ГЛАВА-1. Методы фармакогностического анализа. Основные понятия, термины и определения
 Скачать 1.03 Mb.
|
|
Вынимая микроскоп из футляра, следует брать его за дугообразную изогнутую часть штатива (тубусодержатель). Микроскоп ставят на стол таким образом, чтобы дугообразный тубусодержатель был обращен к себе, а зеркало и предметный столик направлены от себя. Установленный в начале работы на столе микроскоп не следует перемещать с одного места на другое или сдвигать с места, так как при перемещении микроскопа нарушаются условия освещения. 1. Микроскоп установить напротив левого плеча, освободив место перед собой для дневника. Поставить объектив 8 в рабочее положение. О правильности установки объектива следует судить по щелчку, который ощущается при вращении револьвера. Расстояние между объективом и предметным столиком около 1 см. Работу с микроскопом всегда начинают с малого увеличения. 2. Глядя в окуляр левым глазом, с помощью вогнутого зеркала навести свет так, чтобы все поле зрения было освещено ярко и равномерно. В качестве источника света лучше всего использовать рассеянный дневной свет, матовую лампу или лампу дневного света. 3. Приготовленный микропрепарат положить на предметный столик так, чтобы один из срезов был расположен точно под объективом. Для фиксации микропрепарата предметное стекло прижать клеммой. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм. 4. С помощью макровинта установить фокусное расстояние для получения четкого изображения в микроскопе. Для просмотра всех срезов предметное стекло следует перемещать обеими руками, выбирая при этом наиболее тонкий срез для исследования. 5. Перед переводом микроскопа на большое увеличение выбрать нужное место среза, поставить его в центр поля зрения, и только после этого сменить объективы путем осторожного вращения револьвера. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины. 6. После смены объективов, если отсутствует четкое изображение, нужно слегка вращать макровинт, и только после этого можно пользоваться микровинтом. Микрометрический винт можно вращать в одну сторону не более, чем на половину оборота. 7. Изучая микропрепарат на большом увеличении, левую руку все время следует держать на рукоятке микровинта, чтобы фокусировать необходимую часть поля зрения. При работе с микроскопом смотреть в окуляр следует левым глазом, не закрывая при этом правый. 8. После окончания работы нужно перевести микроскоп на малое увеличение и убрать микропрепарат. Снимать микропрепарат из-под объектива 40 строго запрещается, иначе можно испортить фронтальную линзу объектива. 9. После работы протереть линзы салфеткой, опустить тубус. 1.3.1. Подготовка растительного материала для микроскопического анализа Если материал свежий и достаточно мягкий, срез может быть сделан сразу же. Излишне мягкие объекты для затвердевания помещают в спирт, последовательно увеличивая его концентрацию от 30% до 70%. Если материал сухой, твердый, то его размягчают горячим или холодным способом. При горячем способе объект нагревают в воде или лучше в воде с глицерином (2:1) в химическом стакане или в фарфоровой чашке. Продолжительность нагрева зависит от твердости материала и длится от одной минуты до нескольких часов и даже суток. От этого же зависит и температура: так кора в горячей воде размягчается в течение 3-5 минут, подземные органы, в зависимости от плотности ткани – через 20-30 минут. Следует отметить, что при горячем методе размягчения разрушаются некоторые клеточные включения. Поэтому им пользуются в тех случаях, когда для определения объекта имеет значение только его структура, а также с целью срочного получения срезов. Реже для размягчения объектов применяют способ распаривания. Для этого в колбе или химическом стакане кипятят небольшое количество воды, над которой подвешивают завернутые в марлю объекты. Листья достаточно держать в парах 12 минуты, а плоды и семена – 15-16 минут и более. Некоторые клеточные включения (кристаллические) при этом способе разрушаются. Листья и цветки не требуют сложной и продолжительной обработки. Для размягчения и просветления их кипятят в 3-5% растворе едкой щелочи или в воде в течение 2-5 минут в зависимости от толщины и плотности объекта, не допуская сильного размягчения. После размягчения содержимое выливают в чашку Петри и тщательно отмывают водой. Недостаток этого метода – сильное разбухание клеточных оболочек и вымывание содержимого клеток. При холодном способе размягчения кусочки исследуемого материала помещают в сосуд с водой или смесь воды с глицерином (2:1), или воды, глицерина и спирта (1:1:1), где выдерживают не менее 1-3 суток. Длительность размягчения зависит от твердости материала. Холодный способ пригоден для всех видов объектов, но он более длителен по сравнению с горячим. С целью предохранения от заплесневения в размачивающую среду добавляют немного карболовой кислоты или тимола. Для размягчения объектов, в которых необходимо сохранить растворимое содержимое клеток, следует пользоваться влажной камерой. В этом случае используется эксикатор с водой, на пластинку которого помещают объект. В воду эксикатора прибавляют карболовую кислоту, чтобы размягчаемый материал не плесневел. Этот способ более длителен. Объекты мягкие, тонкие оставляют во влажной камере на сутки, твердые – на 2-3 суток. 