паразитология. Паразитология и природная очаговость болезней. Лекция 15. Трансмиссивные и природноочаговые заболевания на территории Беларуси Лекция 16. Ветеринарносанитарные мероприятия по борьбе с возбудителями паразитарных
 Скачать 1.84 Mb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ Учреждение образования «Гомельский государственный университет имени Франциска Скорины» Кафедра зоологии и охраны природы Гомель 2011 2 СОДЕРЖАНИЕ Введение Лекция 1. Паразитология как наука Лекция 2. Иммунитет при инвазиях Лекция 3. Современные достижения генетики в паразитологии Лекция 4. Паразитология микроорганизмов Лекция 5. Паразитические простейшие Лекция 6. Паразитические черви. Биогельминты Лекция 7. Геогельминты Лекция 8. Методика гельминтологических исследований Лекция 9. Кровососущие двукрылые и борьба с ними. Бытовые насекомые Лекция 10. Вши как специфическая группа паразитов теплокровных животных и человека Лекция 11. Блохи и пухоеды как специфическая группа эктопаразитов животных Лекция 12. Паразитические клещи Лекция 13. Эпидемиологическое значение птиц как источников инфекции Лекция 14. Эпидемиологическое значение млекопитающих как источников инфекции Лекция 15. Трансмиссивные и природноочаговые заболевания на территории Беларуси Лекция 16. Ветеринарно-санитарные мероприятия по борьбе с возбудителями паразитарных заболеваний Терминологический словарь Литература 3 ВВЕДЕНИЕ Курс «Паразитология и природная очаговость болезней» по своему содержанию может быть охарактеризован как общая биология паразитов и, подобно, общей биологии, составляющей как бы введение к ряду зоологических и ботанических дисциплин, в общей паразитологии основное внимание уделяется изучению проблем происхождения и эволюции паразитизма экологической паразитологии и некоторых аспектов паразитоценологии. Соответственно с этим, и разделы из которых слагается этот курс, подобраны по важнейшим биологическим явлениям, имеющим отношение к паразитизму. Лишь часть лекционного времени уделяется изучению отдельных, особенно важных групп паразитических организмов, особенностей их морфологии, физиологии, адаптаций к паразитизму, а также профилактики. В части, посвященной частной паразитологии, читаемого для студентов зоологической специализации − подробно изучается морфология и физиология паразитических организмов из разных таксономичеких групп, особенности их адаптаций к паразитическому образу жизни, жизненные циклы и т.д. Особое внимание уделяется патогенности паразитических организмов, путям заражения человека, домашних и сельскохозяйственных животных, а также профилактике паразитарных заболеваний, методам их диагностики, включая самые современные. Курс делится на четыре части: паразитические микроорганизмы, паразитические простейшие, паразитические черви и паразитические членистоногие. Изучение материала ведется в таксономическом порядке, что является привычным для студентов, прослушавших курс по «Зоологии беспозвоночных». Целью спецкурса ―Паразитология и природная очаговость болезней‖ является усвоение студентами представлений о общих закономерностях паразитизма. Задачами спецкурса являются: − ознакомление студентов с различными видами паразитизма и смежных с ними явлений; − ознакомление студентов с паразитами животных и человека; − усвоение путей проникновения паразитов в организм хозяина, жизненных циклов паразитов, чередования поколений и смены хозяев; − овладение основными методами паразитологических исследований. 4 − формирование умений и навыков диагностики яиц гельминтов, изготовления постоянных препаратов паразитов, определения их видовой принадлежности. Материал спецкурса основан на знаниях, полученных студентами при изучении таких дисциплин, как «Зоология беспозвоночных», «Зоология позвоночных». В результате изучения спецкурса: студент должен знать: − особенности морфологии, физиологии и воспроизведения живых организмов; географическое распространение и экологию представителей основных биологических таксонов; − историю и методологию паразитологии, место в системе научных знаний, вклад выдающихся ученых в становление и развитие основных научных направлений; студент должен уметь: − проводить анализ паразитологических исследований, описания, идентификации, классификации биологических объектов. студент должен владеть: − навыками и методами морфологических и таксономических исследований биологических объектов (приготовление объекта к исследованию, препарирование, зарисовка, работа с коллекционным материалом и др.); − методами экспериментальной работы с лабораторными животными; − математическими методами обработки результатов, понимать принципы построения и использования математических моделей биологических процессов; − методами наблюдения, описания, классификации, экспериментального анализа. Текст лекций ―Паразитология и природная очаговость болезней‖ предназначен для студентов биологического факультета специальности 1 – 31 01 01 «Биология». 5 РАЗДЕЛ 1 ПАРАЗИТОЛОГИЯ И ЕЕ МЕСТО В СИСТЕМЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК ЛЕКЦИЯ 1. ПАРАЗИТОЛОГИЯ КАК НАУКА 1 Предмет, цели и задачи паразитологии. Связь с другими науками. 2 История развития паразитологии. 3 Формы паразитов во времени и пространстве. 1 Предмет, цели и задачи паразитологии. Паразитология (от греч. parasitos — нахлебник и logos — слово, учение) — наука о паразитах и их взаимоотношениях с хозяевами и окружающей средой, а также о мерах и способах борьбы с паразитарными заболеваниями и их возбудителями. Паразитология является наукой, всесторонне изучающей сложный комплекс явлений паразитизма в свете соотношений паразитов и их хозяев и, как таковая, по основным объектам исследования относится к разрядам биологических и медицинских дисциплин. Наука подразделяется на: общую — изучает общие закономерности паразитизма; медицинскую — изучает паразитарные болезни человека, паразитов и паразитозы; ветеринарную — изучает паразитов домашних и промысловых животных; агрономическую, или фитопаразитологию— изучает паразитов и вызываемые ими болезни растений. В зависимости от систематического положения изучаемой группы паразитов выделяют следующие разделы паразитологии: протозоология, гельминтология и арахноэнтомология. Паразитология — комплексная дисциплина, тесно связанная с рядом смежных наук: с экологией, различными разделами зоологии, медицины и ветеринарии. Задачи паразитологии: определение вида паразита, подлежащего изучению (связь с систематикой); изучение морфологии паразита (анатомия); исследование жизненного цикла, размножения и других особенностей жизни паразитов, находящихся в разной степени зависимости от своих хозяев как промежуточных, так и главных 6 (ихтиология, энтомология, герпетология и другие зоологические специальности); определение характера влияния внешней среды на паразита (физиология, патология); выяснение путей эволюции и истории развития паразитов (палеопаразитология). Рис. 1 Отношение паразитологии к сопредельным дисциплинам (по Е.