Микробиология Борисов Л.В. Микробиология Борисов Л. Литература для студентов медицинских вузов
 Скачать 27.52 Mb.
|
|
Лабораторные методы выявления гиперчувствительности. Клеточные реакции на антигены могут быть воспроизведены вне организма. Может быть определено воздействие антигена на клетки обследуемого в условиях их культивирования вне организма. Антиген активирует сенсибилизированные лимфоциты, которые вступают в реакцию бластрансформации, что может быть определено при микроскопии. Активация лимфоцитов может быть документирована также радиометрией по включению в ДНК культивируемых клеток радиоактивных предшественников. Другие методы оценки клеточной реактивности основаны на выявлении активности цитокинов, продуцируемых сенсибилизированными лимфоцитами после дополнительной активации антигеном. К таким тестам относится тест подавления миграции лецкоцитов, выделенных из крови, после добавления к ним испытуемого антигена. 11ри действии антигена на лимфоциты гиперчувствительного организма эти клетки продуцируют цитокины, в частности фактор, подавляющий миграцию лейкоцитов. Тест сводится к учету снижения миграционной активности взвеси лейкоцитов, помещенных в агаровый гель или в стеклянный капилляр, в присутствии антигена. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ Реакции между антигенами и антителами in vitro или серологические реакции широко используются в микробиологических и серологических (иммунологических) лабораториях с самыми разнообразными целями) серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний) сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов Серодиагностику проводят с помощью набора специфических антигенов, выпускаемых коммерческими фирмами. По результатам серодиагностических реакций судят о динамике накопления антител в процессе заболевания, о напряженности постинфекционного либо поствакцинального иммунитета. Сероидентификацию микробных культур проводят для определения их вица, серовара с помощью наборов специфических антисыво роток, также выпускаемых коммерческими фирмами. Каждая серологическая реакция характеризуется специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно. Чем выше специфичность, тем меньше ложноположительных и ложноотрицательных результатов. В серологических реакциях участвуют антитела, принадлежащие главным образом к иммуноглобулинам классов IgG и Все серологические реакции можно разделить на несколько групп. Реакции, протекающие с укрупнением частиц антигена в растворе электролита (хлорида натрия. К ним относятся реакции микробной агглютинации, пассивной агглютинации, реакция преципитации с ее многочисленными вариантами. Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена, — реакция нейтрализации токсина антитоксином (флоккуляция), реакция нейтрализации вирусов, реакция торможения гемагглютинации (РТГА); 19.2.3. Реакции, протекающие с участием комплемента. К ним относятся реакции связывания комплемента, гемолиза и их модификации 19.2.4 Реакции, протекающие с участием фагоцитов, — опсоно- фагоцитарная реакция и др Реакции, протекающие с участием меченых антигенов или антител, — реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный и им- муноферментный анализы (РИА, ИФА). 1 9 .2 .1 . Реакции, протекающие с укрупнением антигена Реакция агглютинации и ее варианты Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. Впервой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия. Механизм реакции агглютинации описывается теорией решетки (рис. 19.1), согласно которой агглютинат образуется присоединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой одного антигена, а второго активного центра — с детерминантной группой другого антигена. Избыток или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов. Характер и скорость реакции зависят от антигенного строения бактериальной клетки. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков. О-агглютинация протекает медленно. При наличии Н-антигена реакция проявляется в образовании крупно-хло пьевидного осадка и протекает значительно быстрее. Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувствительна. Поданным признакам она уступает другим серологическим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т.д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр сыво волвое іаіимиое пісшцепве aces нленіносіеі іпткгені Ж ІВТІІЄЛІ Рис. 19.1. Схема взаимодействия антигена с антителами ротки, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание, оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфек ции. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же анти сывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции антител по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки групповые антитела при сохранении в ней типос пецифических антител. Полученные сыворотки называются моноре- цепторными, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара. Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РПА). Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках или частицах. В качестве сорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, те. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела. Реакция преципитации и ее варианты. Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в дисперсном коллоидном состоянии, воздействием специфических антител в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и описываются теорией «решетки». Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гапте- на. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных анти сывороток. Водном из вариантов последовательные разведения антигена наслаивают на стандартное разведение диагностической сыворотки в пробирках, при этом осадок образуется в виде кольца на границе двух сред (кольцепреципитация). Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации визуально. Кроме того, помутнение может быть зафиксировано инструментальными методами — нефелометрией и др. Реакция преципитации применяется в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также в судебной медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белков, в частности белков кровяных пятен, спермы и т.д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и Рис. 19.2. Схема реакции преципитации в агаре мясных изделий. В биологии реакция преципитации используется для установления степени филогенетического родства различных видов животных и растений. Иммунодиффузия. Методы иммуно диффузии представляют собой вариант реакции преципитации, в которой взаимодействие антигена с антителами происходит не в жидкости, а в геле, что позволяет лучше выявлять и фиксировать результаты взаимодействия. В качестве геля чаще всего р Ис. 19.3. Реакция используется агаровый или полиакриламид- преципитации в агаре ный гель. Существует несколько вариантов постановки реакций. Чаще всего используется метод двойной диффузии, при котором растворы, содержащие антигены и антитела, помещают в лунки, вырубленные в пластинке геля, находящегося на стекле. При экспозиции антигены и антитела диффундируют из лунок и на месте их встречи образуется полоса преципитации, хорошо видимая невооруженным глазом. Если н растворах содержалось несколько антигенных компонентов и соответствующие антитела, то они диффундируют в геле с разной скооо- стью и могут образовать несколько полос преципитации (ри. 19.3). Что позволяет выявить не только факт присутствия антигена, но и число составляющих компонентов. Взаимное расположение полос при помещении в соседние лунки сравниваемых антигенов дает возможность судить об идентичности составляющих их антигенов. В другом варианте реакции раствор, содержащий антитела, смешивается с гелем до его застывания и помещения на стекло. Антиген помещается в лунку и при его диффузии в гель, содержащий антитела, образуется зона помутнения, диаметр которой пропоционален количеству антигена. Эта модификация метода, часто называемая по имени автора — метод Манчини, позволяет количественно опреде- иять антигены Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких, как сыворотка кпови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты различных органов и т.д. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) представляет собой сочетание электрофореза в геле с иммунодиффузией. Принцип ИЭФ состоит в следующем. Сначала проводят электрофоретическое разделение белков смеси антигенов) в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идет параллельно направлению миграции белков, вносят преци- питирующую иммунную сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, вместе их взаимодействия образуются дугообразные линии преципитации, количество, расположение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов. С помощью ИЭФ успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, белки микробного происхождения. В клинической практике ИЭФ используют при диагностике имму нодефицитных состояний, проявляющихся дисгаммаглобулинемией. В результате комбинации с другими методами анализа предложены диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, ракетный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноэлектрофорез, иммуноблотинг. Иммуноблотинг — один из современных высокоточных вариантов электрофореза с анализом разделенных белков иммунологическим методом. Тест осуществляется в три этапа сначала проводится- электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия. Разделенные антигены переносятся за счет капиллярных сил или дополнительного электрофореза наим мобилизующую нитроцеллюлозную мембрану. Находящиеся на мембране антигены анализируются с помощью меченых ферментной или радиоактивной меткой антител (иммуноферментным или радиоиммун- ным методом). Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест). Неполные антитела в отличие от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпи топом: в то время как другие эпитопы остаются несвязанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными антителами. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (А ГС ), содержащая бивалентные антитела к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные антитела, содержащиеся в исследуемом материале Таким образом произойдет визуально видимая реакция гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положитель- + 3 1 Н«оо.