1.3.2. Техника приготовления микропрепаратов После соответствующе подготовки сырья из него готовят микропрепараты. Приготовление препарата зависит как от морфологической группы сырья, так и от его состояния – цельное, резаное, порошкообразное. Различают технику приготовления временных и постоянных микропрепаратов. Техника приготовления временных микропрепаратов. При изготовлении временных препаратов изучаемый объект помещают на предметное стекло в каплю воды или глицерина, раствора реактива или красителя и аккуратно накрывают покровным стеклом. Такой препарат хранят не более месяца. Отдельные органы растений, например споры, листья некоторых видов и другие, можно рассматривать под биологическим микроскопом целиком, без предварительного изготовления срезов (in toto). Однако число объектов, которые можно изучать на тотальных препаратах, невелико. Чаще приходится делать срезы органов, подлежащих изучению. Срезы готовят из свежих или фиксированных частей растений. Обычно для фиксации употребляют раствор спирта или формалина. Основная цель при приготовлении микропрепарата – получить ясную и чёткую картину анатомических признаков растения в поле зрения микроскопа. Это достигается следующим: 1. образец ткани должен быть как можно более тонким (идеальный случай – толщиной в одну клетку); 2. образец должен быть помещён во включающую жидкость, коэффициент преломления которой близок к коэффициенту преломления стекла; 3. ткань должна быть прозрачной и пропускать достаточно света; 4. некоторые гистологические элементы ткани необходимо покрасить, чтобы они стали заметны. Техника получения тонких образцов зависит от конкретной ткани. По способу приготовления препараты делятся на давленные, сдиры и срезы. Давленные препараты получают из мягких мацерированных тканей (например, плодов). Для этого на предметное стекло помещают кусочек ткани, заливают включающей жидкостью, закрывают покровным стеклом и осторожно растирают, пока ткань не распределится равномерно под стеклом. Не следует применять силу, чтобы не повредить клетки ткани. Сдиры обычно готовят из тонких слоистых тканей (например, эпидермиса), которые легко отделяются от нижележащих тканей. Небольшой кусочек ткани поддевают препаровальной иглой, помещают в большую каплю включающей жидкости, расправляют, закрывают покровным стеклом. Излишек жидкости отсасывают фильтровальной бумагой. Срезы приготавливаются наиболее часто. Это наиболее трудоёмкий препарат, поэтому ткань необходимо подготовить. Цельное сырьё перед приготовлением срезов обычно подготавливают холодным размачиванием, кипячением, размягчением в водяных парах во влажной камере. Чаще применяется метод холодного размачивания, рекомендуемый для всех органов растения. Холодное размачивание. Исследуемое сырье помещают в банку или чашку с жидкостью (2 ч. воды и 11 ч. глицерина) с добавлением кристаллика карболовой кислоты. В течение 1-2 сут размачивают мелкие семена, плоды, листья, травы, цветки. Коры, корни, корневища, твердые семена рекомендуется размачивать около 3 сут, иногда до 4-5 сут. После размачивания сырье перекладывают в 96% спирт с небольшим количеством глицерина (чтобы меньше улетучивался спирт). Делают срезы поперечные, продольные (радиальные или тангенциальные) бритвой, лезвием или на микротоме. Мелкие объекты резать трудно, поэтому их помещают в парафин, пробку или в сердцевину бузины. Приготовление срезов. Срезы делают при помощи бритвы. Для изготовления срезов мелкие объекты помещают в разрез сердцевины стебля бузины, пробки, клубня картофеля или корня моркови (рис. 19 А). Цилиндрические органы (стебель, корень) можно разрезать в направлениях: поперечном, продольном радиальном, продольном тангентальном (рис. 19 Б). Объект зажимают между большим и указательным пальцами левой руки (большой палец должен быть ниже уровня среза). Прежде чем делать срез острым ножом или скальпелем выравнивают поверхность исследуемого объекта. Она должна быть совершенно ровной, без шероховатостей; для поперечных срезов – строго перпендикулярной к длине оси стебля или корня, иначе получится косой срез, на котором невозможно разобраться в строении органа. Затем делают тонкий срез бритвой.
|