Н. Павловскому) Таковы задачи общей или теоретической паразитологии. В связи с прикладной ролью паразитологии обращено особое внимание на выработку методики паразитологических исследований и диагностики паразитарных или инвазионных болезней. Логическим завершением прикладной паразитологической работы является изыскание мер борьбы с паразитами и способов предохранения хозяев от заражения ими. Одним из основных объектов, изучаемых паразитологией, является паразитизм. Паразитизм — форма взаимоотношений между двумя организмами разных видов, при которой один (паразит) использует другого (хозяина) в качестве источника питания и среды обитания, причем оба организма находятся между собой в антагонистических отношениях. Паразиты – организмы, живущие за счет особей другого вида, питающиеся соками, тканями или переваренной пищей своих хозяев и обитающие внутри или на поверхности их тела временно или постоянно (по Х.С. Горегляду). Паразиты – организмы, использующие другие живые организмы в качестве источника пищи и среды обитания, возлагая частично или зоология патология профилактика 7 полностью на своих хозяев задачу регуляции своих взаимоотношений с окружающей средой (по В.А. Догелю). Паразитизм — одна из форм биотических связей совместно существующих организмов разных видов. Его возникновению предшествовали разнообразные типы взаимоотношений между различными организмами: симбиоз - сожительство организмов, которое может протекать в разных формах, основными из которых мутуализм, комменсализм и паразитизм. мутуализм (от лат. mutus – взаимный) – взаимовыгодное и взаимозависимое сожительство организмов разных видов (простейшие в рубце жвачных). Нужно сказать, что среди представителей царства Животных, населяющих организм человека, мутуалистов не обнаружено. комменсализм (от лат. com – c, вместе и menso – стол, трапеза), сотрапезничество, когда один организм питается остатками пищи другого, не принося ему вреда (бактерии кишечника) хищничество — взаимоотношение организмов, при котором один организм (хищник) ловит и умерщвляет другого (жертву) для использования его в пищу. Паразитизм, как и хищничество, характеризуется антагонистическими взаимоотношениями партнеров (паразита и хозяина), но, в отличие от хищника, паразит не убивает своего хозяина, а использует его как среду обитания и источник пищи в течение более или менее длительного времени. Гибель хозяина может наступить вследствие вызванного паразитом заболевания. Однако резкое разграничение явлений хищничества и паразитизма невозможно. Например, конская пиявка для млекопитающих является эктопаразитом, а для тритона, у которого она за короткое время высасывает всю кровь и лишает его жизни, становится типичным хищником. Обитающая в кишечнике человека комменсальная форма дизентерийной амебы при изменении условий среды превращается в более крупную тканевую форму, паразитирующую в слизистой оболочке толстой кишки. Паразитизм, как одна из форм взаимоотношений между организмами, широко распространен в природе. Паразиты имеются среди организмов всех типов прокариот и эукариот. Объектом изучения паразитологии обычно являются лишь паразиты, относящиеся к царству животных. Их насчитывается свыше 65 тысяч видов (около 7% всех видов животных.) Паразиты, принадлежащие к другим систематическим группам, изучаются различными отраслями микробиологии, ботаники, микологии и эпидемиологии. 8 2 История развития паразитологии. Как самостоятельная дисциплина паразитология (включая медицинскую паразитологию) сформировалась во второй половине XIX-го века. Ее становлению способствовало совершенствование микроскопической техники. Были открыты паразитические простейшие — возбудители широко распространенных заболеваний человека: малярии, лейшманиозов, амебиаза и др.; описан ряд новых видов гельминтозов; установлены циклы развития многих паразитов; выявлена роль комаров в переносе филярий и возбудителей малярии. В развитии паразитологии в этот период важную роль сыграли труды западноевропейских ученых — Кюхенмейстера (G.F.H. Kuchenmeister), Фогта (K. Vogt), Лейкарта (R. Leuckart), Росса (R. Ross), Менсона (P. Manson), Даттона (J.E. Dutton), Теоболда (E.V. Theobald), Никола (J. Nicolas) и др. Первая попытка характеристики животных паразитов и точной формулировки особенностей, отличающих их от свободноживущих организмов, принадлежит немецкому паразитологу, профессору зоологии университетов в Гессене, Лейпциге – Рудольфу Лейкарту. Им описано большое количество новых паразитов, изучена биология пятиусток и других гельминтов, предложена новая классификация беспозвоночных. По Лейкарту отличительныи признаком паразита является способ питания: «каждый организм, питающийся за счет другого живого организма, не убивая его, как это делает хищник, тем самым является паразитом». Значительный вклад в развитие паразитологии на этом этапе был внесен и советскими учеными. А.П. Федченко изучил цикл развития ришты и составил перечень паразитических червей человека и животных, распространенных в Средней Азии. И.А. Порчинским были опубликованы сводные работы о слепнях, комарах, оводах и мухах, Ю.Н. Вагнером — о блохах, Н.А. Холодковским — о вшах, В.В. Фавром и Н.М. Кулагиным — о комарах. В.Л. Яковлев составил первую сводку о клещах России. Н.