паразитология. Паразитология и природная очаговость болезней. Лекция 15. Трансмиссивные и природноочаговые заболевания на территории Беларуси Лекция 16. Ветеринарносанитарные мероприятия по борьбе с возбудителями паразитарных
 Скачать 1.84 Mb.
|
|
5 Трихинелез, патогенез, клиника, эпидемиология и профилактика. Трихинеллез - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личинками Trichinella spiralis, и характеризующийся острым течением, лихорадкой, выраженными аллергическими проявлениями и поражением поперечно-полосатой мускулатуры. При тяжелом течении болезнь осложняется миокардитом, очаговым или диффузным поражением легких, центральной нервной системы, системными сосудистыми поражениями. Этиология, жизненный цикл. Возбудитель трихинеллеза - круглый червь Trichinella spiralis (реже заболевание вызывают T.nativa и T.pseudospiralis). Половозрелые трихинеллы (самки длиной до 2-4мм, самцы 1-2 мм) располагаются в слизистой оболочке тонкой кишки, частично свободно свисая в ее просвет. После оплодотворения самок самцы погибают. Самки живородящие, находятся в тонкой кишке в течение 3-4 недель, при массивных инвазиях - до 5-6 недель. За это время одна самка отрождает от 200 до 2000 личинок, размером около 0,1 мм. Миграция личинок начинается на 6-й день после заражения. Личинки через лимфо- и кровоток разносятся по всему организму и оседают в поперечно-полосатых мышцах. Там они увеличиваются в размерах до 0,8-1 мм, начинают свертываться спиралью. К 3-4-й неделям вокруг личинок формируется фиброзная капсула, которая постепенно импрегнируется солями кальция. Однако и в кальцинированных капсулах личинки могут оставаться жизнеспособны- ми в течение многих лет. Если мясо с инвазионными личинками будет съедено одним из многочисленных хозяев трихинелл (человек, свинья, крыса и др.), личинки трихинелл освобождаются от капсулы и затем проникают в наружный слой слизистой оболочки тонкой кишки. В течение двух суток происходит их созревание и оплодотворение. Таким образом, один и тот же организм теплокровного животного служит для трихинелл сначала окончательным (дефинитивным), а затем промежуточным хозяином. 103 Эпидемиология. Трихинеллез - природно-очаговый биогельминтоз. Источником инвазии для человека служат пораженные трихинеллами домашние и дикие животные. Путь заражения пероральный. Заражение трихинеллезом происходит при употреблении в пищу сырого или недостаточно термически обработанного мяса, инвазированного личинками трихинелл. Источником заражения человека в синантропных очагах трихинеллеза являются свиньи. Круговорот инвазии происходит между свиньями, собаками, кошками и домовыми грызунами, могут включаться и дикие грызуны. Источниками заражения трихинеллезом человека в природных очагах чаще всего являются дикие кабаны, бурые медведи, барсуки, морские млекопитающие - моржи, тюлени. Рис. 19. Схема путей распространения трихинеллеза (в синантропном (А) и в природном (Б) очагах (по Ю. А. Березанцеву, 1961) В круговорот инвазии в дикой природе также включаются более мелкие хищники и грызуны. Четких границ между природными и синантропными очагами трихинеллеза не существует, так как часто происходит обмен возбудителями между домашними и дикими животными, в результате чего формируются очаги смешанного типа (рис.19). Личинки трихинелл, находящиеся в мышцах животных, очень устойчивы к действию неблагоприятных факторов среды. Они 104 сохраняют жизнеспособность при температуре -12°С в течение 57 дней, а при температуре -15°С погибают лишь через 15 дней. При солении и копчении мяса личинки гибнут только в поверхностных его слоях. Гибель личинок наступает при температуре 70°С, но следует учитывать, что при варке и жарении мяса в глубине больших кусков температура поднимается недостаточно высоко и личинки могут остаться живыми. При варке куска мяса толщиной 8 см и более все личинки трихинелл погибают лишь через 2-2,5 часа. Таким образом, заразиться трихинеллезом можно при употреблении не только сырого, но и недостаточно проваренного или прожаренного, а также соленого и копченого мяса. Стойкие синантропные очаги трихинеллеза отмечаются в районах с развитым свиноводством, где свинина составляет основу мясной части рациона населения и традиционно в пищу употребляется значительное количество сала (шпиг). В свином сале часто содержатся прожилки мы- шечных волокон, в которых могут находиться живые личинки трихинелл, так как концентрация соли в шпиге бывает недостаточной для их гибели. Стойкие очаги трихинеллеза известны в Беларуси, Литве, Молдове, в правобережных областях Украины, на Северном Кавказе, в некоторых центральных областях европейской части России. В этих очагах ежегодно отмечаются спорадические случаи трихинеллеза, а иногда и локальные, в основном семейные вспышки. Длительность инкубационного периода при трихинеллезе в среднем 2-5 нед после заражения. Первыми признаками болезни являются внезапный подъем температуры, сопровождающийся отеком лица и мышечными болями, повышением уровня эозинофилов в крови. Нередко наблюдается легочный синдром - сухой кашель, иногда с астматическим компонентом и летучими инфильтратами в легких. При интенсивной инвазии могут возникать боли в животе, диарея. Тошнота, рвота появляются только при тяжелом течении болезни. При трихинеллезе наблюдается подъем температуры, выраженные аллергические явления (одутловатость или отек лица), нередко зудящие кожные высыпания, интенсивные мышечные боли, эозинофилия и лейкоцитоз; при тяжелых формах трихинеллеза - поражение сердца, легких, ЦНС, иногда кишечника. Диагностика. Биопсия икроножной мышцы. Профилактика. Основные меры профилактики трихинеллеза состоят в выполнении ветеринарных мероприятий: предотвращение поедания свиньями трупов грызунов и других животных; обязательное исследование на трихинеллез туш всех забиваемых свиней и недопущение в пищу свинины, не прошедшей ветеринарно-санитарный 105 контроль. Исследование мяса на зараженность личинками трихинелл проводятся методом микроскопии на трихинеллоскопе с использованием компрессориума. Актуальна санитарно- просветительная работа для ознакомления населения с путями передачи трихинеллеза и методами личной и общественной профилактики. При соблюдении этих мер профилактики заболевания людей отмечаются очень редко, даже на территориях с высоким риском заражения. ЛЕКЦИЯ 8. МЕТОДИКА ГЕЛЬМИНТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1 Простые методы копрологических исследований. 