\ям« Ат я т і я ял І Ш І И а 5 5 » ( Е Э ^ Ш * с к і — о - к ф с а ! fe Рис. 19.4. Реакция Кумбса ным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус-положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции (рис. 19.4). 1 9 .2 .2 . Реакции, протекающие с нейтрализацией антигена Реакции нейтрализации основаны на способности антител нейтрализовать in vitro биологически-активные антигенсодержащие субстраты токсины, вирусы, яды змей и т.п. Реакция состоит в смешивании биологически-активного вещества с сывороткой, содержащей антитела, и выявлении нейтрализации его активности в биологическом тесте на животном или в культуре ткани. Реакция флоккуляции применяется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов, а также для определения типа токсина. Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в эквивалентных соотношениях сан титоксической сывороткой образовывать помутнение, а затем рыхлый осадок (флоккулят). Механизм реакции флоккуляции аналогичен таковому реакции преципитации. Одним из вариантов реакции нейтрализации токсина антитоксином является реакция нейтрализации гемолитических свойств токсина специфической антисывороткой. Реакция нейтрализации in может быть поставлена для выявления антитоксина в организме исследуемого человека. С этой целью в область предплечья внутрикожно вводят незначительное количество токсина, измеряемое в кожных дозах. Отсутствие покрасне- Р ГЛ га наг г д шит » отрицительная реакция частичная поляая гем в г гл в тя в в ц н я гамагглкітяввцвя положительные реакции Р Т ГА ш. КЯ я о т сут стажа г в маг гл ют в в а ц ж в положительная реакция+ ♦ ЧВСІВЧВВЯ ДОЛІВя гама г гл ют ж в а цв яга и а г гл в х в в а цв я отрицигельные реакции Торхожаяжс гемагглютжжацжж ир овсхоьвт ирв лаб иле в в в p tsaaM B B o l го коло г в а во автв еи аор откв ж о я а вв ва в тея "Рис. 19.5. Реакция гемагглютинации (РГА ) и торможения гемагглютинации (РТ ГА ) ния и припухлости вместе введения токсина свидетельствует о его нейтрализации циркулирующим в крови антитоксином. Данная реакция была предложена Шиком для выявления иммунитета к дифтерии и получила название кожной пробы Шика. Она применяется для решения вопроса о целесообразности иммунизации детей дифтерийным анатоксином с целью профилактики дифтерии. Реакция нейтрализации вирусов При перенесении многих вирусных заболеваний или вакцинации в сыворотке крови людей обнаруживаются антитела, нейтрализующие инфекционные свойства соответствующих вирусов. Их обнаруживают при смешивании испытуемой сыворотки с вирусом с последующим заражением чувствительного животного либо клеточной культуры. Через несколько суток регистрируют результаты опытов погибели подопытного животного или ЦПД в пробирке с клеточной культурой. Реакция нейтрализации вирусов нашла широкое применение в вирусологической практике для определения вида (типа) исследуемого вируса и титра вируснейтрализующих антител. В этих случаях используют соответствующие диагностические антисыворотки. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) является вариантом реакции нейтрализации вируса. Она основана на способности противовирусной антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию эритроцитов определенных видов животных (кур, гусей и др. Это объясняется способностью специфических антисывороток нейтрализовать вирусные гемагглютинины (рис. 19.5). РТГА широко применяется для идентификации и типирования вирусов, а также для выявления антигемагглютининов в сыворотке крови исследуемых людей 1 9 .2 .3 . Реакции, протекающие с участием комплемента Реакция связывания комплемента (РСК). Предложена Ж. Бор- дэ и О. Жангу в 1901 г. и, несмотря на столь длительное применение в лабораторной практике, не утратила своего значения по настоящее время. Более того, диапазон ее применения значительно расширился по мере открытия ранее неизвестных возбудителей новых инфекционных заболеваний бактерий, микоплазм, вирусов, грибов и других патогенов. Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения антигена в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, таки растворимых антигенов. Последнее связано стем, что комплемент связывается с F фрагментом антител независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом антиген — антитело за счет фрагментов последнего и не вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия рис. 19.6). Ге М ОЛЖТЖЧ 0 СКАЯ с х стема Рис. 19.6. Реакция связывания комплемента (Р С К Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплементарность. Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при Св течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. Привнесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Таким образом, в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген — антитело, те. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемен та системой антиген — антитело, те. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкрестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается +Реакция иммунного лизиса В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути см. 11.6) и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко — реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации холерных и холероподобных вибрионов). |