ГЛАВА-1. Методы фармакогностического анализа. Основные понятия, термины и определения
 Скачать 1.03 Mb.
|
|
При наличии клещей выделяют: 1 степень – до 20 клещей; 2 степень – больше 20, но они свободно передвигаются по сырью; 3 степень – больше 20, клещи образуют сплошные войлочные массы. В сырье, оставшемся на сите, определяют наличие моли, хлебного точильщика и их личинок. 1 степень – до 5 штук 2 степень – от 6 до 10 3 степень – больше 10. Возможность дальнейшего использования лекарственного сырья, зараженного амбарными вредителями, определяется степенью зараженности и видом сырья. Так, при 1-ой степени зараженности сырье может быть использовано в медицинской практике как для изготовления экстемпоральных лекарственных форм, так и для получения препаратов на фармацевтических фабриках и заводах по переработке лекарственного растительного сырья. Предварительно проводят соответствующую обработку сырья (дезинсекцию и рассортировку, просеивание сквозь сито 3 мм в случае зараженности молью и другими вредителями и сквозь сито 0,5 мм в случае зараженности клещами). При 2-ой и 3-ей степени зараженности амбарными вредителями сырье уничтожают и лишь только в исключительных случаях используют для получения (выделения) индивидуальных веществ. Наиболее простым способом дезинсекции является термическая обработка. Зараженное сырье помещают в сушильные камеры и выдерживают при температуре 50-60°С в течение 1-2 часов. Для уничтожения вредителей проводят также окуривание сырья и помещений сернистым газом, хлорпикрином, обработку парами хлороформа. Оформление результатов анализа. Результаты испытаний оформляются протоколом анализа, который должен отражать фактические данные экспериментальной проверки, иметь заключение о соответствии требованиям нормативного документа, и должен быть подписан провизором-аналитиком, непосредственно проводившим анализ, и руководителем контрольно-аналитической лаборатории. Протокол выписывается в двух экземплярах. Первый экземпляр передается в отдел хранения склада и служит основанием для отпуска сырья аптечным учреждениям, второй хранится в лаборатории. На основании протокола анализа выписывается аналитический паспорт и выдается сертификат соответствия, который еще раз подтверждает качество сырья и дает возможность реализовать его в пределах области или республики. Например, если анализ проведен в Московской области инспекции по контролю качества лекарственных средств, то такое сырье можно реализовывать только в пределах Московской области. В пределах России реализуется сырье с российским сертификатом качества, который выдается сроком на 1 год, при необходимости он может быть продлен. Эти документы имеют юридическую силу, оформляются только чернилами, без помарок, подтверждаются подписями и печатями. Все отношения между поставщиком, и приемщиком сырья (аптечные склады, промышленное фармацевтическое производство – фабрика или завод, фирмы-посредники, базы) закрепляются договором, в котором оговариваются права и обязанности сторон, какая сторона несет расходы на транспортирование, рассортировку изолирование или уничтожение сырья в случае его брака. На основании заключения при несоответствии сырья нормативному документу, претензия предъявляется поставщику. В случае отказа поставщика в удовлетворении претензии, сырье направляется на арбитражный контроль в Государственный научно-исследовательский институт по стандартизации и контролю качества лекарственных средств. До получения результатов арбитражного контроля партия сырья или серия должна храниться изолированно. В случае необоснованного направления лекарственного сырья на контроль стоимость анализа относится за счет учреждения, направившего его на арбитражный контроль. Единицы продукции, оставшиеся от проведения анализа, хранятся не менее 3 месяцев, после чего, сырье, удовлетворяющее требованиям нормативного документа, безвозмездно передается с согласия поставщика в учреждения здравоохранения, не удовлетворяющие – уничтожаются с оформлением акта уничтожения. Товароведческий анализ в аптеках. В аптеку лекарственное растительное сырье поступает от частных лиц. Для заготовки сырья от дикорастущих лекарственных растений частное лицо должно иметь лицензию на данный вид деятельности. Анализ растительного сырья в аптеке заключается в проверке подлинности сырья по внешним признакам (визуально), качественным реакциям, указанным в нормативном документе, и определении чистоты (наличия или отсутствия посторонних примесей). В соответствии с приказом Минздрава РФ № 214 от 16 июля 1997 года, результаты анализа регистрируются в специальном журнале. Прием лекарственных растительных средств оформляется квитанцией, выписанной в 3-х экземплярах. В конце заготовительного сезона от каждого вида сырья в аптеке отбираются средняя проба, а также пробы для определения микробиологической чистоты и отсутствия радионуклидов. Отобранные пробы направляются в Инспекцию по контролю качества лекарственных средств для проведения анализа по всем показателям, предусмотренным для лекарственного сырья действующей нормативной документацией. Реализация лекарственного растительного сырья, принятого от заготовителей, производится только после письменного заключения лаборатории. ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ (КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ). Для установления подлинности лекарственного растительного сырья используются простейшие качественные реакции и хроматографические пробы на основные действующие или сопутствующие вещества, которые изложены в нормативно-технических документах на исследуемый вид сырья, в разделе «Качественные реакции». По технике выполнения и характеру получаемых результатов, химические реакции, применяемые для установления подлинности лекарственного сырья, можно разделить на 4 группы: качественные реакции, микрохимические реакции, гистохимические реакции и сублимацию (микросублимацию). 1.5.1. Качественные реакции Качественными являются реакции, для проведения которых готовят водные экстракты (реже с добавлением щелочи, кислоты или с использованием органического растворителя) из исследуемого сырья. Результаты реакции наблюдают при добавлении реактива к полученному экстракту. Качественные реакции могут быть двух типов: 1. На действующие вещества (алкалоиды, гликозиды, сапонины, дубильные вещества и др.) например: - дубильные вещества обнаруживают при реакции с 1% раствором железоаммониевых квасцов (образуется черно-синее или черно-зеленое окрашивание); - сапонины легко обнаруживаются по образованию стойкой пены при энергичном встряхивании водного отвара; - алкалоиды открывают в уксуснокислых извлечениях (1-5% растворе уксусной кислоты) по образованию красно- или оранжево-бурого осадка с реактивом Драгендорфа – капельная реакция; - инулин открывают по реакции Молиша. На соскоб или порошок наносят 1-2 капли спиртового раствора альфанафтола или тимола и одну каплю концентрированной серной кислоты. При наличии инулина образуется характерное фиолетовое или синее окрашивание; - антрагликозиды открываются по реакции со щелочью появляется кровавокрасное окрашивание; - слизь определяют следующим образом: на предметное стекло помещают порошкованное сырье, добавляют несколько капель туши. Слизь заметна в виде бесцветных масс на черном фоне. 2. На сопутствующие вещества (запасные питательные вещества, пигменты и др.), имеющие диагностическое значение для отдельных видов лекарственного сырья, например: - крахмал открывают по реакции с раствором Люголя. При соприкосновении с йодом крахмальные зерна окрашиваются в синий цвет. Окраска исчезает при нагревании. Приготовленный препарат надо исследовать тотчас, так как окраска держится недолго; - жиры (жирное масло) определяют по реакции с Cуданом III, который окрашивает их в оранжево-красный цвет; - белок определяют, используя одну из двух реакций: 1). биуретовая реакция – под воздействием водного раствора медного купороса и едкой щелочи белки окрашиваются в фиолетовый цвет; 2) ксантопротеиновая реакция – под воздействием крепкой азотной кислоты белок желтеет, желтизна усиливается до оранжевого цвета. 1.5.2. Гистохимические и микрохимические реакции для анализа лекарственного растительного сырья Микрохимические реакции проводят обычно одновременно с микроскопическим анализом лекарственного растительного сырья, наблюдая их результаты под микроскопом, что во много раз повышает чувствительность реакции. Гистохимические реакции – это реакции, с помощью которых можно выявить те или иные соединения непосредственно в клетках и структурах, где они локализуются. Гистохимические реакции проводят на срезах свежего или фиксированного особыми способами материала; в некоторых случаях можно пользоваться высушенным растительным материалом. Результаты реакции наблюдают под микроскопом, вначале при малом увеличении, затем при большом. Наиболее четкие результаты получаются, когда в итоге образуется нерастворимое соединение. Если при взаимодействии реактива с изучаемым соединением образуются растворимые продукты, то реакцию необходимо проводить очень быстро и наблюдать ее результаты в момент проведения или сразу же после нанесения реактива, пока не началась диффузия. Гистохимические реакции дают дополнительные сведения для установления подлинности лекарственного растительного сырья. Кроме того, они часто позволяют обнаружить вещества непосредственно в тканях и клетках, таким образом, дают возможность определить их локализацию в тканях растения, что имеет важное значение при решении многих практических вопросов использования растительного сырья. Гистохимические реакции позволяют обнаруживать вещества в ничтожно малых количествах, что обусловливает необходимость большой пунктуальности и чистоты в работе. Непременным условием гистохимической реакции является ее специфичность, поэтому при наличии в исследуемом объекте других веществ, дающих такие же результаты реакции, их необходимо предварительно удалить. Нередко пользуются контрольными опытами, которые проводят с объектом, освобожденным различными обработками от исследуемого вещества. Срезы для проведения гистохимических реакций не должны быть слишком тонкими. Один-два слоя клеток должны быть неразрушенными, с сохранившимся содержимым. Следует также учитывать, что малое количество обнаруживаемых веществ требует минимального количества реактивов. Надо иметь в виду и то обстоятельство, что многие реактивы нестойки, поэтому требуют особых условий хранения или должны быть свежеприготовленными. В противном случае могут быть как отрицательные результаты реакции, так и образование артефактов. Гистохимические реакции проводят на срезах свежего или фиксированного особыми способами материала. Многие реакции, особенно, если они ставят своей целью только открытие того или иного вещества, а не его локализацию, проводят с измельченным сухим материалом (соскоб, порошок). В этом случае следует применять термин «микрохимические реакции». Реакции проводят на предметном стекле, часовом стекле или в закрытом бюксе, в зависимости от характера и продолжительности воздействия реактива. Результаты реакции наблюдают под