2 Специальные методы исследлваний. 1 Простые методы копрологических исследований. Диагностика гельминтозов включает в себя осмотр и опрос больного, исследование фекалий, дуоденального содержимого, мокроты, мочи, крови на наличие гельминтов, их фрагментов, личинок или яиц, а также использование серологических и инструментальных методов диагностики Так как большинство гельминтов человека паразитирует в желудочно-кишечном тракте, чаще всего используются копрологические методы диагностики (исследование испражнений). Копрологические методы: Простые: Макроскопический (обнаружение в кале отошедших гельминтов или их фрагментов), Макроскопический (обнаружение в кале отошедших гельминтов или их фрагментов) Микроскопические (нативный мазок на предметном стекле; большой нативный мазок на стекле 6х9 см , метод закручивания (по Шульману), метод мазка под целлофаном по Като) Методы всплывания (флотации): Метод Фюллеборна Метод Калантарян Метод всплывания с просмотром пленки под бинокулярным микроскопом Методы осаждения или седиментации: Метод Горячева Метод Телеманна Метод Красильникова 106 Метод Эфир-формалинового осаждения Химикоседиментационный метод исследования на яйца трематод Универсальный метод эфир-уксусного осаждения При направлении в лабораторию кала по медицинским показаниям врач должен указать, откуда приехал больной и на выявление яиц каких гельминтов следует обратить особое внимание. Учитывая эти данные, выбирают методику исследования. При подозрении на наличие гельминтов в пищеварительном тракте и отрицательном результате лабораторного анализа кала его следует повторить еще дважды с интервалом 1-2 дня. Желательно количественное определение яиц в кале, что имеет значение для определения интенсивности инвазии и учета эффективности терапии (например, описторхоза). При обнаружении в препарате яиц какого-либо одного гельминта исследование должно быть продолжено, так как иногда может быть обнаружена множественная инвазия. В кале человека могут находиться неразвивающиеся транзитные яйца, преимущественно фасциолы и дикроцелиума, попадающие туда при употреблении в пищу пораженной печени скота. Кал для анализа должен быть доставлен не позже, чем через сутки после его выделения, а при подозрении на стронгилоидоз, т. е. для обнаружения личинок, - немедленно. При нарушении этого правила постановка диагноза в связи с разрушением яиц или личинок нередко становится трудной или невозможной. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПРАЖНЕНИЙ Простые методы Макроскопический метод. При осмотре фекалий можно обнаружить гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы, выделяющиеся самостоятельно или после дегельминтизации. Этот метод особенно рекомендуется для выявления энтеробиоза, тениоза и тениаринхоза. Небольшие порции кала перемешивают с водой в плоской ванночке или в чашке Петри и, просматривая при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой, извлекают гельминтов и все подозрительные образования белого цвета пинцетом или пипеткой. Собранное переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения. При методе отстаивания всю исследуемую порцию фекалий следует размешать с водой в стеклянном цилиндре, затем осторожно 107 слить верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают небольшими порциями в стеклянной ванночке или чашке Петри, как было указано выше. Микроскопические методы - основной способ исследования фекалий для обнаружения яиц или личинок гельминтов. Различные методы исследования описаны ниже. С целью повышения достоверности обследования анализы могут быть повторены несколько раз ежедневно или с промежутком в 1-3 дня. Метод нативного мазка. Нативный мазок - наиболее распространенный и технически доступный метод исследования фекалий. В нативном мазке можно обнаружить яйца и личинки гельминтов всех видов. Однако при небольшом числе яиц в испражнениях их не всегда удается найти. Поэтому исследование кала только при помощи нативного мазка не является полноценным и должно дополняться методами обогащения. Эффективность исследования нативного мазка заметно повышается при просмотре четырех препаратов, приготовленных из пробы кала на двух предметных стеклах без покрытия покровными стеклами, что позволяет исследовать в общей сложности примерно такое же количество кала, как и по методу Като (см. ниже). Небольшое количество (величиной со спичечную головку) размешанного кала тонко размазывают деревянной палочкой на поверхности предметного стекла в капле 50%-го раствора глицерина. Обычно на одном стекле готовят два мазка. Мазок просматривают под малым увеличением микроскопа (об. 8, ок. 7). В сомнительных случаях его накрывают покровным стеклом и исследуют под большим увеличением (об. 40). Для приготовления большого нативного мазка 200-300 мг кала (размером с крупную горошину) растирают на стекле размером 6х9 см в 15-20 каплях 50%-го водного раствора глицерина. Просматривают под бинокулярным стереоскопическим микроскопом (об. 4, ок. 12,5 или об. 2, ок. 17) в проходящем свете без покровных стекол. В сомнительных случаях можно переводить объектив на большее увеличение. В таких мазках хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже – прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден. Вместе с тем большой объем исследуемого материала и большое поле зрения при высокой глубине резкости обеспечивают значительную эффективность указанной модификации по сравнению с обычным нативным мазком. Толстый мазок с целлофаном (метод Като) более эффективен, чем изучение нативного мазка, но также требует сочетания с методами 108 обогащения. Выявляются яйца всех видов гельминтов, однако с целью обнаружения яиц карликового цепня (яйца прозрачные) или описторха (мелкие яйца) лаборант должен быть особо внимательным, чтобы их не пропустить (рис.21). Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Предварительно гидрофильный целлофан нарезают пластинками размером 20 х 40 мм и погружают в смесь Като (6 мл 3%- го водного раствора малахитового зеленого, 500 мл глицерина, 500 мл 6%-го раствора фенола). 3-5 мл смеси хватает на 100 пластинок, которые готовы к использованию через сутки и могут храниться в этой же смеси в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре в течение 6 мес. При отсутствии малахитового зеленого (рекомендуется для уменьшения утомляемости глаз лаборанта) и фенола (дезинфицирующее средство) можно пользоваться только 50%-м водным раствором глицерина, эффективность исследования не снижается. Рис. 20. Методика приготовления толстого мазка кала с целлофаном по Като 100 мг испражнений наносят на предметное стекло, покрывают обработанной, как указано выше, пластинкой целлофана и придавливают резиновой пробкой так, чтобы испражнения не растекались из-под целлофана. Микроскопирование при малом или большом увеличении микроскопа проводят не позже, чем через 1 час (в жаркую погоду - 30-40 мин) после приготовления мазка. Причиной непрозрачности препарата могут быть толстый слой фекалий, плохая обработка пластинки в смеси Като, недостаточный срок выдержки препарата под целлофаном. Длительное просветление глицерином и чрезмерное высыхание препарата также затрудняют обнаружение яиц. Метод закручивания по С.С. Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоида. Исследуют только свежевыделенные фекалии, 2-3 г которых переносят в стеклянную банку, размешивают стеклянной палочкой круговыми движениями с 3-5-кратным количеством физиологического раствора, не касаясь стенок сосуда. Яйца и личинки гельминтов скапливаются в центре. После окончания перемешивания 109 каплю на конце палочки быстро переносят на предметное стекло, закрывают ее покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Методы обогащения. Методы обогащения основаны на разности удельного веса яиц и применяемого солевого раствора, что позволяет обнаружить их небольшое количество. Если удельный вес яиц больше удельного веса жидкости, то яйца концентрируются в осадке, который исследуют под микроскопом. Этот метод седиментации (осаждения) применяют для яиц трематод. При большем удельном весе раствора яйца всплывают на поверхность жидкости, и тогда исследуют пленку. Это методы флотации (всплывания), они наиболее эффективны для обнаружения яиц анкилостомид, власоглава и карликового цепня. Методы флотации. Метод Фюллеборна основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия, имеющем высокую относительную плотность (1,2), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка, хотя и сложнее. Достоинствами метода являются дешевизна и доступность. Рекомендуется сочетать изучение нативного мазка и метода Фюллеборна. Насыщенный раствор готовят, растворяя 400 г хлорида натрия в 1 л воды при кипячении. Относительная плотность раствора 1,18-1,22. Раствор хранят в закрытой бутыли. Для проведения анализа в банку объемом 30-50 мл помещают 2-3 г испражнений и при помешивании палочкой доливают почти доверху насыщенный раствор хлорида натрия. Полоской бумаги быстро удаляют всплывшие крупные частицы. Через 45-60 мин. отстаивания проволочной петлей снимают поверхностную пленку и переносят ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина. Вместо снятия пленки петлей можно долить раствор в банке доверху, накрыть предметным стеклом, к поверхности которого пристают всплывшие яйца. Готовят несколько препаратов. Дополнительно просматривают 2-4 препарата из осадка, набирая его глазной пипеткой на 2 предметных стекла. Помимо поверхностной пленки, необходимо обязательно исследовать также и осадок, поскольку яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Яйца ряда гельминтов всплывают в соленом растворе не сразу. Так, если максимальное число яиц карликового цепня всплывает через 15-20 мин, то аскарид - через 1,5-2 ч, власоглава - через 2-3 ч. Таким образом, к достоинствам этого метода относится его дешевизна и доступность, к недостаткам - необходимость просмотра препаратов на поверхностной пленки и осадка, а также длительность отстаивания. 110 Метод Е. В. Калантарян также является методом обогащения, но более эффективен и проще, чем метод Фюллеборна. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке, исследование осадка не требуется. Для приготовления насыщенного раствора нитрата натрия 1 кг соли нитрата натрия (натриевой селитры) растворяют в 1 л воды и кипятят до полного растворения и образования на поверхности пленки. Без фильтрования переливают в сухую бутыль. При отсутствии нитрата натрия его можно заменить нитратом аммония (аммиачная селитра), растворяя 1,7 кг на 1 л воды. Относительная плотность полученного раствора 1,3, что несколько снижает эффективность по сравнению с раствором нитрата натрия. Достоинства метода: быстро всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке яйца большинства гельминтов, что исключает необходимость исследования осадка. Недостатками метода являются дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке. Необходимо учитывать, что при длительном (более 1-2 ч) выдерживании фекалий в растворе яйца некоторых гельминтов начинают набухать и оседают, исчезая из поверхностной пленки. Методы седиментации Метод П. П. Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, без грубой примеси, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод (описторха и др.). Удельный вес яиц описторха высок, поэтому они не всплывают в солевых растворах. В цилиндр диаметром 2-3 см наливают 70-100 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Отдельно тщательно размешивают 0,5 г испражнений в 20-25 мл воды и осторожно фильтруют через воронку с двумя слоями марли в цилиндр на солевой раствор, избегая перемешивания (так, чтобы образовалось два четко разграниченных слоя). Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют стоять на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок пипеткой переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метод Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуют методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые. 111 Метод Красильникова. Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав моющих средств (детергентов), яйца гельминтов освобождаются от испражнений и концентрируются в осадке. Предварительно готовят 1%-й раствор стирального порошка «Лотос». Для этого 10 г порошка растворяют в 1 л водопроводной воды. При отсутствии «Лотоса» можно использовать и другие стиральные порошки, но каждого из них нужно брать столько, сколько растворится без образования осадка в 1 л водопроводной воды. В стеклянный сосуд емкостью 30-50 мл наливают 20-30 мл раствора детергента, туда же помещают небольшую порцию испражнений и хорошо перемешивают. Соотношение испражнений и раствора должно быть примерно 1:20. Испражнения должны находиться в растворе не менее суток. За это время на дне образуется осадок из 2-3-х слоев. Нижний слой состоит из грубых тяжелых частиц, в среднем слое собираются яйца гельминтов, верхний слой представляет собой беловато-серые хлопья. Затем пипеткой набирают 2-3 капли жидкости из среднего слоя и переносят на предметное стекло. На одном стекле готовят 2 препарата, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Метод Красильникова позволяет обнаружить яйца всех видов гельминтов, выделяемые с испражнениями. Эфир-формалиновый метод седиментации и химикоседиментационный метод при высокой эффективности весьма трудоемки, особенно при массовых обследованиях, в связи с этим целесообразнее использовать эфир-уксусный метод. Он позволяет после дополнительной обработки осадка химреактивами получить в нем практически только яйца гельминтов, что облегчает выявление мелких яиц трематод. Этот метод оказался универсальным, выявляющим яйца всех кишечных гельминтов, цисты кишечных простейших, он также может использоваться для количественной оценки интенсивности инвазии. В центрифужные градуированные пробирки наливают 7 мл 10%-го раствора уксусной кислоты и добавляют 1 г фекалий до отметки 8 мл. Фекалий и тщательно перемешивают палочкой до образования однородной смеси, а затем процеживают через два слоя марли в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 8 мл, если меньше, то дополнительно можно ополоснуть 10% раствором уксусной кислоты воронку с бинтом, через которые процеживали раствор фекалий). В эту пробирку добавляют 2 мл эфира (до метки 10 мл), закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 30 сек. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 минуты (или 2 минуты при 1500 об/мин). Слой коагулянта 112 (в виде пробки в верхней части пробирки) палочкой отделяют от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью осторожно сливают. Осадок (как правило, небольшой, бесцветный) наносят на предметные стекла пипеткой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. 2 Специальные методы исследлваний. Различают Паразитологические Метод опроса Исследование перианального соскоба Исследование кала на наличие живых личинок (метод Бермана) Исследование дуоденального содержимого Исследование мочи Исследование мокроты Исследование крови Биологическая проба Биопсия Серологические Исследование на эхинококкозы Исследование на трихинеллез Исследование на цистицеркоз Исследование на описторхоз Исследование на токсокароз Инструментальные: Рентгенологические (рентгенография, томография, спленопортография и др.) Ультразвуковое исследование Радиоизотопные методы Эндоскопические методы Метод опроса. Клинические проявления большинства гельминтозов, как правило, неспецифичны, что не позволяет в большинстве случаев диагностировать их клинически. При опросе больного необходимо спросить, не замечал ли он в выделяемых фекалиях посторонних включений. Это могут быть членики или фрагменты стробилы крупных цестод, а также аскариды и самки остриц при массивной инвазии. Для дифференциальной диагностики тениоза и тениаринхоза необходимо уточнить, имелись ли факты активного выползания члеников гельминтов вне акта дефекации. Обычно в таком случае больные обнаруживают членики на постели или белье, притом практически ежедневно, что позволяет ставить диагноз «тениаринхоз» даже без лабораторного подтверждения. Часто больные гельминтозами ведут себя не вполне адекватно, что требует дифференциальной диагностики с психическими расстройствами. И наоборот, у психически 113 больных могут появиться навязчивые идеи о наличии гельминтоза, тогда как лабораторные исследования его не выявляют. Исследование перианального соскоба. Для выявления яиц остриц, а также яиц бычьего цепня, применяют специальные методы исследования, которые основаны на микроскопии перианального соскоба или смыва. Процедуру эту проводят утром, до дефекации (у женщин - и до мочеиспускания), или вечером, через 2-3 ч после того, как пациент лег спать. У детей нередко проводят соскоб после дневного сна. Соскоб с перианальных складок тампоном. Ватным тампоном, туго намотанным на деревянную палочку и смоченным 50% водным раствором глицерина, осторожно производят соскабливание, вернее смыв, с перианальных складок, захватывая границу слизистой оболочки в пределах ануса. Затем палочку с тампоном помещают в небольшую сухую пробирку или флакон и доставляют в лабораторию. В лаборатории тампон смывают поочередно в 1-2 каплях 50% водного раствора глицерина. Готовят 4 препарата на двух предметных стеклах. Этот метод получил большое распространение благодаря удобству и простоте применения. Метод липкой ленты (метод Грэхема). Высокоэффективный метод выявления яиц остриц. С этой целью используют прозрачные бесцветные ленты с липким слоем (типа «скотч»). Помимо яиц остриц, этим методом можно обнаружить онкосферы тениид. Кусочек ленты длиной 4-5 см липким слоем прикладывают к перианальным складкам, сразу же снимают и приклеивают на предметное стекло. Полученные таким образом препараты микроскопируют. Преимущество этого метода перед соскобом с