А. Холодковский создал первый в России «Атлас человеческих глист» и выполнил серию работ по систематике ленточных червей. И.И. Мечников высказал гипотезу о том, что клещи служат переносчиками возбудителей спирохетозов. Одним из основоположников протозоологии был Л.С. Ценковский (1822 – 1887), известный своими работами по изучению инфузорий и других простейших. Исследования паразитов крови животных, проведенные В.Я. Данилевским (1852 – 1939), послужили одним из доказательств патогенности возбудителей малярии и роли комаров в их передаче. Крупный гематолог и маляриолог Д.Л. Романовский (1861 – 1921) 9 предложил метод окраски препаратов крови, ставший ныне общепринятым. В 20-х годах прошлого века в процессе борьбы с широко распространившимися тогда эпидемиями сыпного тифа, малярии и других паразитарных и трансмиссивных болезней в нашей стране началось бурное развитие медицинской паразитологии. Ее основоположниками были выдающиеся ученые, труды которых получили мировую известность. Е.И. Марциновский (1874 – 1934) в 1924 г. создал и возглавил первое в СССР крупное научное учреждение паразитологического профиля — Институт протозойных заболеваний и химиотерапии (Тропический институт) — ныне Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского, Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова. Перед коллективом института была поставлена задача ликвидировать малярию как массовое заболевание на территории нашей страны, которая была успешно решена к 1960 г. К.И. Скрябин (1878 – 1972) основал отечественную гельминтологию, которая как по своим научным достижениям, так и по их практической реализации значительно превзошла уровень, достигнутый в то время в области гельминтологии в зарубежных странах, благодаря чему было резко сокращено распространение в нашей стране многих гельминтозов. В.А. Догель (1882 – 1955), В.Н. Беклемишев (1890 – 1962) и Е.Н. Павловский (1884 – 1965) заложили основы экологической паразитологии. Развитие ее привело к возникновению популяционной паразитологии, в которой взаимоотношения паразита и хозяина рассматриваются на уровне популяций. Большим вкладом в развитие экологической паразитологии явились предложенные Е.Н. Павловским концепция об организме хозяина как среде обитания паразитов и теория паразитоценозов. Е.Н. Павловский и сотрудники его школы, пользуясь разработанным ими методом экспедиционных исследований, в короткое время добились значительных успехов в изучении членистоногих — переносчиков возбудителей трансмиссивных болезней на больших территориях, особенно в отдаленных окраинных районах страны. Была установлена роль различных групп членистоногих в распространении возбудителей ряда трансмиссивных болезней, в том числе и ранее неизвестных (клещевой, или весенне-летний, энцефалит, клещевой сыпной тиф Северной Азии и др.). В ходе этих работ по изучению переносчиков, их хозяев и путей циркуляции возбудителей трансмиссивных болезней в природе Е.Н. Павловским было 10 сформулировано учение о природной очаговости болезней, которое положило начало развитию эколого-географического направления в паразитологии и смежных наук (ландшафтная эпидемиология, медицинская география и др.). Были разработаны и эффективно осуществлялись меры профилактики ряда трансмиссивных и природноочаговых болезней. Е.Н. Павловский, начальник кафедры биологии и медицинской паразитологии Военно- медицинской академии (1921 – 1956) В 1918 году по инициативе профессоров Н.А. Холодковского и Е.Н. Павловского в стенах Военно-медицинской академии впервые в России было организовано преподавание новой для того времени дисциплины — медицинской паразитологии. Б.П. Савицкий, Л. С. Цвирко изучали проблемы природноочаговых зоонозов и их профилактики на особо охраняемых природных территориях Белорусского Полесья. Е.И.Бычкова и ее ученики, проведя исследования на территории Национального парка «Нарочанский» в ряду заповедная зона – зона регулируемого пользования – зона хозяйственного пользования, дали оценку структуры сообществ паразитов и хозяев и основные закономерности ее динамики на охраняемых природных территориях. 3 Формы паразитов во времени и пространстве. Паразитами являются все вирусы, некоторые растения (омела, повилика, заразиха), многие бактерии и грибы. Животные, ведущие паразитический образ жизни, широко представлены простейшими, плоскими и круглыми червями, а также членистоногими. Имеется так же несколько паразитических видов среди кишечнополостных (Polypodium) и среди хордовых (миксины, летучие мыши - десмоды). Паразитизм бывает истинным и ложным. Иногда свободноживущие организмы, попадая в кишечник человека или животных, выделяются вместе с фекалиями или рвотой и могут быть ошибочно приняты за паразитов. В этом случае говорят о ложном паразитизме. 11 Паразиты бывают постоянными и временными. Первые используют хозяина как среду своего обитания и питания, а вторые используют его только как источник питания (например, кровососы). По месту паразитирования паразиты делятся на эктопаразитов (обитают на поверхности тела хозяина – блохи, вши) и эндопаразитов (обитают внутри организма). Последние подразделяются на внутриполостных (кишечные гельминты), тканевых (личинки ленточных и некоторых круглых червей) и внутриклеточных (плазмодии, лейшмании). Взаимодействие паразита и хозяина всегда обусловлено длительной совместной эволюцией (коэволюцией), и чаще всего паразит имеет довольно ограниченный круг хозяев. Отношения между паразитом и хозяином могут быть облигатными, факультативными и потенциальными. облигатные (обязательные), когда паразит живет и развивается в хозяине наилучшим образом – свиная аскарида в организме свиньи, бычий цепень в кишечнике человека. факультативные, когда паразит живет в организме неспецифического хозяина. Половой зрелости в факультативном хозяине паразит никогда не достигает. Примером может быть свиная аскарида или собачья токсокара в организме человека. потенциальные отношения могут обеспечить жизнь паразита в организме хозяина, но между партнерами отсутствуют трофические связи – травоядные млекопитающие и