микроскопом в начале при малом увеличении, а затем при большом. Многие гистохимические реакции требуют очень быстрого проведения и наблюдения их результатов, пока не произошла диффузия исследуемого вещества или не разрушились ткани объекта от воздействия реактива (концентрированные кислоты и др.). Наиболее часто используемые гистохимические (микрохимические) реакции приведены ниже. Реакции на чистую клетчатку. Реакция с хлор-цинк-йодом. Существует много модификаций приготовления реактива. Все они дают хорошие результаты. Наиболее часто используют следующую модификацию (по Новопокровскому): 20 г хлорида цинка растворяют в 8,5 мл воды при нагревании; 1,5 г йода и 3 г иодида калия растворяют в 60 мл воды. Последний раствор вливают по каплям в первый при тщательном встряхивании. При появлении осадка, исчезающего при встряхивании, добавление раствора прекращают. Обычно для этого достаточно 1,5 мл раствора. Готовый реактив хранят в склянке темного стекла. Реакцию проводят на предметном стекле. Срез помещают в каплю воды, расправляют и воду отсасывают фильтровальной бумагой. Каплю реактива наносят на срез и накрывают покровным стеклом. Под микроскопом наблюдают сине-фиолетовое или лиловое окрашивание оболочек клеток, состоящих из чистой клетчатки. Реакция растворения в реактиве Швейцера. Реактив Швейцера является единственным растворителем, в котором клетчатка вначале набухает, а затем растворяется. Существует несколько способов приготовления реактива. Один из них: 10 г сульфата меди растворяют в 10 мл воды и приливают в достаточном количестве для осаждения гидрата окиси меди раствор едкого натра. Осадок собирают на фильтре, промывают водой до исчезновения реакции на сульфаты и растворяют в минимальном количестве раствора аммиака. Сохраняют в доверху заполненных темных склянках с притертой пробкой. Реакцию проводят на предметном стекле. Срез помещают в каплю реактива, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. Вначале становятся отчетливо видны детали структуры клеточной оболочки, затем они набухают и медленно растворяются. Кутикула при этом не растворяется. Реакции на одревесневшую клетчатку (лигнифицированную оболочку). Реакция с флороглюцнном и соляной кислотой. Срез помещают на предметное стекло в 1% раствор флороглюцина в спирте, отсасывают реактив фильтровальной бумагой, на срез наносят каплю концентрированной соляной кислоты и через 1-2 мин прибавляют каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом при малом увеличении. Одревесневшие оболочки клеток приобретают вишневое окрашивание, интенсивность которого определяется степенью лигнификации. Реакция с перманганатом калия (реакция Меуле). Срезы помещают в 1% раствор перманганата калия на часовом стекле. Через 5 мин их промывают водой и помещают на 2 мин в 10% соляную кислоту. После этого промывают, переносят на предметное стекло в каплю раствора аммиака и накрывают покровным стеклом. Одревесневшие оболочки клеток окрашиваются в красный цвет. Реакции с флюроглюцином и с перманганатом калия выявляют различные компоненты лигнина (лигнин Ф и лингин М), поэтому полученные при проведении этих двух реакций результаты не всегда совпадают. Лигнифицированные оболочки хорошо окрашиваются основными красителями. Наиболее часто используется сафранин или его комбинации с другими красителями, окрашивающими чистую клетчатку. Реакция с сафранином. Срезы помещают в 1% раствор сафранина в 50% спирте на 30 мин (в закрытом бюксе или на часовом стекле), промывают 50% спиртом,- затем подкисленным спиртом (на 100 мл спирта прибавляют 2 капли концентрированной соляной кислоты) для извлечения краски из неодревесневших элементов (5-10 с) и заключают на предметном стекле в глицерин. Лигнифицированные оболочки окрашиваются в красный цвет. Реакция с сафранином и анилиновым синим. Срезы помещают на сутки в бюкс с 1% раствором сафранина в 50% спирте. Затем промывают 50% спиртом и на 2-3 мин переносят в 1% раствор анилинового синего в спирте. После этого промывают 50% спиртом, переносят на несколько секунд в подкисленный спирт, промывают спиртом, содержащим следы соды, затем чистым спиртом и заключают в глицерин. Лигнифицированные оболочки окрашиваются в красный цвет, чистая клетчатка – в синий. Реакция с сульфатом анилина. Из многих модификаций приготовления реактива чаще используют следующую: 5 г сульфата анилина растворяют в смеси 40 мл воды и 50 мл 50% спирта, доводят водой до 100 мл. Окрашивание срезов проводят на предметном стекле. Одревесневшие оболочки приобретают устойчивую желтую окраску. Реакция с пара-нитроанилином. 1% раствор пара-нитроанилина быстро окрашивает лигнифицированные оболочки в оранжевый цвет. Срезы окрашивают на предметном стекле и заключают в глицерин. Реакции на опробковевшую и кутинизированную клетчатку. Опробковевшие (суберинизированные) и кутинизированные оболочки клеток не дают реакций, характерных для чистой клетчатки. Суберин и кутин в составе клеточной оболочки можно обнаружить красителями, окрашивающими жиры. Существуют и специфические реакции на суберин и кутин. Реакция с суданом III. Реактив готовят растворением 0,1 г красителя в 50 мл спирта, после чего к раствору прибавляют 50 мл глицерина. Срезы помещают на предметное стекло в раствор реактива, накрывают покровным стеклом и слегка нагревают для ускорения окрашивания. Отсасывают реактив фильтровальной бумагой и срез заключают в глицерин. Опробковевшие и кутинизированные оболочки клеток окрашиваются в оранжево-красный цвет. Аналогичное окрашивание наблюдается при использовании 0,1-0,2% раствора