Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Реакция гемолиза Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость — лаковую кровь вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую- щих антитела — гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент. Реакция иммобилизации Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана с реакцией между микробными антигенами и специфическими антителами в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях, возбудители которых являются подвижными микроорганизмами 1 9 .2 .4 . Реакции, протекающие с участием фагоцитов Опсонофагоцитарная реакция проводится для определения способности антител и комплемента усиливать фагоцитоз. Антитела, стимулирующие фагоцитоз, называют опсонинами (греч. opso- nion — готовить пищу. Опсонизация определяется тем, что антитела, присоединившиеся к микроорганизму, обуславливают его быстрое поглощение фагоцитом благодаря тому, что фагоцит обладает рецепторами для F фрагмента иммуноглобулина, присоединившегося к микробной клетке. Комплемент тоже обладает опсонизирующими свойствами, так как фагоцит содержит рецепторы и к компонентам комплемента. Для количественной оценки опсонического эффекта определяют опсонический индекс — отношение показателей фагоцитоза неопсонизированных микроорганизмов к показателям фагоцитоза фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) после обработки фагоцитоза антителами и/или комплементом. 1 9 .2 .5 . Реакции, протекающие с участием меченых антигенов или антител Тесты основаны на выявлении взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса антиген — антитело пометке одного из участников реакций, выявляемой либо визуально, либо с помощью специальных высокочувствительных приборов, позволяющих количественно выявить меченый субстрат и, следовательно, искомый антиген или антитело. В качестве метки используют либо флюоресцирующий в ультрафиолетовом свете краситель (изоционат флюоресцеина), либо фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза), выявляемый по изменению окраски соответствующего субстрата (иммуноферментный анализ — ИФА), либо изотоп, выявляемый радиометрией (радиоиммунный анализ — РИА). В отечественных лабораториях в течение многих лет используется иммунофлюоресцентный метод, разработанный Альбертом Кунсом и получивший его имя (рис. 19.7). Одна модификация метода, получившая название прямого метода Кунса, включает обработку материала на предметном стекле (мазок мокроты, срез ткани) меченой флюорохромом диагностической антисывороткой. Если на предметном стекле был искомый антиген, антитела фиксируются на антигене, и после отмывки стекла от несвязавшихся антител антиген выявляется в люминесцентном микроскопе по яркому свечению. Другая модификация — непрямой метод Кунса — основан на использовании меченой антиглобулиновой сыворотки. От прямого метода Кунса тгот вариант отличается тем, что используется немеченая диагности- apaxoft метод Сі ви шив : комплекс в евр ям о ан в то ь А г - і в т в ген Ат - антитела А ГС- і н і жгло в т л ж по ї » Светят в й с і к ом пл е к с Рис. 19.7. Иммунофлюоресцептный метод Кунса ческая сыворотка, а ее присоединение к антигену выявляется с помощью меченой антиглобулиновой сыворотки, выявляющей иммуноглобулин немеченой диагностической сыворотки, присоединившийся к искомому антигену. Более современные методы выявления антигенов либо антител имеют множество вариантов. Большинство из них используют твердофазную технологию, основанную на том, что один из стандартизованных компонентов реакции (антиген или антитело) заранее в производственных фирменных лабораториях фиксируется в лунках специально приготовленных полистироловых или поливинилхлоридных панелей. Исследуемый материал помещается в эти лунки. Для выявления антигена могут быть использованы лунки, в которых фиксированы антитела. Если в материале содержался антиген, то он присоединяется к фиксированным антителами сам оказывается фиксированным в лунке. Для выявления этого антигена используются меченые антитела, и после ряда отмывок для удаления несвязвавшихся компонентов эти антитела выявляются в соответствии со своей меткой. Для выявления антител могут быть использованы лунки, в которых фиксирован антиген. Добавленные антитела фиксируются на антигене, остаются в лунке и могут быть выявлены с помощью меченых антиглобулиновых антител. Мы привели примеры вариантов использования твердофазных методов и меченых компонентов реакций. Могут быть и другие варианты. Так, например, клетки крови или костного мозга могут быть обработаны флюоресцирующими антителами в