перианальных складок заключается в быстроте и возможности довольно долгого хранения препаратов. Разработано несколько модификаций метода липкой ленты, улучшающих его диагностические и гигиенические свойства. В их числе разработанное сотрудниками Гомельского государственного университета устройство для обследования на энтеробиоз (Е. М. Бутенкова, Н. Н. Острейко, 2004; Патент ВУ, МПК А61В 10/00, № 1655). Выявляемость энтеробиоза значительно возрастает при многократном обследовании. Метод технически прост, позволяет выявить даже единичные яйца, но требует тщательного соблюдения личной гигиены. Исследование кала на наличие живых личинок (прежде всего, стронгилоида) можно проводить методом закручивания по Е. С. Шульману, или обнаруживать их при просмотре больших нативных мазков на стекле 6х9 см под микроскопом. Однако чаще используют 114 метод Бермана, который основан на способности личинок гельминтов мигрировать по направлению к теплу, и служит для их выявления в фекалиях, в первую очередь при подозрении на сгронгилоидоз. Для этого 20-50 г фекалий на металлической сетке помещают в верхнюю часть стеклянной воронки, укрепленной в штативе. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом. В воронку наливают воду (подогретую до 40-50°С), с которой соприкасается нижняя часть сетки с калом. Личинки выходят из кала в воду и скапливаются в трубке перед зажимом. Оставляют на 3-4 часа при комнатной температуре. В условиях жарких стран поверх фекалий на сетку можно положить кусочек льда, время отстаивания сократить до 1 часа. Затем открывают зажим и выпускают в центрифужную пробирку 10-15 мл жидкости. После центрифугирования в течение 1-2 мин при 1000 оборотах в минуту осадок исследуют под микроскопом с целью обнаружения подвижных личинок стронгилид. Обнаружение личинок гельминтов в фекалиях культивированием на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори). Метод разработан японскими учеными Харада и Мори и рекомендован ВОЗ для исследования на анкилостомидозы. Культивирование личинок рекомендуется проводить в остаточных очагах анкилостомидозов и при необходимости отличить анкилостомоз и некатороз. Метод основан на том, что в тепле на влажной фильтровальной бумаге из яиц анкилостомид развиваются филяриевидные личинки, которые легко можно обнаружить. Рис. 21. Культивирование личинок анкилостомид на листе фильтровальной бумаги в пробирке по методу Харада и Мори (по Д. Е. Генис, 1991). 1 - пробка, закрепляющая бумажную полоску; 2 - бумажная полоска; 3 – проба фекалий, нанесенная на полоску; 4 - вода На полоску фильтровальной бумаги размером 15х 1,5 см наносят 0,5 г фекалий, оставляя оба конца полоски чистыми. Бумагу с фекалиями помещают в пробирку, заполненную водой так, чтобы нижний конец полоски, свободный от фекалий, был погружен в воду, а другой чистый конец мог бы быть закреплен пробкой (рис. 21). 115 Пробирку выдерживают в термостате при температуре 28°С в течение 5-6 дней. В теплое время года можно оставить пробирки при комнатной температуре на 8-10 дней. Филяриевидные личинки, развившиеся за это время, спускаются и оседают на дне. По окончании инкубации бумагу извлекают и уничтожают, а жидкость исследуют под лупой. В сомнительных случаях жидкость центрифугируют и осадок микроскопируют, убив предварительно личинки нагреванием жидкости в пробирке при температуре 60°С. Лаборант должен работать в резиновых перчатках, чтобы избежать проникновения инзионных личинок через кожу. По строению личинок можно дифференцировать анкилостомоз и некатороз. Исследование дуоденального содержимого. Яйца и личинки гельминтов, паразитирующих в печени, желчном пузыре, поджелудочной железе (описторхоз, клонорхоз, фасциолез, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишке (стронгилоидоз, анкилостомид озы), могут быть обнаружены в дуоденальном содержимом и желчи, полученных при дуоденальном зондировании. Исследование мочи. С целью обнаружения яиц шистосом мочу в объеме не менее 50 мл, собранную в середине дня, помещают в конический стакан. Отстоявшуюся в банке мочу через 30 мин осторожно сливают, а осадок центрифугируют. В осадке определяют яйца возбудителя мочеполового шистосомоза. Исследование крови. В толстых каплях и мазках, окрашенных по Романовскому, определяют личинки филярий (микрофилярии). Кровь для анализа необходимо брать не только днем, но и ночью, так как при некоторых тропических филяриидозах личинки в крови можно обнаружить только в ночное время. Исследование мокроты. В мокроте, нанесенной на предметное стекло, определяют яйца легочного сосальщика (парагонима), личинки аскариды, стронгилоида и некатора, элементы эхинококкового пузыря. Исследование мышечной ткани (трихинеллоскопия). При подозрении на трихинеллез исследуют мышцы трупа, а также остатки мяса, предположительно послужившего причиной заражения человека. Биопсия мышц больного с целью диагностики в настоящее время не применяется. С целью трихинеллоскопии мышцу разрезают на очень мелкие кусочки и помещают в компрессорий. Он представляет собой два широких толстых стекла, скрепляемых по типу пресса двумя винтами. Волокна мышц в нем при сдавливании располагаются тонким слоем и хорошо просвечивают при исследовании под малым увеличением микроскопа (трихинеллоскопа). Личинок трихинелл 116 обнаруживают в виде спиралевидно свернутых червячков, находящихся в лимонообразных или округлых капсулах внутри мышечных волокон. Серологические методы исследования Иммунологические исследования сыворотки крови применяются для диагностики, как правило, тяжелых тканевых гельминтозов (эхинококкоз, альвеококкоз, трихинеллез, цистицеркоз, токсокароз) и трематодозов (описторхоз, клонорхоз, фасциолез). Все перечисленные гельминтозы выявляются иммуноферментным анализом; реакцией непрямой гемагглютинации (РНГА) - описторхоз, эхинококкоз, альвеококкоз, трихинеллез; реакцией латекс-агглютинации (РЛА) - эхинококкоз, альвеококкоз; реакцией кольцепреципитации (РКП) - цистицеркоз, трихинеллез. Для диагностики трихинеллеза применяют реакцию микропреципитации живых личинок трихинелл. Эти методы особо ценны, когда наличие паразита в организме другими более доступными путями доказать не удается. Следует, однако, учитывать, что серологические реакции не являются абсолютным показателем наличия или отсутствия паразита, что обусловлено и состоянием иммунитета, и спецификой той или иной реакции. ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ ПРИ МИКРОСКОПИИ ИСПРАЖНЕНИЙ При микроскопии испражнений встречаются образования, напоминающие яйца гельминтов и их личинки. Так, иногда пузырьки воздуха принимают за онкосферы тениид. Пузырьки - круглые, толщина «оболочки» и диаметр их различны, внутренняя часть совершенно прозрачна и лишена структуры, ободок черного цвета. Жировые капли также отличаются разнообразием размеров и бесструктурностью, хотя некоторые своей продолговатой формой могут напоминать яйца остриц. Более сложной является дифференциация растительных клеток, спор и пыльцы растений, пищевых частиц и других возможных включений. Растительные волоски могут быть приняты за личинок гельминтов. Указанные включения и частицы могут содержаться в испражнениях, а также попасть в них извне. Во всех сомнительных случаях необходимо учитывать размер, строение оболочек, цвет и морфологию обнаруженных образований, в случае необходимости проводить повторные анализы. Для яиц гельминтов характерна определенная морфологическая структура. Все они имеют оболочку определенного строения, отличающую их от сходных образований, попавших в кал. Яйца гельминтов могут содержать яйцеклетку, развитые личинки или желточные клетки. Яйца 117 каждого вида гельминтов имеют свои постоянные размеры. Для извлечения гельминтов обычно применяют следующие методы. Поверхностный осмотр полостей тела и органов. При вскрытии животных (особенно диких) часто обнаруживаются личиночные стадии цестод, имеющих вид пузырей разного размера. Эти пузыри располагаются чаще всего на печени, легких, диафрагме и на серозных оболочках. В мышцах и подкожной клетчатке при осмотре также могут быть найдены личинки цестод (плероцеркоиды, спарганы, цистицеркоиды) и разные стадии нематод. Внутри органов можно также обнаружить гельминтов. Для этого каждый орган осторожно вскрывают, руководствуясь общими методиками. Такому осмотру нужно подвергать и головной мозг. Метод последовательного промывания дает большую часть гельминтологических сборов. Исследования обычно начинают с кишечника. Его раскладывают, подрезая брыжейку, и разделяют на отделы, накладывая на концы их лигатуры. Затем каждый отдел осторожно вскрывается вдоль и промывается в каком-нибудь сосуде с отстоянной водой (лучше – с физиологическим раствором). Через некоторое время (5-15 минут) тяжелые частицы, в том числе и гельминты, осядут на дно. Надосадочная жидкость осторожно сливается и осадок заливается новой порцией воды. Промывать нужно несколько раз до тех пор, пока жидкость над осадком не будет прозрачной. Осадок (весь или порциями) выливают в чашки Петри или кюветы и просматривают его под увеличением простой лупы или бинокуляра. Найденных гельминтов собирают пинцетом или пипеткой в физиологический раствор. Очень часто нематоды при промывании водой лопаются. Чтобы этого избежать, следует использовать физиологический раствор. Подобным образом поступают с трахеей и легкими, глазными яблоками, печенью, почками, мочевым пузырем и мочеточниками. Печень крупных животных следует вскрыть по желчным и кровеносным сосудам. Печень мелких животных можно разрезать на несколько частей и размять в воде. Промывать при этом приходится много раз. Сердце нужно брать с крупными прилегающими сосудами, которые также необходимо разрезать. В ряде случаев нужно вскрыть и вены брыжейки. После удаления органов нужно промыть всю тушку. Компрессорный метод. Небольшие кусочки мышц, внутренних органов, стенок кишки, соскобы со слизистых оболочек помещают между предметными стеклами, сдавливают и рассматривают под малым увеличением микроскопа. Особенно удобно применять специальные компрессорные стекла и трихинеллоскоп. Ткани с гельминтами далее 118 можно обрабатывать теми же методами, что и гельминтов. Важно, чтобы обрабатываемый кусочек ткани был сплющен (для микроскопии). Обработка гельминтологического материала Хранение в нефиксированном состоянии Сохранение живых гельминтов. Если гельминтов требуется некоторое время сохранить живыми, то их следует поместить в закрытый бюкс с физиологическим раствором (0,8% NaCl). При комнатной температуре черви сохраняются живыми несколько часов. Бюкс можно поставить и в холодильник с невысокой положительной температурой. Вымораживание. Если нет времени быстро зафиксировать материал, то его стоит сохранить в живом виде, либо в замороженном. Замораживать гельминтов в открытой посуде нельзя - они часто высыхают. В морозильную камеру их можно помещать в полиэтиленовом пакете или контейнере. Можно также заморозить пораженный орган, содержащий гельминтов, или его часть. Оттаивание следует проводить осторожно и ни в коем случае нельзя использовать теплую воду. Фиксация подвергнутых заморозке гельминтов проводится по обычной методике. Фиксация гельминтов. Для изготовления микро- и макропрепаратов по гельминтологии используются различные методы фиксации. Если плоского гельминта предполагается окрасить методом Блажина, то фиксация недопустима (см. ниже). Фиксация формалином. Формалиновая фиксация пригодна лишь для приготовления макропрепаратов. Окраска после подобной фиксации получается намного хуже, чем после спиртовой. Гельминтов помещают в 4% раствор формалина (продажный 40% раствор разбавить водопроводной водой в соотношении 1:9). Перед фиксацией гельминтам придают нужное положение. Крупных цестод наматывают (слегка натягивая) на стеклянную пластинку и погружают в фиксатор. Нужно помнить, что формалин сильно дубит препарат и расправить объект после формалиновой фиксации практически невозможно. Фиксация спиртом. Использование спирта допустимо при фиксации плоских червей - сосальщиков и ленточных, а также скребней. Используется 70% этиловый спирт. Сосальщиков и мелких цестод обрабатывают целиком, а крупных