митохон- дрий и фотосинтез углеводов в мембранах хлоропластов; 2) генерацию и проведение биопотенциалов; 3) рецепторную (механическая, акустическая, обонятельная, зри- тельная, химическая, терморецепция - мембранные процессы) и многие дру- гие функции. Огромная роль мембран в жизненных процессах связана с их относи- тельно большой совокупной площадью. Так, общая площадь всех биологи- 41 ческих мембран в организме человека достигает десятков тысяч квадратных метров. 4.2 Динамика мембран Режим функционирования мембраны в значительной степени зависит от микровязкости липидного бислоя и подвижности фосфолипидных моле- кул в мембране, фазового состояния мембранных липидов. Отклонения био- физических характеристик липидного бислоя от нормы связано с разного рода патологиями. Важную роль в физиологии клетки играют фазовые пере- ходы в биологических мембранах. Липидная фаза биологических мембран при физиологических услови- ях (температуре, давлении, химическом составе окружающей среды) нахо- дится в жидком агрегатном состоянии, что было подтверждено методами флуоресцентного анализа, электронного парамагнитного резонанса и ядер- ного магнитного резонанса. Эти же методы показали, что подвижность фос- фолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белков- ферментов резко сказывается на их функционировании. Некоторые экспери- ментальные данные свидетельствуют о том, что значительное снижение вяз- кости липидной фазы мембраны обусловливает канцерогенез. При старении вязкость увеличивается. Высокая подвижность липидных молекул обусловливает латеральную (боковую) диффузию - хаотическое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии расположенные рядом молекулы липидов скачком меняются местами и таким образом молекула перемещается вдоль поверхности мембраны. Среднее квадратичное переме- щение молекул при диффузии за время t можно оценить по формуле Эйн- штейна: Dt S кв 2 , где D – коэффициент латеральной диффузии. Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t оп- ределено экспериментальным методом флуоресцентных меток. Оказалось, 42 что среднее квадратичное перемещение за секунду фосфолипидной моле- кулы по поверхности мембраны эритроцита составило около 5 мкм, что сравнимо с размерами клеток, т.е. за секунду молекула может обежать всю поверхность небольшой клетки. Для белковых молекул S кв составляет около 0,2 мкм/с. Рассчитанные по формуле Эйнштейна коэффициенты латеральной диффузии для липидов D лип = 6∙10 -12 м 2 /с, и D б = 10 -14 м 2 /с для белков. Частота перескоков молекулы вследствие латеральной диффузии мо- жет быть найдена по формуле f D 3 2 , где f – площадь, занимаемая одной молекулой в мембране. Для молекул фосфолипидов f ≈ 7∙10 -19 м 2 , ν ≈ 3 ∙10 7 с -1 . Каждая молеку- ла, таким образом, в среднем претерпевает десятки миллионов перестановок в плоскости мембраны за секунду с характерным временем одного перескока τ =10 -7 -10 -8 с. Флип-флоп – диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны. Методом спиновых меток на модельных липидных мембранах было установлено, что перескоки молекул с одной поверхности бислоя на другую (флип-флоп) совершаются значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Среднее время, через которое фосфолипидная молекула совершает флип-флоп переход, около одного часа, что в десятки миллиардов раз больше среднего времени, характерного для перескока мо- лекулы из одного места в соседнее в плоскости мембраны. Сочетание быстрой диффузии молекул вдоль мембраны и очень мед- ленной диффузии поперек мембраны имеет большое значение для функцио- нирования мембран, а именно для матричной функции мембраны. Благодаря затрудненному переходу поперек мембраны поддерживается упорядочен- ность в молекулярной структуре мембраны, ее анизотропия, асимметрия (от- носительно плоскости мембраны) расположения липидных и белковых мо- лекул, определенная ориентация белков-ферментов поперек мембраны. Это 43 имеет большое значение, например, для направленного переноса веществ через мембрану. 