Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
1 9 .3 .3 . Получение моноклональных антител (гибридомная технология) Для использования большинства иммунологических и серологических методов исследования необходимо иметь стандартные препараты антител. Основные требования к этим препаратам — специфичность, стабильность, достаточное содержание антител. Сложность получения таких препаратов путем иммунизации животных связана с гетерогенностью получаемых при этом антител. Каждый природный антиген многокомпонентен, и к каждому его эпитопу формируются отдельные клоны антителообразующих клеток, что обуславливает большое разнообразие продуцируемых антител. Более того, к одной антигенной детерминанте может образоваться множество вариантов молекул антител. Таким образом, антитела, получаемые от разных особей одного вида, иммунизированных одним антигенным препаратом, не полностью идентичны. Получить абсолютно однородные антитела можно, только используя клетки — антителопродуценты одного клона — потомков одной специализированной клетки. Решить задачу, используя специально отобранные лимфоциты иммунного человека или животного, невозможно, поскольку срок жизни каждого клона клеток ограничен и количество продуцируемых антител очень невелико. Положение коренным образом изменилось после того, как Г. Кё лер и Ц. Милштейн осуществили гибридизацию антителообразующих клеток, полученных от животного, с культивируемыми в пробирке клетками злокачественной опухоли — В-клеточной плазмацитомы. І Іолученньїе при этом гибридные клетки обладали свойствами обеих родительских клеток способностью продуцировать антитела и способностью к неограниченному размножению вне организма. Таким образом, были получены теоретически бессмертные клоны гибридных клеток ( гибридомы), способные к образованию неограниченного количества однородных продуктов одного клона клеток — моноклональных антител. Процедура получения гибридомных клеток и моноклональных интител сводится к следующему (рис. 19.8). Животное (чаще мышь) иммунизируют нужным антигенным материалом. После того как началась продукция антител, удаляют селезенку, и из нее извлекают клетки, среди которых имеются антителообразующие В-лимфоциты. I Ice клетки смешивают со специально отобранными клетками культуры В-миеломы, дефектными по ферменту метаболизирующему гипок- шнтин. К смеси клеток добавляют вещество, повреждающее оболочки клеток и способствующее их слиянию между собой (полиэтилен николь, лизолецитин или вирус Сендай). В результате образуются м шообразные гибридные клетки, а часть клеток остается негибри- к хт ПОЛУЧЕНИЕ М ОНО КЛОНА ЛЬ Н Ы Х лнтитвл культурам і є лом них клеток ЇХ*! Я Гд*а*о * к —•*' ГЛТ-3 ♦ _ In - ■ v с ИМ с П Э Гс липе все лекция гвОрждов 9 среде с ГАТ V к л он н ров ан к е рвам вож евве отобранного кловв і в а коп лев мехов о кл овал ь вы х Рис. 19.8. Получением он оклон ал ьн ы х антител дизированной. Для того чтобы выделить только гибридные клетки, полученную смесь культивируют на специальной среде ГАТ (содержащей гипокЬантин, аминоптерин и тимидин), в которой не могут жить родительские клетки. В среде остаются живыми только гибридные клетки, нос разными свойствами, так как в селезенке иммунизированного животного наряду с антителообразующими клетками, которые было необходимо получить, содержится много других лимфоцитов. Поэтому следующим этапом является отбор гибридных клеток, способных продуцировать необходимые антитела. Для этого взвесь полученных клеток разбавляют питательной средой и помещают в лунки специальных панелей так, чтобы в каждую лунку попало по одной клетке. Через определенное время определяют антитела, образовавшиеся в каждой лунке, и находят те клетки, которые можно использовать как родоначальников клона гибридомных клеток. Отобранные гибридомные клетки можно культивировать in vitro или in vivo, получая необходимые количества клеток и моноклональных антител. Гибридомные клетки могут храниться в замороженном состоянии, пересылаться из лаборатории в лабораторию. Входе приготовления гибридомных клеток может быть выделено несколько клонов клеток, продуцирующих антитела к разным эпитопам антигена, что позволяет провести его разносторонний анализ. Моноклональные антитела могут использоваться для разных практических целей 1) для идентификации клеток — выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств) для осуществления современных радиоиммунных, иммунофер- ментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител) для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам) для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить или удалить из организма антигены или клетки данной специфичности. Вопросы для самоконтроля. Какие из серологических реакций отличаются а) наиболее высокой чувствительностью б) простотой и доступностью в) универсальностью і ) возможностью быстрого получения результатов (экспресс-диагностики)? 