цестод предварительно разделяют. Гельминта следует положить на предметное стекло (для мелких объектов удобнее применять покровные), расправить и накрыть другим стеклом, довольно сильно сплющить (но не раздавить) и, обмотав стекла ниткой, поместить на 1-2 часа в спирт. После этого стекла разнимают, а сплющенных червей перекладывают в 70% спирт, где они могут храниться неограниченное время. Особенную трудность 119 представляет фиксация скребней. Часто у них хоботок ввернут внутрь. Чтобы его вывернуть, нужно слегка надавить на передний конец тела. Операция эта проводится под контролем бинокуляра. После того, как хоботок полностью вывернут, кутикулу скребня нужно проколоть тонкой иглой (энтомологической булавкой), затем несильно сплющить между стеклами и зафиксировать в спирте. Весь гельминтологический материал во время фиксации нужно обязательно этикетировать! Черви, особенно крупные, не подвергнутые сплющиванию, зачастую непригодны для изготовления микропрепаратов, так как их очень трудно просветлять. Фиксация нематод жидкостью Барбагалло. Применяется обычно для фиксации и хранения нематод. Приготовление: на 9 частей физиологического раствора добавляют 1 часть 40% раствора формальдегида. Нематоды хорошо хранятся в этом растворе и пригодны для дальнейшего изучения. Гельминтов для изучения просветляют в неразведенной молочной кислоте, приготавливают временные микропрепараты (среда для них - молочная кислота). После изучения нематод промывают водой и помещают в жидкость Барбагалло для дальнейшего хранения. Изготовление макропрепаратов Фиксированный объект (гельминт или пораженный орган) хорошо промывается в воде и привязывается на стеклянную пластину, которая помещается в сосуд подходящего размера. В сосуд заливается обычно 4% формалин или 70% спирт. Сосуд плотно закрывается крышкой и герметизируется. Для герметизации можно с большим успехом применять силиконовые герметики. Использовать металлические крышки для подобных препаратов нельзя, так как металл быстро поражается коррозией. Следует помнить, что такие препараты обязательно снабжаются двумя этикетками. Одну пишут карандашом и помещают внутрь банки, другую - обычную, наклеивают снаружи. Макропрепараты имеют больше музейное и учебное значение, чем научное. Изготовление микропрепаратов Как уже говорилось, для изготовления подобных препаратов плоских червей нужно фиксировать в спирте, круглых - в жидкости Барбагалло. Перед дальнейшей обработкой гельминтов следует отмыть от фиксатора в воде. Для этого их помещают в емкость с водой на 1-5 часов (мелкие объекты на 15-30 минут). Воду можно сменить 1-2 раза. Как правило, из нематод трудно приготовить хорошие постоянные микропрепараты и их изучение ведется на временных препаратах после 120 просветления червей в молочной кислоте. После изучения нематод вновь помещают в жидкость Барбагалло. Окраска гельминтов. В гельминтологии используется в основном два метода окраски плоских червей. Борный и квасцовый кармин являются универсальными красителями, а кармин Блажина не подходит только для окраски сколексов цестод. Окраска борным кармином. Приготовление краски. 2 г борной кислоты растворяют в 50 мл горячей дист. воды, затем туда всыпают 1 г растертого кармина и нагревают на водяной бане 30 минут. После фильтрации добавить равный объем 70% спирта. Окраска квасцовым кармином. Приготовление краски. 1 г кармина и 10 г калийных квасцов растереть в ступке и 30 минут кипятить в 200 мл дисциллированной воды. Затем раствор нужно профильтровать и добавить небольшой кристаллик тимола. Окраска. Объект, отмытый от спирта, помещают в краску: на 5-15 минут в квасцовый кармин или на 1-3 часа в борный. После этого объект ополоснуть водой. Если объект перекрашен, то он помещается в подкисленный 70% спирт (на 100 капель спирта 1 капля крепкой соляной кислоты). В этом растворе происходит удаление излишков краски. Процесс можно контролировать под микроскопом. По достижении оптимальной окраски гельминта перекладывают в чистый 70% спирт, где он может храниться довольно долго. Крупные объекты дополнительно промываются в порции 70% спирта, чтобы удалить всю кислоту. Окраска кармином по Блажину. Этот метод дает исключительно четкую картину анатомического строения плоских червей. В настоящее время этот метод незаслуженно забыт, хотя никаких трудностей не представляет. Особенность этого метода состоит в том, что он не требует предварительной фиксации гельминта. Используется только свежий материал. Подготовка гельминтов. Живые или свежие черви помещаются в дистиллированную или простую воду на срок от 5 часов до 2-3 суток (в зависимости от размера объекта и окружающей температуры). Там происходит их мацерация (набухание). После мацерации гельминты помещаются на 1-12 часов в раствор № 1. Приготовление раствора № 1. 0,3-0,5 г растертого кармина всыпают в 100 мл 30% молочной кислоты и кипятят 20-30 минут. После охлаждения фильтруют. В этом растворе черви окрашиваются в яркий пурпурный цвет. После промывания в воде объекты помещаются в раствор 121 № 2. Приготовление раствора № 2. На 50 мл воды 1-2 капли крепкого раствора треххлористого железа (FeCl 3 ) и 1 каплю крепкой соляной кислоты. В этом растворе черви почернеют за 2-10 минут. Крупные объекты можно оставлять в растворе № 2 до суток. После этого их нужно хорошо промыть в воде и, слегка сплющив между стеклами, поместить в 70% спирт на 2-5 часов или больше. Средние и мелкие объекты можно и не плющить. Можно окрасить целиком стробилу и хранить ее в 70% спирте. Иногда (но далеко не всегда) удовлетворительный результат можно получить при окраске методом Блажина фиксированного материала. Для эгого после отмывания фиксатора (спирта или формалина) в воде, объект помещается в 10-20% раствор КОН. В щелочи объект становится прозрачным и приобретает желтоватый оттенок. Длительность обработки зависит от фиксатора, времени фиксации, толщины объекта и устанавливается опытным путем. После этого объект нужно хорошо промыть в подкисленной воде (для удаления щелочи) и переложить в раствор № 1. Дальнейшая обработка ничем не