шарлахового красного в 70% спирте. Окрашивание проводится без нагревания (20-30 мин) или при легком нагревании для ускорения процесса. Реакция на суберин с едким кали. При нагревании среза в 30% растворе едкого кали в воде опробковевшие оболочки окрашиваются в желтый цвет. Реакция проводится на предметном стекле. При нагревании среза в 3% растворе едкого кали в спирте наблюдается частичное растворение суберина и на поверхности оболочки видны капли суберина. Реакция на кутин с серной кислотой. Срез помещают в каплю концентрированной серной кислоты, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. В реактиве хорошо выявляется сложность оболочки; кутикула и кутикулярные слои окрашиваются в желтовато-бурый цвет. Реакции на углеводы. Реакция на сахара с фенилгидразином. Готовят два раствора: а) 1 г солянокислого фенилгидразина в 40 мл глицерина; б) 1 г ацетата натрия в 10 мл глицерина. Растворяют при нагревании на водяной бане. Раствор хранят в темноте в склянках темного стекла. Перед употреблением растворы смешивают в равных количествах (лучше на предметном стекле). Срез свежего растительного материала помещают в реактив на предметном стекле, накрывают покровным стеклом и наблюдают через некоторое время под микроскопом. Параллельно готовят в тех же условиях другой препарат и изучают под микроскопом после нагревания на водяной бане. При наличии моносахаридов кристаллы озазона выпадают без нагревания (через несколько часов – фруктоза, или дней – глюкоза) или при кратковременном нагревании (10 мин). При длительном нагревании (около 1-2 ч) образуются кристаллы озазона за счет гидролиза сахарозы. В зависимости от условий реакции и природы сахара образуются разнообразные кристаллы озазона: мелкие сферокристаллы или золотисто-желтые пучки и звездчатые сростки игольчатых кристаллов. Обнаружение крахмала под микроскопом. Крахмальные зерна хорошо видны в воде и в глицерине. Яркая картина наблюдается в поляризованном свете; в результате двойного луче преломления крахмальные зерна дают черный крест, полосы которого пересекаются в центре наслоений зерна. Реакция с йодом на крахмал. Применяется раствор йода в йодиде калия (раствор Люголя), раствор йода в спирте или в какой-либо просветляющей жидкости. Смоченный водой крахмал окрашивается в синий или сине-фиолетовый цвет, сухой – в темно-бурый цвет. Присутствие продуктов частичного гидролиза крахмала – декстринов, обнаруживается по красному или красно-фиолетовому окрашиванию. Реакция с йодом является единственной цветной реакцией на крахмал. Исследуемый объект (порошок) или срез помещают в каплю реактива, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом. Крахмальные зерна приобретают синее или синефиолетовое окрашивание. Следует помнить, что окраска исчезает при нагревании. Приготовленный препарат надо исследовать тотчас, так как окраска держится недолго. Если в объекте крахмала мало, то лучше использовать раствор йода в хлоралгидрате: к готовому раствору хлоралгидрата прибавляют (в избытке) кристаллический йод и взбалтывают. Реактив хранят в темном месте. Хлоралгидрат просветляет объект и вызывает клейстеризацию крахмальных зерен, что улучшает результаты реакции. Реакция осаждения инулина спиртом. Инулин обнаруживается в растительном материале, фиксированном спиртом, в виде слоистых сферокристаллов. В горячей воде сферокристаллы инулина растворяются. Кусочки свежего растительного материала помещают на несколько дней (недель) в 70% спирт. Приготовленные из него срезы наблюдают в спирте или глицерине. Инулин имеет форму сферокристаллов, состоящих из тончайших иголочек. При добавлении воды и последующем нагревании кристаллы инулина растворяются. Реакция Молиша на углеводы. Положительные результаты дают все углеводы: сахара, крахмал, инулин. Реактивы: а) 10-20% раствор тимола (или α-нафтола) в спирте; б) концентрированная серная кислота. Срез помещают в раствор тимола (или α-нафтола), прибавляют каплю концентрированной серной кислоты и накрывают покровным стеклом. При наличии углеводов появляется оранжево-красное (тимол) или красно-фиолетовое (α-нафтол) окрашивание. С порошком или соскобом сухого материала реакцию можно проводить на часовом стекле; результаты реакции хорошо видны невооруженным глазом (смотреть на белом фоне). Реакции на слизь. Растительные слизи являются полисахаридами разнообразного состава. Для их обнаружения в растительном материале чаще всего используют реакции, основанные на физических свойствах слизей. Реакция осаждения слизи в спирте и набухания в воде. Срез свежего растительного материала помещают в спирт, накрывают покровным стеклом и наблюдают в микроскоп. Слизь видна в клетках в виде комочков, сильно преломляющих свет. Если с одной стороны покровного стекла нанести каплю воды, а с другой отсасывать спирт фильтровальной бумагой, то можно заметить постепенное набухание слизи в воде. Заменив воду на спирт, увидим обратный процесс – осаждение слизи. Реакция с бензидином. Состав реактива: 1 г бензидина растворяют в смеси 10 мг ледяной уксусной кислоты и 30 мл воды при нагревании. Доводят водой до 50 мл. Кусочки исследуемого материала помещают на 48 ч в раствор бензидина, после чего готовят из него срезы и заключают в глицерин. Клетки, содержащие слизь, окрашиваются в желтый или оранжевый цвет. Наряду со слизью окрашиваются одревесневшие, опробковевшие, кутинизированные оболочки клеток. Реакция с метиленовым синим. Используется раствор метиленового синего в спирте (1:5000). Срез помещают в реактив на несколько минут, затем переносят в глицерин - слизь окрашивается