жидкости. При этом клетки могут быть обработаны разными антителами, помеченными разными флюорохромами. Пропуская такие взвеси через специальный проточный флюориметр, можно одновременно выявить и подсчитать разные виды клеток. Присоединив к проточному флюоримет- ру прибор, именуемый сортером, можно выделить или удалить из взвесите клетки, которые необходимы исследователю или врачу Современные иммунофлюоресцентные, иммуноферментные и радиоиммунные методы отличаются высокой чувствительностью (выявление 0,0 0 0 5 -0 ,0 0 0 0 5 мкг/мл белка, специфичностью, воспроизводимостью, возможностью выявления широкого круга биологических веществ. Современные производственные фирмы готовят все необходимые ингредиенты и оборудование для их использования. Таким образом, развитие серологических методов диагностики происходит в настоящее время в следующем направлении) использование меченых антигенов или антител с помощью флюорохрома, фермента либо радиоактивной метки) постановка реакции на твердофазном носителе — полистеро- ловом планшете с лунками с нанесенными в них антигенами или антителами. Это позволяет повысить чувствительность метода, автоматизировать постановку реакции и использовать специальную аппаратуру для снятия результатов. ВАКЦИНЫ. ИММУННЫЕ СЫВОРОТКИ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ Одним из важнейших направлений прикладной микробиологии является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Среди таких препаратов различают) вакцины и анатоксины— препараты для индукции в организме специфического иммунного ответа сформированием активного про- гивоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти) иммунные сыворотки и иммуноглобулины — препараты, содержащие готовые специфические антитела (иммуноглобулины, введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, способного защитить организм от интоксикации или инфекции 9 .3 .1 . Вакцины Название вакцины было дано JI. Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. '). Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vaccinus — коровий, идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентный для человека. Таким образом, первый вакцинный штамм был займ- Классификация вакцин Группа вакцин по способам приготовления Б актер и ал ьн ы е вакцины Вирусн ы е вакцины — BC G Чумная Сибиреязвенная Туляремийная Бруцеллезная Коревая Антирабическая Оспенная Паротитная Полиомиелитная I, II и III типов Против желтой лихорадки Инактивированная Лептоспирозная Коклюшная Гонококковая Бруцеллезная Гриппозная Против клещевого энцефалита Анатоксин Стафилококковый Дифтерийный (АД) Столбнячный (АС) Секстаанатоксин Комбинированные препараты- дифтерийно-столбнячный (АДС); - коклюшно-дефтерийно- столбнячный (АКДС) Химическая (субъединичная) Сыпно-тифозная Холерная (холероген + + О-антиген) Менингококковая Брюшнотифозная Гриппозная и др. Рекомбинантная Гриппозная и др. Г енно-инженерная Против гепатита В Антиидиотипичес- кая В стадии разработки Липосомальная В стадии разработки ствован из природы. Заслугой J1. Пастера была разработка принципов направленного получения вакцинных штаммов — селекция спонтанных мутантов с пониженной вирулентностью и сохранными им муногенными свойствами путем культивирования их в определенных условиях или пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных. Исходя из этих принципов были получены вакцины первого поколения против бешенства, туберкулеза, чумы, туляремии, сибирской язвы, полиомиелита, кори, паротита и др. (табл. 19.1). Живые вакцины создают, как правило, напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. В большинстве случаев достаточно бывает однократной вакцинации живой вакциной, так как вакцинный штамм может размножаться и пер- систировать в организме. Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными имму нодефицитными состояниями, на фоне которых возбудители с пониженной вирулентностью могут вызвать тяжелые инфекционные ос ложнения.Убитые вакцины готовят из микроорганизмов, обладающих максимально выраженной иммуногенностью, инактивированных прогреванием, УФ-лучами или химическими веществами (формалином, фенолом, спиртом и др) в условиях, исключающих денатурацию антигенов. Примерами убитых вакцин могут служить вакцины против коклюша, лептоспироза, клещевого энцефалита (см. табл. 19.1). Следует учитывать, что аттенуированный, или убитый, возбудитель, сточки зрения современной иммунологии, — это множество различных антигенных детерминант, из которых «протекгивностью», те. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие. В связи с этим целесообразно усовершенствование вакцин путем использования компонентов бактериальных клеток и вирионов, обладающих наиболее выраженным протективным действием, и очистки вакцинных препаратов от токсичных или аллергизирующих компонентов. Выделение из бактериальных клеток компонентов, соответствующих протективным антигенам, позволило получить вакцины второго поколения химические. По сравнению с убитыми и живыми вакцинами химические вакцины менее реакто- генны. Примером может служить холерная вакцина, которая состоит из двух компонентов холерогена-анатоксина и ЛПС, извлеченного из холерных вибрионов. Аналогами бактериальных химических вакцин являются вирусные субъединичные (расщепленные) вакцины, содержащие лишь некоторые наиболее иммуногенные компоненты вирио- иов (см. табл. 19.1). Примером является противогриппозная вакцина, нключающая гемагглютинин и нейраминидазу, те. именно те антигены, против которых вырабатываются вируснейтрализующие антитела. Субъединичные вакцины оказались наименее реактогенными, но и наименее иммуногенными. Для повышения иммуногенности химических и субъединичных ннкцин к ним добавляют разного рода ад ъ ю ванты помогающий, поддерживающий гидрооксид алюминия, алюминиево калиевые квасцы, фосфат алюминия и др. Те же адъюванты добавля- Ю для повышения иммуногенности и к препаратам анатоксинов. Анатоксины получают путем обработки токсинов формалином (0,3% раствор) при температуре Св течение 30 дней. При этом токсин утрачивает ядовитость, но сохраняет способность индуцировать синтез антитоксических антител. Анатоксинами широко пользуются для выработки активного антитоксического иммунитета при специфической профилактике столбняка, дифтерии и других инфекций, возбудители которых продуцируют экзотоксины (см. табл. Достижения современной фундаментальной иммунологии и молекулярной биологии позволяют получить в чистом виде антигенные детерминанты (эпитопы). Правда, изолированная антигенная детерминанта иммуногенностью не обладает. Поэтому создание вакцин новых поколений требует конъюгации антигенных детерминант с молекулой-носителем. В качестве носителей можно использовать как природные белки, таки синтетические полиэлектролиты. Конструирование таких искусственных вакцин позволяет соединить несколько эпитопов разной специфичности с общим носителем, ввести в такой комплекс необходимую адъювантную группировку. Другой принцип используется при создании вакцин следующего поколения — генноинженерных: на основе картирования геномов микроорганизмов гены, контролирующие нужные антигенные детерминанты, переносят в геном других микроорганизмов и клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях. Сравнительно недавно была обоснована принципиальная возможность получения вакцин на основе антиидиотипических антител см. 15.5). Это объясняется близким структурным сходством между эпитопом антигена и активным центром антиидиотипического антитела, распознающим идиотипический эпитоп антитела к данному антигену. Показано, например, что антитела против антитоксического иммуноглобулина (антийдиотипические) могут иммунизировать животное подобно анатоксину. Вакцинация должна обеспечивать доставку антигенных эпитопов к иммунокомпетентным клеткам, при этом необходимо исключить возможность изменения их структуры под действием ферментов. Одно из перспективных решений этой проблемы связано с использованием липосом — микроскопических пузырьков, состоящих из двуслойных фосфолипидных мембран. Благодаря их сходству с клеточными мембранами липосомы нетоксичны для организма, а заключенное в них вещество защищено от разбавления и деградации в крови. Липосомы способны адсорбироваться на клетках, причем их содержимое медленно поступает внутрь клетки. Фагоцитирующие клетки могут захватывать липосомы путем эндоцитоза с последующей деградацией их мембран. Антигены, включенные в состав поверхностной мембраны липосом, приобретают свойства адъюванта — способность вызывать сильный иммунный ответ. Другие антигены можно вводить в содержимое липосом. В эксперименте такие «липосомные» вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа. Часть вакцин используется для обязательной плановой вакцинации детского населения противотуберкулезная вакцина BC G , полиомиелитная вакцина, коревая, паротитная, АКДС (адсорбированная вакцина против коклюша, дифтерии и столбняка). Другие вакцины обязательны для введения определенным контингентам в определенных районах (например, вакцина против клещевого энцефалита) или при опасности профессиональных контактов с возбудителем (например, вакцины против зооантропонозных инфекций. По эпидемиологическим