4.3 Физическое состояние и фазовые переходы липидов в мембранах Липидные бислойные мембраны при физиологических условиях - жидкие, время оседлой жизни фосфолипидных молекул в мембране мало - 10 -7 -10 -8 с. Вместе с тем, молекулы в мембране размещены не беспорядочно - в их расположении наблюдается дальний порядок. Фосфолипидные молеку- лы находятся в двойном слое, а их гидрофобные хвосты приблизительно па- раллельны друг другу. Есть порядок и в ориентации полярных гидрофиль- ных голов. Физическое состояние, при котором есть дальний порядок во взаимной ориентации и расположении молекул, но агрегатное состояние жидкое, на- зывается жидкокристаллическим состоянием. Жидкие кристаллы могут об- разовываться не во всех веществах, а в веществах из длинных молекул (по- перечные размеры которых меньше продольных). Известны следующие ви- ды жидкокристаллических структур: 1) нематическая (нитевидная) – длинные молекулы ориентированы па- раллельно друг другу; 2) смектическая (мылообразная) – молекулы параллельны друг другу и располагаются слоями; 3) холестерическая – молекулы располагаются параллельно друг другу в одной плоскости, но в разных плоскостях ориентации молекул разные. Бислойная липидная фаза биологических мембран соответствует смек- тическому жидкокристаллическому состоянию. Жидкокристаллические структуры очень чувствительны к изменению температуры, давления, химического состава, электрическому полю. Это оп- ределяет изменение структуры липидных бислойных мембран при различ- 44 ных изменениях внешних условий или химического состава. При определен- ных температурах происходит фазовый переход первого рода. В частности, при понижении температуры в фосфолипидной мембране происходит пере- ход из жидкокристаллического в гель-состояние, которое условно иногда на- зывают твердокристаллическим. В гель-состоянии молекулы расположены еще более упорядочено. Все гидрофобные хвосты фосфолипидных молекул в гель-фазе полностью вытянуты строго параллельно друг другу. Поэтому толщина мембраны в гель-фазе больше, чем в жидком кристалле. Однако при переходе вещества из твердого состояния в жидкокристал- лическое, несколько увеличивается объем, так как возрастает площадь мем- браны, приходящаяся на одну молекулу. Поскольку в твердокристалличе- ском состоянии больше порядок, чем в жидком кристалле, ему соответствует меньшая энтропия. Для нормального функционирования мембрана должна быть в жид- кокристаллическом состоянии. Поэтому в живых системах при продолжи- тельном понижении температуры окружающей среды наблюдается адапта- ционное изменение химического состава мембран, обеспечивающее пони- жение температуры фазового перехода. Температура фазового перехода по- нижается при увеличении числа ненасыщенных связей в жирнокислотных хвостах. В хвосте молекулы может быть до четырех ненасыщенных связей. В зависимости от химического состава липидных мембран температура фа- зового перехода гель – жидкий кристалл меняться от минус 20 о С (для мем- бран из ненасыщенных липидов) до +60 о С (для насыщенных липидов). 4.4 Модельные липидные мембраны Липосомы(фосфолипидные везикулы) получают обычно при набуха- нии сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембра- ны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мем- браны, и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды. 45 Чаще получаются несферические липосомы, состоящие из нескольких бимо- лекулярных слоёв – многослойные липосомы. Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Однослойные липо- сомы можно получить из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточ- ных мембран. Липосомы нашли непосредственное применение в медицине. Напри- мер, можно заключить внутрь липосом лекарственный препарат и использо- вать как фосфолипидную микрокапсулу для доставки лекарства в опреде- ленные органы и ткани. Липосомы не токсичны (при правильном подборе липидов), полностью усваиваются организмом, способны преодолевать не- которые биологические барьеры. Так, инсулин, заключенный в липосому, защищен от действия пищеварительных ферментов. В настоящее время вы- ясняется возможность вводить этот препарат в липосомах перорально, что может избавить больных диабетом от необходимости систематических уко- лов. Проводятся работы по разработке методов липосомальной терапии опу- холей, ферментативной недостаточности, атеросклероза. Изучается возмож- ность прицельной доставки лекарственного препарата, заключенного в липо- сомах, к больному органу или даже к больному участку (в частности, к по- раженному участку сердца). Плоские бислойные липидные мембраны– другой тип модельных мем- бран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластине из фторопласта, погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липидов (в спирте, хлороформе, гептане). Раствори- тель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка ли- пида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимо- лекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка у краев отверстия. 46 Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широко исполь- зуются в качестве моделей для изучения электрических свойств мембраны, их проницаемости и других научных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, и моделируют био- логический транспорт, вводя в мембрану молекулы-переносчики. |