2. В каких двух направлениях могут применяться серологические реакции с диагностической целью ? 3. Каков смысл контрольных исследований и чем определяется их необходимость при постановке серологических реакций. Какие из серологических реакций применяются для а) выявления и идентификации антигена б) определения и титрования антител в) оценки напряженности антибактериального и антитоксического иммунитета г) выявления неполных антител. В каких реакциях применяются меченые антигены и антитела В чем состоят преимущества этих методов. Что такое моноклональные антитела и для каких целей они применяются. Какие препараты используются для создания искусственного активного антимикробного и антитоксического иммунитета. Каковы принципы классификации вакцин Какие способы приготовления вакцин расцениваются как наиболее перспективные. Какие препараты используются для создания искусственного пассивного антимикробного и антитоксического иммунитета. С какими препаратами можно ввести в организм готовые антитела Какую опасность представляют некоторые из них и как предупредить возможные осложнения. Дайте определения серологическими клеточным диагностическим реакциям. Проведите сопоставления разных серологических реакций в плане их чувствительности, возможностей использования для выявления антигенов и пнтител, быстроты получения результатов, возможностей стандартизации и пнтоматизации. 13. Для чего ив каких реакциях используются меченые антигены и анти- ісла? Назовите три основных вида метки. Что собой представляют антиглобулиновые тесты и для чего они используются 15. В чем преимущества недостатки и опасности кожных тестов, проводимых непосредственно на испытуемых людях. В чем преимущества и недостатки пассивной иммунизации и какие виды препаратов для этого используются. Какие опасности для человека представляет применение сывороточных и вакцинных препаратов и каких можно избежать. Каковы основные виды вакцинных препаратов Какие способы приготовления вакцин считаются наиболее перспективными. Какие способы используются для обеспечения безвредности вакцинных и сывороточных препаратов. С какими целями используют моноклональные антитела Часть четвертая bbЧАСТНАЯ МЕДИЦИНСКАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ Предметом изучения частной медицинской микробиологии являются патогенные микроорганизмы или патогены, вызывающие инфекционные заболевания человека. При этом речь идет не только о так называемых карантинных инфекциях (острые кишечные инфекции, скарлатина, дифтерия и многие другие, при которых больные, как правило, госпитализируются в клиниках инфекционных болезней, но и о микробных заболеваниях, встречающихся в клиниках хирургического и терапевтического профиля. Наряду с патогенами особую роль в инфекционной патологии играют условно-патогенные микроорганизмы, главным образом бактерии и дрожжеподобные грибы. Они, как правило, принадлежат к нормальной микрофлоре организма человека, заселяющей определенные биотопы, ив норме не проявляют патогенных свойств, однако при иммунодефицитах ведут себя как настоящие патогены, вызывая инфекции, которые называют оппортунистическими Последние являются предметом изучения клинической микробиологии. В соответствии с природой возбудителей и их современной систематикой медицинскую микробиологию подразделяют на медицинскую бактериологию, медицинскую вирусологию, медицинскую микологию, медицинскую протозоологию ГЛАВА МЕДИЦИНСКАЯ БАКТЕРИОЛОГИЯ Предметом изучения медицинской бактериологии являются патогенные бактерии, принадлежащие к надцарству прокариотов, царству истинных бактерий. В силу чрезвычайного разнообразия данных возбудителей их систематическое положение может быть использовано для классификации вызываемых ими инфекционных болезней, например энтеробактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, выделены в группу возбудителей кишечных инфекций, хотя многие из них могут вызывать другие инфекционные болезни клебсиеллы — пневмонию, протей — гнойные инфекции и т.д. Поэтому данная классификация несовершенна. Более целесообразно использовать название бактерий для наименования соответствующих заболеваний. Например, заболевания, вызванные сальмонеллами, называть сальмонел лезами, шигеллами — шигеллезами, иерсиниями — иерсиниозами, кампилобактериями — кампилобактериозами и т.