трихинеллы. Заражение новых хозяев обеспечивается так же сложными циклами развития паразитов, происходящими часто со сменой хозяев, тесно связанных трофическими цепями в биоценозах. Хозяев принято подразделять на следующие категории: Основные (окончательные, дефинитивные) хозяева – в них живет половозрелый паразит и (или) происходит половое размножение. Промежуточные хозяева – в них обитает личиночная форма и (или) происходит бесполое размножение. Дополнительные хозяева – 2-е промежуточные. Резервуарные хозяева – в них не происходит какого-либо развития паразита, но происходит накопление его инвазионных стадий, то есть способных к заражению окончательного хозяина. Различают: полифагов (эвриксенные паразиты) – это паразиты, имеющие очень широкий круг хозяев (самки комаров, иксодовые клещи); 12 монофагов (моноксенные паразиты) – живущие за счет хозяина одного определенного вида (кривоголовка двенадцатиперстная, головная вошь); гетерофагов (гетероксенные паразиты) – цикл развития за счет нескольких хозяев (малярийный плазмодий, собачий клещ). ЛЕКЦИЯ 2. ИММУНИТЕТ ПРИ ИНВАЗИЯХ 1 Понятие об инвазии. 2 Ответные реакции организма хозяина на воздействие паразитов. 3 Защитные механизмы паразитов против иммунного ответа хозяина. 1 Понятие об инвазии. Инвазионные стадии паразита могут попадать в организм хозяина разными путями. Алиментарное заражение – инвазия попадает через рот с пищей и водой (большинство гельминтозов и все кишечные протозоозы). Аэрогенное заражение – инвазия попадает через органы дыхания (яйца эхинококка, пятиустки) Поверхностный контакт - при контакте зараженного хозяина и здорового (чесоточные клещи) Перкутанное заражение проникновения – инвазионные личинки попадают в организм хозяина через покровы тела (шистосомы, анкилостомы) Трансмиссивный путь – заражение происходит при помощи переносчиков – кровососущих и других членистоногих. При этом возможны два пути: инокуляция (непосредственное введение паразита при укусе – малярийный комар) и контаминация (загрязнение поврежденных участков тела хозяина экскрементами, содержащих паразита – триатомовые клопы, которые переносят трипаносом). Трансплацентарная (вертикальная) передача – заражение плода в утробе матери (токсоплазмы, некоторые нематоды) Половой контакт – трихомонады, некоторые трипаносомы. Самозаражение (аутоинвазия) - несколько поколений паразита развиваются в одном хозяине без выхода наружу (карликовый цепень). В последнее время многих кровососущих членистоногих не относят к собственно паразитам, так как они ведут свободный образ жизни и лишь для питания нападают на животных и людей. По этой причине иксодовых и аргасовых клещей, а так же комаров, слепней, москитов объединяют в группу гематофагов (нефатальных хищников). 13 2 Ответные реакции организма хозяина на воздействие паразитов. Степень антагонизма между паразитом и хозяином может быть самой разнообразной. В зависимости от уровня ее выраженности возможны различные исходы взаимоотношений между паразитом и хозяином: 1 Гибель паразита. 2 Гибель хозяина (часто вместе с хозяином погибает и паразит). 3 Совместное существование паразита и хозяина в течение более или менее длительного времени, когда их взаимоотношения находятся в состоянии неустойчивого равновесия с временным преобладанием антагонизма то с одной, то с другой стороны. В этом случае паразит и хозяин образуют длительно существующую паразитарную систему. Как правило, эволюционно давно сложившиеся паразитарные системы характеризуются наименьшим уровнем антагонизма. Вариантами негативного воздействия паразита на организм хозяина являются: ухудшение состояния здоровья разной степени, вплоть до гибели хозяина; угнетение репродуктивной функции и сокращение воспроизводства хозяина; изменение нормальных поведенческих реакций хозяина. Каждый из указанных вариантов включает в себя множество разнообразных форм воздействия. Механическое воздействие – нарушение целостности клеток, тканей и органов хозяина. Сюда относятся: ущемление слизистых оболочек присосками гельминтов, перфорация стенок полых органов, закупорка кишечника клубками гельминтов, давление на паренхиму органов пузырчатых личинок цестод, прокалывание кожи кровососами и др. Влияние на микрофлору. Паразитирование гельминтов в кишечнике способствует изменению его микрофлоры и активизации находящихся в организме хозяина «дремлющей» или условно- патогенной микрофлоры. Воздействие антиферментов. Кишечные паразиты выделяют особые вещества, которые нейтрализуют пищеварительные ферменты хозяина и защищают паразита от их действия. Конкуренция за пищу и витамины – паразиты могут усваивать значительную часть питательных веществ, переваренных и зачастую уже усвоенных хозяином. 14 Аллергизация организма хозяина. Воздействие на организм хозяина продуктов обмена паразита чаще всего проявляется аллергическими реакциями Местное действие ферментов паразитов приводит к образованию язв (амебиаз, лейшманиоз). Снижение иммунитета хозяина. У некоторых паразитов описано выделение иммуносупрессоров - веществ, подавляющих защитные механизмы хозяина Установлено, что при аскаридозе и токсокарозе у детей настолько сильно угнетается иммуногенез, что организм таких пациентов не способен выработать достаточный поствакцинальный иммунитет против дифтерии, кори и столбняка. Управление запрограммированной гибелью клетки. Паразитирование в печени человека различных сосальщиков часто ведет к возникновению рака печени. Воздействие на репродуктивную функцию хозяина. При заражении личинками трематод моллюски иногда перестают размножаться, и все ресурсы организма идут на формирование новых поколений паразитов. Постоянная лихорадка при тропической малярии у людей ведет к нарушению сперматогенеза. Модулирование паразитами поведение своих хозяев. Паразиты изменяют поведение своих хозяев, повышая вероятность заражения другого хозяина, и тем самым, обеспечивают свою циркуляцию в природе, используя трофические связи. Мышевидные грызуны всегда избегают запаха кошачьей мочи. Однако, мыши, зараженные токсоплазмозом, наоборот, привлекаются запахом кошачьей мочи. То есть из крайнего репеллента запах мочи для инвазированных грызунов становится аттрактантом. Психогенное воздействие. Внешний вид гельминтов, выходящих из организма, может вызвать у людей с неустойчивой психикой или страдающих психическими заболеваниями сильнейший психоэмоциональный стресс, который оставляет неизгладимый след в их сознании даже после излечения инвазии, заставляя постоянно лечиться от уже несуществующего заболевания. 