в голубой цвет. Можно использовать раствор метиленового зеленого. Реакция с сульфатом меди и щелочью. Срезы помещают на 5-10 мин в концентрированный раствор сульфата меди, промывают водой и переносят в 50% раствор едкого кали. Слизь окрашивается в голубой цвет (растения семейства мальвовых, орхидных) или в зеленый (растения семейства лилейных). Реакция двойного окрашивания. Срез помещают на 20 мин в раствор хлорида окисного железа, затем переносят на 2-3 мин в раствор метиленового синего, промывают водой и заключают в глицерин. Особенно наглядна реакция со срезом корня алтея: клетки со слизью окрашиваются в желтый цвет, механические волокна – в голубой, сосуды древесины – в зеленый. Реакция с тушью. Обычную черную тушь разводят водой 1:10 (реактив приготовляют по мере надобности). Исследуемое сырье измельчают в порошок и помещают на предметное стекло в каплю туши, тщательно размешивают и накрывают покровным стеклом. В поле зрения микроскопа на темно-сером (почти черном) фоне (тушью окрашены все ткани) выделяются белыми пятнами клетки со слизью, так как тушь в слизь не проникает. Реакции на жиры. Жиры во многих объектах встречаются в качестве запасного питательного вещества и содержатся в значительных количествах. Под микроскопом капли жира видны благодаря их оптическим свойствам: светло-серого цвета и ограничены узким, черным кольцом; при опускании тубуса черный край исчезает и окружность становится более светлой. Часто используют различные красители. Реакция с суданом III. Приготовление реактива и проведение реакции смотри выше (стр. 20). Окрашивание жиров можно провести без нагревания. В этом случае срез помещают в реактив на сутки, затем промывают 50% спиртом и заключают в глицерин. Судан III окрашивает жиры в оранжево-красный цвет. Реакция с шарлаховым красным. Данная реакция дает точно такие же результаты, как и при использовании судана III. Обе реакции окрашивания обусловлены растворением красителя в жире. Указанные реакции на жиры не специфичны. Названные красители также окрашивают эфирные масла, смолы, содержимое млечников, кутин, суберин. Для получения достоверных результатов необходимо провести пробу на омыление. Омыление по Розенталеру. Срез помещают в 15% раствор едкого кали в воде и слегка подогревают. Через некоторое время образуются игольчатые кристаллы жирнокислых солей (мыла). Реакция может быть выполнена и в другой модификации: на предметное стекло наносят каплю 15% раствора едкого кали и каплю 20% раствора аммиака, помещают срез, накрывают покровным стеклом и края его обводят расплавленным парафином для предупреждения высыхания. Через 1-2 дня вокруг масла образуются игольчатые кристаллы мыла. Реакции на смолы. Смолы содержатся в растениях в особых вместилищах, смоляных ходах, млечниках, нередко совместно с эфирными маслами. Специфической реакции на смолу нет. Реакция с ацетатом меди. Кусочки исследуемого материала помещают в концентрированный раствор ацетата меди на несколько дней. Затем готовят срезы, помещают в глицерин, накрывают покровным стеклом, изучают под микроскопом. Смолы окрашиваются в изумрудно-зеленый цвет. Реакции окрашивания. Смолы окрашиваются многими красителями: суданом III, шарлаховым красным, алканином и др. (смотри выше), которые, однако, окрашивают и многие другие вещества растений. Реакции на эфирные масла. Эфирные масла являются сложной смесью соединений. В растениях они локализуются в различных вместилищах или специализированных клетках. Их можно видеть в препаратах без применения красителей: они имеют вид капель, сильно преломляющих свет; при осмолении эфирного масла капли имеют темножелтый, зеленовато-желтый или коричнево-красный цвет. Для окрашивания эфирных масел применяют те же красители, что и на жиры, смолы (судан III, шарлаховый красный). Для отличия эфирных масел от жиров и смол применяют раствор метилового синего в воде (0,1 г метилового синего растворяют в 500 мл воды). Объекты помещают на несколько минут в реактив и затем просматривают в воде или глицерине. Эфирное масло окрашивается в синий цвет. Такой же результат дает применение индофенолового синего или смесь этих красителей. Другой способ отличия эфирных масел от жиров и смол основан на их летучести или растворимости. Объекты подвергаются кипячению воде или действию сухого жара. Эфирное масло при этом улетучивается, а жиры остаются, они дают реакции с основными красителями. Для извлечения эфирных масел применяют ледяную уксусную кислоту, в которой многие эфирные масла растворяются, а жиры нет. Реакции на млечный сок (латекс). Содержимое млечников, представляющее собой эмульсию, включает разнообразные вещества: жиры, белки, камеди, каучук, гуттаперчу, воск, сахар, минеральные соли и другие вещества более специфического характера, такие, как алкалоиды, гликозиды, горечи. Млечный сок благодаря ряду веществ, входящих в его состав, окрашивается раствором судана III в оранжево-красный цвет и раствором алканина – в вишнево-красный. При высушивании растительного материала млечный сок коагулирует, и в полости млечных трубок образуются сгустки, которые иногда обнаруживаются при разломе кусков сырья в виде тонких, растягивающихся нитей (кора эвкоммии). В микропрепаратах после просветления объекта в растворах едкой щелочи, хлоралгидрата содержимое млечников имеет вид серых или желтовато-бурых сгустков. Реакции бромирования по Прокофьеву. Основана на открытии в млечном соке каучука, гуттаперчи. Срезы свежего растительного материала фиксируют спиртом в течении 5 мин, обрабатывают хлорной известью (в бюксе), промывают 10% азотной