д. По патогенетическим особенностям инфекционные заболевания делят на респираторные, кишечные, урологические и др. Эпидемиологические критерии также используют для классификации инфекционных болезней, которые подразделяют на воздушно-капельные с аэрозольной передачей контактные, передающиеся при прямом контакте венерические — при половом контакте зоонозные — через животных и др 0 .1 . КОККИ 0 .1 .1 . Грамположительные кокки Грамположительные кокки широко распространены в природе. Большинство из них ведет сапрофитический образ жизни. Патогенные представители составляют ничтожное меньшинство. Они относятся только к двум родами, насчитывающих большое количество видов, и только несколько из них вызывают заболевания у людей. В подавляющем большинстве случаев речь идет о гнойно-воспалительных процессах различной локализации. Поэтому их часто называют гноеродными или пиогенными кокками. Стафилококки Открыты JI. Пастером в 1880 г. Род Staphylococcus включает 19 видов, из них только 3 вида экологически связаны с организмом человека S. aureus — стафилококк золотистый, S. epidermidis — стафилококк эпидермальный и S. saprophyticus — стафилококк сапрофитный. Заболевания, отличающиеся разнообразием клинических проявлений, вызывают золотистые, реже — эпидермальные и еще реже — сапрофитные стафилококки. Морфология и физиология Отдельные клетки стафилококков, имеющие форму правильного шара, при размножении образуют скопления в виде гроздьев винограда ( staphyle — виноградная гроздь) рис. 20.1 на цв. вкладке В препаратах из патологического материала, в частности из гноя стафилококки располагаются парами или небольшими скоплениями. Золотистые стафилококки образуют микрокапсулу. Стафилококки являются хемоорганотрофами с окислительными бродильным типами метаболизма. Они расщепляют многие углеводы в аэробных и анаэробных условиях. Диагностическое значение имеет способность сбраживать глюкозу и маннит в анаэробных условиях. Стафилококки — факультативные анаэробы, но лучше развиваются в аэробных условиях. На поверхности плотных питательных сред образуют круглые, выпуклые, пигментированные (золотистые, палевые, лимонно-желтые, белые) колонии с ровными краями в жидких средах дают равномерное помутнение. В лабораториях используют способность стафилококков размножаться в средах с большим количеством (6 -1 0 % ) хлорида натрия. Такую концентрацию соли другие бактерии не переносят, вследствие чего солевые среды являются элективными для стафилококков. Штаммы золотистых стафилококков, продуцирующие гемолизины дают на кровяном агаре колонии, окруженные зоной гемолиза рис. 20.2 на цв. вкладку Стафилококки образуют ферменты, сбраживающие многие углеводы. Дифференциально-диагностические значение имеет тест на сбраживание глюкозы в анаэробных условиях. Антигены. Стафилококки обладают разнообразными антигенами, локализованными в основном в клеточной стенке, S. aureus имеет также капсульный антиген. Из компонентов клеточной стенки антигенами являются пептидогликан, белок А, расположенный снаружи пептидогликана. Наличие белка А характерно для S. aureus. Этот белок способен к неспецифическому соединению с фрагментами IgG, в связи с чем стафилококки, обладающие белком А, способны агглю- .-« В Е су л іЕ н й антиген п ро хе н кош й антиген КС Ї Ш . х ухо о во і н дн в - і і 1 і в < і н А антиген ' клеточная стенка ц ят оплвамвт ячес квя мембрана цитоплазма Рис. 20.3. Антигенная структура стафилококка тинироваться нормальной человеческой сывороткой и давать неспе цифическое свечение при обработке гетерологичными флюоресцирующими сыворотками. Капсульный антиген S. aureus имеет сложное химическое строение. Он состоит из уроновых кислот, моносахаридов и аминокислот. У стафилококков описаны и типоспецифические антигены (рис. 20.3). Патогеность. Факторы вирулентности стафилококков, особенно S. aureus, связаны сих адгезией на рецепторах чувствительных клеток, колонизацией и агрессивными свойствами, проявляющимися н подавлении фагоцитоза. Адгезивная способность стафилококков выражена в отношении клеток и межклеточных веществ разных тканей эпителий, фибронектин, коллаген, фибриноген и др. При этом адгезия стафилококков на разных клетках и субстратах происходит за счет определенных адгезинов. Так, тейхоевые кислоты ответственны за адгезию на эпителиальных клетках. Стафилококки не прилипают к тромбам, если последние покрыты гноем, вследствие блокирования фибронектиновых рецепторов. Капсульные полисахариды также способствуют адгезии, в частности к эндопротезам. Важнейшим их свойством является индукция большого количества иммуноцитокинов, что приводит к возникновению очагов воспаления и образованию абсцессов. Капсульные полисахариды подавляют активность фагоцити рующих клеток. Белок