3 Защитные механизмы паразитов против иммунного ответа хозяина. Животные, ведущие паразитический образ жизни, в процессе эволюции приобрели ряд морфологических и физиологических приспособлений. Изменения, вызванные паразитическим образом жизни, могут носить как регрессивный, так и прогрессивный характер. У паразитов появились органы фиксации – присоски, крючья, хоботки. Прочная малореагентная кутикула паразитических червей предохраняет их от разрушения пищеварительными ферментами хозяина. У гельминтов особенно сильного развития достигает половая 15 система. В то же время пищеварительная и нервная системы, а также органы чувств, в значительной мере, упрощаются в сравнении со свободноживущими организмами. Чтобы избежать воздействий со стороны иммунной системы хозяина, паразиты выработали различные механизмы, основные из которых приведены ниже. Инкапсуляция паразита. В результате взаимодействия паразита и хозяина возникает капсула, служащая биологическим барьером, защищающим паразита от воздействия иммунной системы хозяина. Хозяин, в свою очередь, защищен от продуктов жизнедеятельности паразита. Локализация в тканях наиболее изолированных от воздействий со стороны иммунной системы. Такими тканями являются нервная, мышечная, а также внутренние среды глаза. Именно там развиваются цистицерки цепней, токсоплазмы и др. паразиты. Антигенный дрейф особенно хорошо изучен у трипаносом. Каждое новое поколение паразита образует на поверхности тела белки, отличающиеся от белков предыдущего поколения. К тому времени, как организм хозяина выработает достаточное количество антител для инактивации этих белков, появляется новое поколение трипаносом с поверхностными белками иного состава. Антигенная мимикрия особенно часто встречается у тканевых гельминтов. При этом на кутикуле червей адсорбируются белки хозяина, и иммунная система хозяина не может распознать чужеродный объект. Внутриклеточная локализация. Многие паразитические простейшие паразитируют внутри клетки, где становятся недоступными для воздействия иммунной системы. Важнейшим физиологическим фактором, обеспечивающим непрерывную циркуляцию паразита в популяции хозяина, является огромная плодовитость. Например, бычий цепень в сутки может отделить от себя несколько зрелых члеников, содержащих до нескольких миллионов яиц. При этом паразит живет до десяти лет. Суточная продукция самки аскариды – до 200 тысяч яиц. У сосальщиков потомство только одного мирацидия, внедрившегося в моллюска составляет до нескольких десятков тысяч церкариев, способных заразить окончательного хозяина. Паразитарные заболевания принято разделять на две группы: Зоонозы - заболевания, в цикле развития возбудителей которых человек не является обязательным звеном. Человек в ряде случаев может быть биологическим тупиком для паразита (токсоплазмоз, 16 эхинококкоз, трихинеллез). В других случаях человек может также источником инвазии (описторхоз, дифиллоботриоз). Антропонозы – заболевания, в цикле развития возбудителей которых человек является обязательным звеном (тениоз, тениаринхоз, малярия). ЛЕКЦИЯ 3. СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ ГЕНЕТИКИ В ПАРАЗИТОЛОГИИ 1 Генетические методы в паразитологии. 2 ПЦР анализ в диагностике паразитозов. 1 Генетические методы в паразитологии. Некоторые методы генной инженерии приобретают все более важное значение в клинической практике. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – один из методов анализа геномной ДНК, был предложен в 1983 году американским исследователем Керри Мюллисом. В 1993 году за открытие ПЦР К. Мюллис был удостоен Нобелевской премии. С быстротой молнии метод распространился по всему миру. ПЦР используется для проведения научных и практических исследований, но, прежде всего, этот метод нашел широкое применение в области микробиологической диагностики. ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков - несколько сотен пар нуклеотидов) любого организма среди огромного количества других участков и многократно размножить его. Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное дополнение обеих. Репликация может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках. Суть метода заключается в том, что, маркировав такими блоками специфический только для данного вида участок ДНК, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок. Для того чтобы осуществить такой процесс в пробирке используют две генетические пробы (праймеры), которые и служат в качестве затравки для синтеза данного участка ДНК. Необходимым условием проведения реакции является знание нуклеотидной последовательности синтезируемого участка, т.к. праймеры - это 17 искусственно синтезированные однонуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидных оснований), комплементарные 3-концам амплифицируемых участков нитей ДНК. Праймеры, специфически присоединяясь к нитям ДНК, образуют двунитчатые стартовые участки. После присоединения (отжига) праймеров начинается воспроизведение с помощью фермента Tag - полимеразы специфического фрагмента ДНК. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул. Вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция ПЦР. В результате количество копий фрагмента увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 10 б копий фрагмента. В течение 30-40 циклов нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле или с помощью других несложных методик. В качестве матрицы для синтеза может быть использован любой тип ДНК. Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств ДНК и, в принципе, достаточно даже одной молекулы. Успех в разработке ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий Thertus aquaticus, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур. Все циклы реакции протекают при определенной температуре, которую для каждого конкретного случая подбирают эмпирически. Быстро и точно изменять температуру реакционной смеси позволяет специальный прибор -амплификатор или термоциклер. ПЦР (полимеразная цепная реакция) - селективная амплификация (фактически, клонирование) некоего фрагмента ДНК in vitro. Особенность ПЦР состоит в том, что амплификации подвергается область, находящаяся между участками отжига праймеров, первичная структура которых должна быть известна (или задана) заранее. Модельная система, используемая в ПЦР И отражающая реальные биологические процессы репликации ДНК, включает три стадии: • денатурацию духцепочечной молекулы ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК); • гибридизацию (отжиг) праймеров с матричной ДНК (образование двухцепочечных "комплексов" праймер-матрица, необходимых для инициации синтеза ДНК); 18 • достраивание (удлинение, элонгация) комплиментарных цепей в направлении от 5-конца к 3-концу цепи, начиная с участков присоединения праймеров, при помощи ДНК-полимеразы. Многократное (циклическое) повторение этих трех стадий приводит к экспоненциальному обогащению смеси молекулами ДНК- мишени, поскольку в каждом новом цикле в качестве матрицы выступает не только исходная ДНК, но и ДНК, синтезированная в предыдущих циклах. Протекание ПЦР (т.е. переход от стадии к стадии и от цикла к циклу) регулируется изменением температуры рабочей смеси. Праймеры - синтетические олигонуклеотиды, состоящие из 16-30 оснований. Праймеры комплементарны участкам матричной ДНК, между которыми находится последовательность-мишень. При выборе праймеров необходимо соблюдать следующие правила: соотношение AT и GC нуклеотидов в праймере должно быть примерно 1:1; праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными; наличие любой вторичной структуры в праймере приводит к уменьшению эффективности его связывания с матрицей; образование шпильки на 3-конце приведет к потере праймером его основной функции: инициации репликации; если 3-концы праймеров окажутся взаимокомплиментарны, то ПЦР приведет лишь к саморепликации праймерного димера в ущерб амплификации целевого продукта; присутствие повторяющихся элементов и полиндромов в теле праймера может привести к неселективному отжигу и, как следствие, к получению неспецифичного продукта; последние 3 нуклеотида 3-конца праймера должны быть строго комплементарны матричной ДНК; для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3-конца праймера содержали GC-основания. Очевидно, что чем выше температура при которой проводится отжиг (при длине и составе праймера = const), тем меньше вероятность неспецифичного связывания праймера с матрицей. Амплификация происходит в специальном приборе, который оснащен устройством освещения возбуждающим светом каждой амплификационной ячейки и многоканальным флуоресцентным детектором со спектральным разрешением анализируемого сигнала. При наличии специфической матрицы в начале амплификации происходит смещение максимума флуоресценции из-за деградации олигонуклеотидного зонда (из-за 5'-зкзонуклеазной активности Taq- 19 полимеразы) и, вследствие этого, отменой переноса энергии от одного флуорофора к другому. Анализ кинетики флуоресценции в каждой амплификационной ячейке позволяет рассчитывать количество исходной матрицы, используемой в реакции амплификации. Кроме того, анализ в реальном времени позволяет регистрировать все артефакты, связанные с вышеперечисленными причинами, и вносить необходимые поправки. Синтезируемый в ходе реакции продукт можно детектировать различными способами. Одним из самых простых, эффективных и распространенных способов является электрофоретическое разделение ампликонов в агарозном или полиакриламидном гелях с детекцией ДНК при помощи интеркалирующих флуоресцентных зондов, таких, например, как бромистый этидий. Основной враг исследователя, использующего метод ПЦР - загрязнение какого-либо компонента реакции любой посторонней матрицей, способной амплифицироваться наравне с целевой ДНК. При использовании ПЦР следует соблюдать следующие правила: идеальным решение проблемы контаминации является построение ПЦР -лаборатории по принципу изолированных зон: зона подготовки матричной ДНК, зона подготовки стоковых растворов реагентов, зона анализа продуктов; приготовление всех стоковых растворов осуществляется в отдельном помещении, изолированном от контактов с готовыми ампликонами любой матричной ДНК; оборудование и инструменты, используемые для приготовления стоковых растворов должны использоваться только и исключительно для приготовления этих самых стоковых растворов; приготовленные реактивы необходимо разделить на аликвоты и периодически заменять; одновременно с основными реакциями необходимо проводить ПЦР в пробе не содержащей матричной ДНК, но включающей все остальные компоненты т.н. отрицательный контроль. Совершенно очевидно, что сигнал Е отрицательном контроле свидетельствует о контаминации как минимум одного из компонентов ПЦР. Существует несколько приемов для количественной оценки продуктов амплификации, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Вначале необходимо получить представления о том, какие причины могут влиять на точность измерения ампликонов и что такое количественная ПЦР. Как и любая биохимическая реакция, протекающая in vitro, ПЦР имеет ряд существенных отклонений от теоретически предсказанной закономерности накопления продукта, происходящего не по 20 закону геометрической прогрессии, а по сложному закону, обусловленному истощением реагирующих компонентов, присутствием ингибиторов, инактивацией фермента в ходе реакции и т.