отличается от таковой свежего объекта. Обезвоживание гельминтов. Хорошее обезвоживание достигается проводкой через ряд спиртов. В практической гельминтологии для этого используются 3 концентрации спирта - 70%, 96% и 100%. Срок обработки гельминта каждой концентрацией зависит от его размеров - от 30 минут до 2-5 часов. Передержка не ухудшает качество материала. В 100% спирте происходит почти полное обезвоживание объекта. Просветление. На этом этапе применяют карбол-ксилол. В этом составе происходит окончательное обезвоживание гельминта. Чтобы избежать деформаций, мелких червей нужно помещать между покровными стеклами, но не сдавливать. В карбол-ксилоле объект нужно держать в зависимости от размера от 15-20 минут до 2-3 часов. Признаком готовности является то, что объект не плавает на поверхности карбол-ксилола, а быстро тонет. Из карбол-ксилола рекомендуется перенести червя в кедровое масло, где он может оставаться долгое время. Заключение в канадский бальзам. Из масла объекты переносят на предметное стекло. Излишки масла удаляют фильтровальной бумагой. На объект наносят каплю канадского бальзама, разведенного ксилолом до консистенции густого меда, и осторожно накрывают покровным стеклом. После этого препарат снабжается этикеткой и должен оставаться в горизонтальном положении не менее года. На ребро такие препараты лучше вообще не ставить. Для изучения средних и крупных цестод удобно, когда на одном стекле расположен сколекс, гермафродитный и зрелый членики. 122 Использование глицерин-желатина в изготовлении препаратов по гельминтологии Глицерин-желатин имеет преимущества перед канадским бальзамом в том, что он несравнимо дешевле, и в том, что изготовление препаратов гораздо проще. Однако главный недостаток его - недолговечность микропрепаратов. Если бальзамные препараты при аккуратном использовании могут служить многие десятки лет (до сих пор используются препараты, изготовленные в конце 19 века), то глицерин-желатиновые быстро (за 5-7 лет) приходят в полную негодность. Особенно это касается учебных препаратов. Тем не менее, многие объекты (яйца гельминтов, мелкие нематоды) могут быть заключены только в глицерин-желатин. Приготовление глицерин-желатина. В 42 мл дистиллированной воды замачивают 7 г желатина. После его набухания добавляют 50 г глицерина и 1 г фенола. Смесь нагревают на водяной бане до образования однородной массы. Горячую смесь фильтруют в термостате через мелкую металлическую сетку в широкогорлук5 баночку и дают ей застыть. Баночку закрынают крышкой для предохранения от пыли. Состав хранится очень долго. Подготовка окрашенных объектов. Окрашенных цестод и трематод после оттягивания излишков краски тщательно промывают в воде и перекладывают в часовое стекло, куда налито немного глицерина. Часовое стекло оставляется на 2-3 суток (при высокой температуре - на сутки). Гельминты пропитываются глицерином и немного просветляются. Их можно хранить в глицерине до момента изготовления препарата. Подготовка яиц гельминтов. Свежие или фиксированные в любом фиксаторе гельминты промываются в воде и помещаются в 30% глицерин в часовом стекле. Для такой обработки у ленточных червей берут зрелые членики (их можно разрезать пополам), у трематод вырезают часть тела, содержащую матку (мелких сосальщиков обрабатывают целиком). У крупных нематод выделяют маточные трубы со зрелыми яйцами. У самок мелких нематод нужно отрезать голову и хвост. Стекло с гельминтами нужно оставить на несколько дней для постепенного испарения воды из глицерина и пропитывания этим веществом материала. Хранить яйца в глицерине можно неограниченно долго. Фекалии, содержащие в большом количестве яйца гельминтов, можно обрабатывать подобным образом. При использовании методов обогащения при гельминтоовоскопии выделенные яйца можно сразу заделывать в глицерин-желатин. Подготовка мелких нематод. Как уже говорилось, нематод лучше хранить в жидкости Барбагалло. Однако иногда возникает 123 необходимость изготовить если не постоянные, то хотя бы длительно хранящиеся микропрепараты мелких нематод. Для этого гельминтов помещают сначала в 20% глицерин, затем в 50%, 75% и, наконец, в чистый глицерин. В каждом растворе нематоды должны находиться не менее 4-5 дней (чем дольше, тем лучше), чтобы вода в полости их тела постепенно заместилась глицерином. Приготовление глицерин-желатиновых препаратов. На покровное стекло из глицерина переносится объект. Если это части гельминтов, содержащие яйца, то их следует предварительно измельчить и на стекле сделать мазок полученной суспензии (контроль под микроскопом.) Далее на середину предметного стекла помещают небольшой кусочек глицерин-желатинового желе (точное количество быстро определяется опытным путем) и стекло осторожно подогревается на электрической лампочке или плитке (на спиртовке менее удобно) до расплавления желе (ни в коем случае не доводить до кипения). Когда глицерин- желатин расплавится, покровное стекло с нанесенными объектами помещается на каплю, естественно, объектом вниз. Желе должно быть столько, чтобы оно не выступало за края покровного стекла, но и чтоб не оставалось под стеклом пузырей воздуха. В первом случае можно осторожно снять лишнее желе с краев стекла, во втором иногда помогает следующий прием - со стороны, где желе не хватает, на границе покровного стекла помещают маленький кусочек глицерин- желатина и осторожно нагревают препарат. Жидкое желе само втянется под стекло. Если требуется изготовить препарат из свежевыделенных яиц гельминтов (методы обогащения), то из солевого раствора на покровное стекло петлей переносится поверхностная пленка с яйцами (обязателен контроль под микроскопом). Далее очень осторожно оттягивается лишняя жидкость, и стекло обычным способом опускается (мазком вниз) в каплю глицерин-желатина на предметное стекло. Препараты снабжаются этикеткой. Через сутки после изготовления для предотвращения высыхания края покровного стекла нужно окантовать клеем БФ, битумным лаком, канадским бальзамом или, наконец, лаком для ногтей. Эта мера удлиняет срок службы таких препаратов. |