кислотой (1 мин), затем 3-4 раза водой и помещают в глицерин. Через несколько минут срезы переносят на предметное стекло в раствор брома в глицерине, накрывают покровным стеклом и оставляют на 12-24 ч (в темноте!). После бромирования срезы, не снимая с предметного стекла, промывают спиртом, затем глицерином и изучают под микроскопом. Бромид каучука имеет вид крупнозернистой массы бурого цвета. Раствор брома в глицерине готовят в вытяжном шкафу; к нейтральному глицерину прибавляют по каплям бром до насыщения. Хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Реакции на алкалоиды. В живом растении алкалоиды содержатся в виде раствора в клеточном соке; при высыхании растительного материала они образуют неразличимые в обычном микроскопе сгустки или адсорбируются различными клеточными структурами. Обнаружить их можно с помощью реактивов, осаждающих алкалоиды, или специфическими для каждого алкалоида реакциями окрашивания. Параллельно проводят контрольные опыты на материале, из которого алкалоиды предварительно вымываются подкисленным спиртом: срезы помещают на 5-7 дней в бюкс с 5% раствором винной кислоты в спирте; через 2-3 дня растворитель заменяют на свежий. Реакции осаждения алкалоидов. Для этой реакции можно использовать любой реактив, осаждающий алкалоиды в тканях растения. Наилучшие результаты дает раствор пикриновой кислоты, образующий со многими алкалоидами кристаллические осадки, реактив Драгендорфа, реактив Майера, раствор рейнеката аммония (пропись реактивов см. ГФ XIV) и др. Реакции осаждения алкалоидов проводят на предметном стекле, помещая в каплю реактива срез свежего растительного материала. Результат реакции наблюдают под микроскопом, сравнивая с контрольным препаратом. Другой вариант реакции: кусочки растительного материала помещают в один из указанных реактивов на 1-2 недели, после чего готовят срезы и заключают в глицерин. Осадки алкалоидов наблюдаются в виде скоплений мелких иголочек (пикраты) или мелкозернистых включений серого или желтовато-серого цвета. Подтверждение алкалоидной природы осадка дает отрицательный результат с этим же реактивом в контрольном опыте. С помощью осадочных реакций можно установить локализацию алкалоидов в тканях растения. В сухом растительном материале присутствие алкалоидов обнаруживается следующей реакцией. Соскоб исследуемого сырья (или порошок) помещают на предметное стекло, прибавляют 2-3 капли 5% уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и слегка подогревают (не доводить до кипения). Через 2-3 мин рядом кладут второе покровное стекло так, чтобы под него засосалась жидкость. После этого снимают первое покровное стекло вместе с порошком и наносят каплю реактива на алкалоиды (реактивы Вагнера, Майера, Драгендорфа), который проникает под покровное стекло и вызывает осаждение алкалоидов. На границе соприкосновения жидкостей образуется помутнение (см. в лупу на черном фоне). Открытие отдельных алкалоидов в растительном материале ведут с помощью специфических реакций на данный алкалоид. Реакции на сапонины. Гистохимическое открытие сапонинов не всегда достоверно, так как нет специфических реакций, которые можно было бы проводить в тканях растений. Наиболее убедительны результаты реакции, в которой используют гемолитические свойства сапонинов. Определение сапонинов по реакции гемолиза. Срез свежего растительного материала помещают на кусочек кровяного желатина, накрывают покровным стеклом и оставляют на 30-40 мин. При наличии в растении сапонинов вокруг среза образуется прозрачная красная зона – «гемолитический дворик». Кровяной желатин готовят добавлением к 6-8% раствору желатина на изотоническом растворе хлорида натрия взвеси эритроцитов (2-3 капли взвеси эритроцитов или дефибринированной крови на 2-3 мл раствора желатина). После застывания желатина в виде тонкого слоя (2-3 мм) его режут на кусочки. Реакция с хлоридом сурьмы. Срез свежего растения обрабатывают 2-3 мин парами аммиака и помещают в ацетон для фиксации. Через минуту срез вынимают и после испарения ацетона наносят на него каплю насыщенного раствора хлорида сурьмы в хлороформе. Слегка подогревают, заключают в вазелиновое масло, накрывают покровным стеклом и изучают под микроскопом. Сапонины под влиянием хлорида сурьмы приобретают окрашивание от пурпурно-красного до красно-фиолетового и заметны в виде сгустков и комочков в постенном слое протоплазмы. Реакции на антраценпроизводные. Реакция со щелочью. Срез помещают на предметное стекло в небольшую каплю 5% раствора едкого натра или аммиака, прибавляют каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и наблюдают под микроскопом красное или фиолетово-красное окрашивание тканей, в которых локализуются антраценпроизводные. Постепенно окраска распространяется по всему срезу (диффузия). Следует помнить, что яркое окрашивание дают только производные антрахинона. Производные антрона и антранола дают со щелочью желтое окрашивание. В этом случае окраску можно усилить предварительной обработкой среза перекисью водорода. Микросублимация антраценпроизводных. В измельченном растительном материале (соскоб, порошок) антраценпроизводные можно обнаружить после микросублимации. На предметное стекло кладут стеклянное кольцо 1-1,5 см высотой и 2 см в диаметре, в него помещают небольшое количество порошка (0,1-0,2 г), накрывают другим предметным стеклом и нагревают до 210° С. Антраценпроизводные возгоняются и конденсируются на холодном верхнем стекле. Под микроскопом в сублимате видны тонкие желтые иголочки, которые в ультрафиолетовом свете (люминесцентный