д. Принять во внимание все эти факторы при расчете калибровочных кривых практически невозможно, поэтому необходимо применение методик, позволяющих учитывать многочисленные параметры в ходе самой ПЦР. Исследователь не может быть до конца уверен в том, что все испытуемые образцы при изначально одинаковых условиях по реагентам и температуре в термоблоке дают одинаковый выход продукта. Из вышесказанного следует, что действенным способом борьбы с недостатками ПЦР как метода количественного определения мишеней амплификации являются методические приемы, позволяющие регистрировать протекание реакции или ЕНОСИТЬ поправки, выявляя возможные артефакты в каждой пробе. Для создания количественной ПЦР наиболее распространены подходы, использующие внутренние контроли- стандарты, которые, как и определяемая ДНК, участвуют в ПЦР. Используя контроли - стандарты с разным количеством копий на образец можно определить количество копий матрицы, участвующей в реакции. Внутренний контроль-стандарт выполняет несколько функций. Во-первых, он позволяет выявить возможное ингибирование реакции ингибиторами, содержащимися в выделенном клиническом образце. Во-вторых, использование контроля в ходе реакции в той же пробирке, где происходит определение испытуемой матрицы, позволяет учесть эффект неравномерности протекания реакции, так как условия амплификации стандарта и определяемой ДНК или РНК абсолютно идентичны. В-третьих, использование контроля позволяет в значительной степени абстрагироваться от изучения закономерностей протекания реакции, так как основным алгоритмом определения является совпадение интенсивности сигнала от внутреннего контроля-стандарта и сигнала от определяемого ампликона. 21 Полимеразная цепная реакция ПЦР (PCR)] позволяет многократно воспроизводить (амплифицировать) выбранный фрагмент ДНК без помощи рестриктаз, векторов или клетки-хозяина. Для этого нужно иметь в своем распоряжении два олигонуклеотида (праймера), каждый из которых будет гибридизоваться с одной из цепей на противоположных концах подлежащего амплификации фрагмента ДНК, достаточное количество дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и специальную термостабильную ДНК- полимеразу. Праймер синтезируют, а полимеразу получают из термостабильных бактерий (рис. 2). На первой стадии двунитевую ДНК нагревают до 90 о С для разделения цепей и получения однонитевой ДНК (а). Затем смесь охлаждают, чтобы произошла гибридизация с праймерами (б). Комплементарные цепи ДНК синтезируются в обоих направлениях, начиная от праймеров (в). Этот циклический процесс (цикл 1) повторяют с той же самой реакционной смесью (цикл 2, 3 и т.д.) 20-30-кратно. Двунитевые фрагменты ДНК, равные по длине расстоянию между двумя праймерами, начинают накапливаться после третьего цикла. Рис. 2. Полимеразная цепная реакция Их количество удваивается после каждого цикла до тех пор, пока почти все синтезированные фрагменты не будут соответствовать первоначальному фрагменту, ограниченному праймерами. Циклы нагревания и охлаждения проводятся в термостате-амплификаторе с программируемым температурным режимом. Рестриктазы расщепляют ДНК в специфических участках, обычно в палиндромных последовательностях. Когда одно из оснований в такой последовательности изменяется в результате мутации, участок перестает расщепляться рестриктазами. 22 В то же время мутации могут приводить к образованию новых участков, чувствительных к рестриктазе. В результате соответствующие фрагменты ДНК, полученной от двух генетически не идентичных индивидов, часто образуют рестрикционные фрагменты различной длины. Это явление носит название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (ПДРФ, англ. restriction fragment length polimorphism, RFLP). 2 ПЦР анализ в диагностике паразитозов. В последние годы, для диагностики различных инфекционных заболеваний, стал широко использоваться метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР является очень чувствительным и теоретически позволяет установить присутствие нескольких единичных молекул ДНК или РНК микроорганизма в анализируемом биологическом образце. При проведении ПЦР, в качестве мишеней используются различные геномные локусы боррелий. На сегодняшний день полностью известна структура генома одного штамма боррелий американского происхождения - B31 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), который и является референс штаммом всей группы Borrelia burgdorferi. Однако генетическая структура одних и тех же генных локусов у различных геновидов боррелий отличается большой степенью их гетерогенности. Это обстоятельство накладывает определенные ограничения на выбор мишени для ПЦР, и, следовательно, на подбор праймеров такой структуры, которая бы гарантировала исключительную специфичность, не только в отношении всего комплекса B.burgdorferi.s.l., но и возможность их идентификации до геновида. Метод ПЦР для диагностики боррелиоза в настоящее время не унифицирован. Для получения большей достоверности результатов ПЦР желательно использование нескольких диагностических ПЦР- систем. В клинической диагностике ЛБ использование метода ПЦР целесообразно по нескольким причинам. Во-первых, метод ПЦР позволяет определять наличие ДНК боррелий в различном биологическом материале: клещ, кожный биоптат, кровь, моча, цереброспинальная и суставная жидкости и др. Высокая чувствительность этого метода позволяет определять инфицированность человека на 7 - 14 день от момента присасывания клеща, часто еще в инкубационном периоде. Таким образом, реализуется возможность раннего лабораторного подтверждения диагноза боррелиоза. Во-вторых, метод ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель до геновида, осуществлять диагностику боррелиозных микст-инфекций, выявлять случаи повторных заражений, проводить контроль 23 эффективности терапии по элиминации возбудителя и в отношении разных геновидов боррелий. Оптимальным сроком контрольного исследования является один месяц после окончания лечения. За это время происходит полное выведение из организма человека ДНК и РНК боррелий в случае успешного лечения. Генетические методы в диагностике вируса простого герпеса (ВПГ). С приходом в нашу жизнь ИППП новой формации, особое внимание стало уделяться и герпетической инфекции. Необходимо отметить, что приоритет в области изучения ВПГ принадлежит российским учѐным. Исследования были начаты около 40 лет назад и в настоящее время довольно точно изучены механизмы проникновения ВПГ в организм и его влияние на человека, предложены десятки средств лечения простого герпеса. На прошедшем в 2000 году симпозиуме "Рациональные подходы к лечению герпетической инфекции" были предложены различные способы терапии простого герпеса и отмечено, что на данный момент полностью избавить организм от ВПГ не представляется возможным. ВПГ - это не банальные пузырьки на губах, к которым мы все привыкли. Доказано, что герпетическая инфекция является причиной серьезнейших заболеваний, таких как герпетический энцефалит, патологии печени, предстательной железы и т.