показаниям начинают применять вакцины, предназначенные для предупреждения распространения эпидемий, например эпидемии гриппа. При необходимости проведения массовой вакцинации населения по эпидемиологическим показаниям в настоящее время применяют безыгольный струйный инъектор. В основе безыгольного метода введения препарата лежит способность тонкой струи жидкости, выходящей под большим давлением, пробивать кожу и проникать на определенную глубину. Преимуществами такого метода являются высокая производительность и экономичность, техническая простота соблюдения стерильности, исключение возможности передачи так называемых шпри цевих инфекций (гепатит В , СПИД) и безболезненность. Общими требованиями к вакцинным препаратам являются высокая иммуноген- ность (способность обеспечивать надежную противоинфекционную защиту, ареактогенность (отсутствие выраженных побочных реакций, безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие. До настоящего времени далеко не все вакцинные препараты отвечают этим требованиям. Применение многих вакцинных препаратов у определенной части вакцинированных людей сопровождается побочными реакциями и осложнениями. Частично осложнения являются следствием антигенной перегрузки, особенно у детей го года жизни. Н течение го года жизни ребенок, как правило, получает 4—5 вакцинных препаратов. В течение первых 10 лет жизни календарь прививок создает высокую антигенную нагрузку на иммунную систему детскою организма. Результатом может быть сенсибилизация, сопровождающаяся развитием гетероаллергии. Некоторые живые вакцины (против Іісшенства, против желтой лихорадки) у детей с иммунодефицитными состояниями оказываются энцефалитогенными. Осложнения при плановой вакцинации могут быть связаны с несоблюдением противопока- ШНИЙ. К числу отдаленных осложнений вакцинации можно отнести рмзвитие аутоиммунных заболеваний за счет действия перекрестно рсаі ирующих антигенов в составе некоторых вакцин. Значительно более ограничено применение вакцин с целью имму- иоирапии, в основном при инфекциях с хроническим, затяжным течением. С этой целью применяют, например, убитые вакцины стафилококковую, гонококковую, бруцеллезную. В одних случаях курс вакцинотерапии может оказывать иммуностимулирующее, в других — десенсибилизирующее действие 9 .3 .2 . Иммунные сыворотки и иммуноглобулины Иммунные сыворотки и получаемые из них иммуноглобулины — биологические препараты, содержащие антитела (схема 19.2). Они предназначены для создания пассивного антитоксического, антибактериального или антивирусного иммунитета у человека, нуждающегося в защите от инфекции или других потенциально-опасных веществ, обладающих антигенными свойствами СМ*. Сывороточные препараты Иммунные сыворотки Гетеро- Гомо- логич- логичные ные Иммуноглобулины Гетеро- Гомо- логич- логичные ные "Чистые" антитела Гетеро- логич ные Гомо логич ные Моноклональ ные антитела Гиб рид- Гетеро- логичные ные С хе м а 19.2. Сывороточные препараты Иммунные сыворотки и иммуноглобулины используются как средства серопрофилактики и серотерапии. В первом случае сывороточные препараты вводятся до возможного заражения или непосредственно после него, пока еще не появились признаки заболевания, а пациент не обладает собственными антителами, способными защитить его от заражения. Во втором случае препараты вводятся для лечения — нейтрализации токсинов или вирусов, усиления антимикробной защиты. Лечебные препараты используются в тех случаях, когда имеются основания считать, что организм неспособен обеспечить собственную защиту. Действие препаратов, создающих пассивный иммунитет, начинается быстро — сразу после введения, однако срок действия ограничен периодом их сохранения в организме. Кроме того, введенные антитела препятствуют развитию активного иммунитета против воз будителя. В се сывороточные препараты делятся на две группы гетероло- гичные, полученные из крови животных, и гомологичные, полученные из крови человека (схема 19.2). Эти различия имеют принципиальное значение, так как гетерологичные препараты являются для организма человека чужеродными антигенами, их применение сопровождается развитием антител, которые могут не только нейтрализовать действие препарата, но вызвать в организме тяжелые аллергические и иммунокомлексные реакции. Гетерологичные иммунные сыворотки получают из крови животных (чаще лошадей, подвергнутых интенсивной иммунизации анатоксином или другим антигеном (гипериммунизации). В настоящее время неочищенные сыворотки практически не применяют их подергают очистке от балластных веществ обработкой ферментами, диализом («Диаферм»), либо другими методами. Предпочтительнее использование глобулиновых фракций, которые содержат не более 20% всех белков, содержавшихся в сыворотке. Однако гетерологичные глобулины иммуногенны для человека, как и цельные сыворотки. Преимущество гетерологичных препаратов в том, что интенсивная иммунизация животных позволяет достичь высокой концентрации антител, кроме того, нет ограничений в подборе продуцентов, тогда как иммунизация доноров связана с большими трудностями. Высокая иммуногенность препаратов, полученных из крови животных, ограничивает их применение и требует особого внимания при использовании. Перед их применением следует осведомиться, вводили ли подобные вещества пациенту ранее, нет ли у него повышенной чувствительности к другим антигенам. При этом необходимо иметь в ниду, что повышенная чувствительность может возникнуть и без введения препаратов за счет действия других антигенов, имеющих сходство сего белком. Во всех случаях необходим предварительный контроль чувствительности к данному препарату. За полчаса до внутримышечного или подкожного введения необходимой дозы пациенту делают внутрикожную пробу путем введения 0,1 мл разведенного 1:100 препарата и только при полном отсутствии местной или общей реакции вводят полную дозу препарата. К сыворотками иммуноглобулинам, предназначенным для введения человеку, прилагается ампула разведенного препарата, предназначенная для предварительного контроля чувствительности к нему. В случае выявления чувствительности вместо гетерологичных препаратов могут быть использованы иммуноглобулины человека. Препараты иммуноглобулинов, полученные из человеческой кропи, для человека не иммуногенны, ив этом их преимущество перед ісгерологичньїми сыворотками и глобулинами. Иммуноглобулины человека готовят из донорской или плацентарной крови, предварительно смешивают сыворотки, полученные из крови разных лиц, и поэтому концентрация в них антител невелика. Кроме антител, ради которых готовят препараты иммуноглобулинов они содержат другие антитела, находящиеся в крови человека. Поэтому противокоревой иммуноглобулин используют и для профилактики гепатита, коклюша, менингита и других инфекционных заболеваний. Для получения препаратов иммуноглобулинов с повышенным содержанием антител производят предварительный отбор сырья — сывороток крови содержащих соответствующие антитела, а также используют сыворотки реконвалесцентов или доноров, подвергнутых иммунизации. Такие препараты маркируются отдельно и используются для групп особого риска новорожденных, тяжелобольных и других. Существующие методы приготовления глобулинов полностью исключают возможность присутствия в них вирусов, в том числе и ВИЧ (вируса иммунодефицита человека, но они могут содержать агрегированные в процессе приготовления реактогенные белки. Поэтому препараты иммуноглобулинов вводят только в мышцу, подкожно или наносят на слизистые. Иммуноглобулины, предназначенные для внутривенного введения, подвергают дополнительной обработке с целью удаления агрегатов и снижения реактогенности. В качестве профилактических и лечебных препаратов могут использоваться чистые антитела — иммуноглобулины, полученные сорбцией антител на антигенных сорбентах. Однако такие антитела не получили широкого использования из-за сложности технологии приготовления и относительной нестабильности препаратов. Среди перспективных препаратов на будущее необходимо назвать моноклональные антитела, обладающие высокой специфичностью действия. Получаемые в настоящее время моноклональные антитела — гетерологичные (чаще всего мышиные) иммуноглобулины, и к ним приложимо то, что было сказано выше относительно чужеродных препаратов. Однако моноклональные антитела — препараты, почти на 100% состоящие из специфических антител, что позволяет их вводить в малых и, следовательно, в низкоиммуногенных дозах. В настоящее время разработана технология создания гибридных молекул антител, состоящих из вариабильного (антигенсвязывающего) домена мышиного иммуноглобулина и остальной части молекулы от человеческого иммуноглобулина. Такие препараты для человека практически не иммуногенны. Моноклональные антитела могут использоваться не только как биологически-активные вещества, воздействующие прямо на клетки и молекулы, обладающие соответствующими антигенами. Они могут использоваться как средство доставки других активных субстратов. Так, моноклональные антитела к антигенам опухоли могут быть конъ югированы с цитотоксическими лекарственными препаратами и использоваться в качестве почтальонов, доставляющих лекарство непосредственно к опухоли |