А, содержащийся в клеточной стен к Staphylococcus aureus, обладает антифагоцитарными свойствами. Ом связывается с фибронектином — адгезивным гликопротеином, покрм вающим поверхность клеток и находящимся в базальных мембранах основном веществе соединительной ткани, а также циркулирующим в крови. Выраженным токсическим действием не обладает. Таким образом, белок А участвует в адгезии и обладает агрессивным деИ ствием. Из экзоферментов, продуцируемых главным образом S. aureus, существенную роль в патогенезе заболеваний играют плазмокоагулп за, гиалуронидаза, лецитиназа, фибринолизин, ДНК-аза. Плазмокоагулаза вызывает свертывание плазмы крови. Стафилококки, продуцирующие этот фермент, покрываются фибриновым чехлом, защищающим их от фагоцитоза. Большие концентрации коагу- лазы, циркулирующие в организме больного, приводят к понижению свертываемости крови, нарушению гемодинамики, прогрессирующему кислородному голоданию тканей. Гиалуронидаза, субстратом действия которой является гиалуроновая кислота, способствует распространению стафилококков в тканях вследствие нарушения их проницаемости. Лецитиназа разрушает лецитин в составе клеточных мембран лейкоцитов и других клеток, что способствует лейкопении. Фибринолизин растворяет фибрин, ограничивающий местный воспалительный очаг, чем приводит к генерализации инфекции. Патогенетические свойства других ферментов стафилококков (нукле- »зы, липазы, протеиназы, фосфатазы, часто сопровождающих коа- гулазную активность, четко не определены. Из ферментов, участвующих в патогенезе стафилококковых инфекций, только коагулаза и частично ДНК-аза характерны для S. aureus. Другие ферменты не постоянны. Токсины. Стафилококки секретируют ряд токсинов, отличающихся друг от друга по механизму действия. К ним относятся мембранопов реждающие токсины или мембранотоксины. Они образуют каналы в цитоплазматической мембране эритроцитов, лейкоцитов и других кле- кж, что приводит к нарушению осмотического давления и лизису соответствующих клеток. Ранее их называли гемолизинами, полагая, что они лизируют только эритроциты. Мембранотоксины отличаются друг от друга по антигенным свойствам, мишени и другим признакам, її-токсин обладает еще дермонекротическим и кардиотоксическим действием. Он представляет собой белок с выраженными иммуно- | сиными свойствами. Из него получен анатоксин, использующийся дня лечения и профилактики стафилококковых заболеваний. (3-ток- • мн наряду с мембраноповреждающим действием на эритроциты и гоединительнотканные клетки, угнетает хемотаксис полиморфно-ядер ных лейкоцитов, х-токсин разрушает эритроциты, лейкоциты и клетки соединительной ткани. Золотистые стафилококки могут образовывать гистотоксины, к которым относятся энтеротоксины, вызывающие пищевую интокси- •ИЩИЮ. Известно 6 энтеротоксинов (А, ВСЕ, различающиеся мо антигенным свойствам. Некоторые стафилококки продуцируют экзотоксин, вызывающий < иидром токсического шока. Чаще всего данные стафилококки яв обитателями мочевых путей женщин. Механизм действия этого токсина состоит в гиперактивации мо- И.ІЦИТОВ и макрофагов с последующей гиперпродукцией ИЛ, ТНФ (туморнекротизирующий фактор. Таким образом, данный токсин обладает всеми свойствами, присущими суперантигенам. Он представляет собой белок, образование которого кодируется хромосомными и плазмидными генами (профагом), находящимся в бактериальной хромосоме. Наряду с опосредованным действием данный экзотоксин оказывает прямое действие на кровеносные капилляры, увеличивая их проницаемость. Заболевание часто заканчивается летальным ис ходом. Патогенез. Преимущественное значение в патологии человека имеет золотистый стафилококк. В организм человека он может проникать различными путями. Стафилококки обладают полиорганным тропизмом, связанным сих способностью адгезировать на рецепторах клеток разных тканей и органов человека. Их пантропность выражается в способности вызывать гнойно-воспалительные процессы в коже, подкожной клетчатке, лимфоузлах (фурункулы, карбункулы, маститы, абсцессы и др, респираторном тракте (бронхиты, пневмонии, плевриты, органах (отиты, ангины, гаймориты, тонзиллиты и др, органах зрения (конъюнктивиты, язвы роговицы, желчевыводящих путях (холециститы, холангиты и др, мочеполовых органах (гломерулонефриты, уретриты, простатиты и др, опорно-двигатель ном аппарате (остеомиелиты, артриты, миозиты), а также пищевые отравления. Генерализация любой формы местного процесса может привести к сепсису или септикопиемии. Острые кишечные заболевания (ОКЗ) стафилококки вызывают у новорожденных. Стафилококки могут вызывать тяжелые формы ОКЗ, а также менингиты у детей младшего возраста. |