д. Хотелось бы указать на то, что ещѐ в 1949 году Morgan и М. Finland описали случай атипичной пневмонии с летальным исходом. Из трех больных с абсолютно идентичными клиническими проявлениями двое выздоровели, а третий - умер. Из тканей легких умершего пациента был выделен ВПГ. Авторы отмечают, что у двух других больных выделить вирус не удалось. Одной из актуальнейших проблем сегодня являются ИППП, так называемой, новой формации, среди которых особое место занимает ВПГ. За последние десятилетия отношение к этому заболеванию претерпело коренные изменения в связи с тем, что его перестали воспринимать как чисто дерматологическую проблему. Сегодня общепризнанной является возможность поражения ВПГ различных органов, доказано его значение в канцерогенезе, вторичном бесплодии и т.д. Это позволяет говорить о герпетической болезни, подчѐркивая тем самым системный характер проявлений. Учитывая все вышеизложенное, актуальность изучаемой проблемы не вызывает сомнения. В противовирусном иммунном ответе решающую роль играют количественные показатели клеток макрофагонального звена, а также цитотоксическая активность естественных киллеров (ЦАЕК) и гамма- интерферон. Исследование генитальных мазков методом полимеразной 24 цепной реакции (ПЦР) показало наличие вируса во всех пробах независимо от пола и возраста обследуемых. Анализ иммунограмм позволил сделать вывод о степени нарушения системы иммунитета в зависимости от частоты обострений. Это отражается в прямо нарастающем снижении продукции гамма-интерферона, индекса ЦАЕК, соотношения CD-4/CD-8-клеток и количества CD-4-популяции лимфоцитов соответственно тяжести заболевания. Если в группе с редко рецидивирующим герпесом показатели близки к нижней границе нормы, то у людей с умеренно рецидивирующим герпесом параметры по альфа-интерферону в среднем 109 ед./мл. при норме 128 ед./мл., по гамма - интерферону 61 ед./мл. при норме 64 ед./мл., ЦАЕК - 40% при норме 55. У группы с частотой обострения более 6 раз в год: гамма- интерферон - 53 ед./мл., ЦАЕК - 25%, T-CD-4 - 28% (норма-39-50). Примерно у 25% иммунограмм (у 20% обследованных с частыми и у 5% с умеренными обострениями) выявлялся крайне высокий уровень антител к вирусу простого герпеса. Начало клинических проявлений инфекции далеко не всегда является следствием повторного заражения, а чаще указывает на возникшие нарушения в системе иммунитета. Диагноз ПГ, в подавляющем большинстве случаев, может быть выставлен только на основании совокупности клинических проявлений инфекции и лабораторного обследования подтверждающего ее наличие, но никак не в случае выявления только антител к ВПГ, поэтому целесообразно использовать такие методы исследования, как ПЦР. Санация организма от ВПГ не возможна и нецелесообразна, а терапия заболевания должна быть ориентирована либо на купирование конкретных рецидивов, либо на сокращение их частоты. Тяжесть течения вирусного процесса связана со степенью выраженности нарушений в иммунной системе, которые могут носить разнообразный характер. Это требует исследования иммунитета, от результатов которого и принимается решение о коррекции иммунологических показателей. С использованием ПЦР и секвенс-анализа проведен скрининг ДНК риккетсий в 853 экземплярах имаго иксодовых клещей 4 родов (Dermacentor, Haemaphysalis, Ixodes и Hyalomma), собранных на 12 административных территориях России и Казахстана. Суммарную ДНК экстрагировали из каждого клеща индивидуально, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Gеrmany). Риккетсиальная ДНК была амплифицирована в ПЦР с праймерами Rr190.70p (5- ATGGCGAATATTTCTCCAAAA—3) и Rr190.701n (5- GTTCCGTTAATGGCAGCATCT —3), которые амплифицируют 590 25 п. о. фрагмента гена ompA. Для амплификации гена цитрат-синтетазы (gltA) применяли две пары праймеров CS1d (5- ATGACTAATGGCAATAATАА —3) и CS535r (5- GААТАТТТАТААGАСАТТGС —3), CS409d (5- CCTATGGCTATTATGCTTGC —3) и RP1258n (5- АТТGСАААААGТАСАGТGААСА –3). ПЦР выполняли в термоциклере Peltier модель РТС-200 (Mj Research, Inc, Wаtеrtоwn, МА). ПЦР-продукты после амплификации были очищены с применением QIAquick PCR puritication kit (QIAGEN). Секвенс-реакцию с ПЦР- продуктами выполняли, применяя d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kiy (Applied Bioststems, Warrington, UK). Секвенирование было выполнено на АВI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Последовательности ДНК, полученные в секвенс-реакции, были идентифицированы в GenBank. На 9 административных территориях России и в 3 областях Казахстана в 9 видах иксодовых клещей генотипировано 9 видов риккетсий группы КПЛ, из них 7 видов риккетсий в указанных регионах выявлены впервые, описан новый вид риккетсий (Candidatus Rickettsia tarasevichiae). На территориях этих двух стран в иксодовых клещах имеют распространение R. sibirica, являющаяся "классическим" патогеном человека, возбудитель астраханской пятнистой лихорадки, R. slovaca, R. heilongjiangensis, R. aeschlimannii и R. helvetica, отнесенные к "новым" патогенам человека, и риккетсии с неизученной патогенностью для человека, к которым относятся Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28, Candidatus Rickettsia tarasevichiae и риккетсия, наиболее близкая к Rickettsia sp. AT-l. Ареалы различных видов иксодовых клещей—хозяев риккетсий частично совпадают, что влияет на видовое многообразие риккетсий на территориях. Приведенные данные свидетельствуют о возможности полиэтиологического характера риккетсиозов на отличающихся по иксодовой фауне территориях, где в клещах выявлены риккетсии, отнесенные к "новым" патогенам. |