микроскоп) имеют яркое желтое или оранжево-красное свечение. В этанольном растворе едкого кали сублимат растворяется с красным окрашиванием (марена при этом дает фиолетовое окрашивание – ализарин). Реакции на дубильные вещества. В живой клетке дубильные вещества находятся в виде раствора в клеточном соке, частично адсорбированы клеточными коллоидами. В лекарственном растительном сырье дубильные вещества образуют бесформенные комки желтовато-коричневого цвета. Окраска обусловлена флобафенами или продуктами уплотнения дубильных веществ. Реакция с солями окисного железа. Используют хлорид железа или железоаммониевые квасцы в виде 1% растворов в воде. Ткани, содержащие дубильные вещества, окрашиваются от солей окисного железа в черно-синий или черно-зеленый цвет. Оттенки окраски мало заметны, так как присутствующие в клетке органические кислоты могут изменить синюю окраску в зеленую. Реакцию проводят на предметном стекле. Срез помещают в каплю реактива, накрывают покровным стеклом и наблюдают окрашивание препарата под микроскопом. Окраска быстро распространяется по всему срезу (диффузия). Реакция с раствором бихромата калия. Реактив используют для установления локализации дубильных веществ в тканях растения. Применяют 5-10% раствор бихромата калия в воде. Кусочки материала помещают в реактив на несколько дней, затем готовят срезы. В клетках, содержащих дубильные вещества, выпадает серо- и красновато-коричневый зернистый осадок. Красновато-коричневый цвет появляется иногда лишь спустя некоторое время. Образованию осадка препятствуют органические кислоты – щавелевая, лимонная, яблочная, винная; в их присутствии получается лишь гомогенная желто-коричневая окраска. Реакция с раствором молибденово-кислого аммония (реакция Гардинера или Висселинга). Состав реактива: 25% раствор хлорида аммония-1 часть, 50% раствор молибдата аммония-1 часть; вода-1 часть. Под действием этого реактива в клетках, содержащих дубильные вещества, выпадает желтый осадок; с танином реактив дает красный осадок. Проникновение реактива в ткани ускоряется при подщелачивании раствора (добавлением аммиака). Реакция довольно чувствительная; ее недостатком является легкая растворимость осадка в разбавленных кислотах и в воде, а также слабая устойчивость реактива при хранении. Реакцию проводят на предметном стекле; ее результаты наблюдают под микроскопом. 1.5.3. Сублимация (микросублимация). Термин «сублимаци» (возгонка, от лат. Sublimo – возношу) – означает переход вещества из твердого состояния непосредственно (без плавления) в газообразное. Сублимация подчиняется общим законам испарения. Обратный процесс – конденсация веществава из газообразного состояния, минуя жидкое, непосредственно в твердое состояние называется десублимацией. Сублимация (микросублимация) – выделение из растительного материала веществ, которые легко возгоняются при нагревании. После этого проводят качественную реакцию (или микрохимическую) с сублиматом. Сублимацию проводят в сухой пробирке. Помещая в пробирку измельченный растительный материал, необходимо предварительно защитить стенки пробирки от растительной пыли, для чего внутрь опускают полоску бумаги, свернутую трубочкой. Насыпав исследуемый порошок в пробирку, вынимают из нее бумагу и проводят сублимацию, нагревая над пламенем горелки только нижнюю часть пробирки. Пробирку при этом держат наклонно, чтобы пары конденсировались на ее холодных стенках. После охлаждения пробирки, держа ее горизонтально, на зону сублимата помещают каплю реактива и слегка покачивают пробирку, чтобы смыть реактивом сублимат. Наблюдают соответствующее окрашивание. При проведении микросублимации измельченный в порошок растительный материал нагревают на предметном столике. Для этого на предметное стекло предварительно кладут стеклянное кольцо высотой 1-1,5 см и диаметром 2 см; в него помещают небольшое количество растительного материала (0,1-0,2 г), накрывают другим предметным стеклом и нагревают. В этом случае сублимат конденсируется на верхнем предметном стекле. Полученный сублимат исследуют под микроскопом, после чего можно провести микрохимическую реакцию с соответствующим реактивом. Примеры качественных микро- и гистохимические реакции, используемых при идентификации лекарственного растительного сырья
ИНСТРУМЕННТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА. Для проведения качественной и количественной оценки химического состава лекарственного растительного сырья в фармакогнозии и фитохимии используются современные инструментальные методы анализа. Одним из наиболее простых и эффективных методов разделения и анализа биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье является хроматография. Она обладает высокой избирательностью и чувствительностью, позволяет провести идентификацию компонентного состава и определить содержание биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье и препаратах. В фитохимическом анализе чаще всего используют тонкослойную, газожидкостную, ионообменную и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Тонкослойная хроматография (ТСХ). При качественном анализе используют бумажную или тонкослойную хроматографию; по направлению – одномерную, двумерную, восходящую и нисходящую. Из лекарственного растительного сырья получают спиртовое извлечение, которое затем подвергают хроматографическому разделению. На хроматограммах вещества проявляются в видимом и УФ-свете до и после проявления специальными реактивами. Идентификацию проводят по характерной флуоресценции или окраске пятен, значению Rf и путем сравнения со стандартными образцами. ТСХ применяется, в основном, для изучения качественного состава биологически активных веществ растений. Основана на различии в скорости перемещения компонентов смеси в плоском тонком слое сорбента при их движении в потоке подвижной фазы (элюента). В качестве сорбентов используют силикагель, Аl2О3, целлюлозу, крахмал, полиамид. Элюентами служат обычно смеси органических растворителей, водных растворов кислот, солей, а также газов. В зависимости от состава подвижной и неподвижной фаз в разделении веществ играют роль процессы адсорбции, экстракции, ионного обмена, комплексообразования или нескольких механизмов одновременно. Например, в фармакопейной статье на цветки боярышника: спиртовое извлечение наносят на стартовую линию пластинки «Silufol», рядом наносят стандартный образец гиперозида. Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру с системой растворителей хлороформ-метанол (8:2) и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей дойдет до конца пластинки,ее вынимают из камеры, высушивают и просматривают в УФ-свете. На уровне пятна гиперозида появляется пятно темно-коричневого цвета. Затем пластинку обрабатывают 5% спиртовым раствором AlCl3 и нагревают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С. При этом пятно приобретает ярко-желтую окраску в видимом и яркую желто-зеленую флюоресценцию в УФ-свете (гиперозид). Rf их совпадают. В настоящее время разработано большое количество методик ТСХ-анализа флавоноидов, органических кислот, сахаров, аминокислот, тритерпеновых производных и других природных соединений. На некоторые виды лекарственного растительного сырья тонкослойная хроматография включена в фармакопейные статьи (раздел ГФ РФ XIV «качественные реакции»). Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Одним из самых перспективных на сегодняшний день хроматографических методов является, бесспорно, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Поскольку метод ВЭЖХ совмещает в себе этап разделения, и этап собственно регистрации сигнала веществ, он является важнейшим для 39 многокомпонентного определения соединений, часто различной природы, при совместном присутствии в сложных матрицах. Сегодня высокоэффективная жидкостная хроматография по темпам развития вышла на первое место среди инструментальных методов анализа. Методик качественного и количественного ВЭЖХ-анализа биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье великое множество. Так, например, разработан метод определения каротиноидов и хлорогеновых кислот в плодах рябины с помощью ВЭЖХ. Также существуют методики количественного ВЭЖХ определения аскорбиновой кислоты, органических кислот, фенолкарбоновых кислот и сахаров в плодах шиповника, черники качественного ВЭЖХ-анализа антоцианов в плодах малины, черники, определения индивидуальных флавоноидов – гиперозида, рутина, витексина-2-рамнозида в плодах боярышникаи рутина, кверцетина, фенолкарбоновых кислот в плодах шиповника. Метод спектрофотометрии. Широкое применение в анализе лекарственного растительного сырья получил метод спектрофотометрии. Разработаны методики спектрофотометрического количественного определения дубильных веществ, флавоноидов, антоцианов, сахаров, аминокислот. Принцип спектрофотометрического метода определения основан на способности биологически активных веществ или их окрашенных продуктов реакции поглощать монохроматический свет при определенной длине волны. Метод является достаточно точным, воспроизводимым, относительная ошибка единичного определения не превышает 2%. Собственно количественный анализ предопределяет очистка с целью выделения нужной фракции биологически активных веществ, проводимая хроматографическими методами или получением окрашенного комплекса флавоноидов с AlCl3, который сдвигает максимум поглощения в более длинноволновую область (409-430 нм), где сопутствующие вещества не мешают определению. Количественное содержание суммы антоцианов в плодах черноплодной рябины проводят методом спектрофотометрии в пересчете на цианидин-3-Оглюкозид, основываясь на оптических свойствах антоцианов и их способности поглощать в УФ- и видимой области спектра и давать пик при длине волны 534 нм. Разработаны и адаптированы спектрофотометрические методики определения содержания суммы антоцианов в плодах черники относительно цианидин-3,5- дигликозида (510-520 нм). Известные методики спектрофотометрического определения дубильных веществ основаны на измерении оптической плотности окрашенных продуктов взаимодействия катехинов с железотартратным реактивом в присутствии 0,1М фосфатного буфера с рН 8,2 или окрашенных комплексов таннинов с молибдатовольфрамовым реактивом в присутствии натрия карбоната (реактив Фолина-Дениса). Титриметрические методы анализа по точности и селективности существенно уступают современным инструментальным методам. В то же время они намного проще и дешевле последних. Титриметрия не требует дорогостоящего оборудования и легко воспроизводится в лабораторных условиях. По этим причинам данный метод не потерял актуальности в анализе биологически активных вещества лекарственных растений и в наше время. Методом пермангонатометрического титрования проводят количественное определение дубильных веществ. Этот метод фармакопейный, он описан в общей статье ГФ ХI и ГФ ХIV «Определение дубильных веществ в лекарственном растительном сырье». Методика основана на окислительно-восстановительных свойствах определяемых соединений: первую очередь будут окисляться производные пирокатехина и пирогаллола (соединения, входящие в состав дубильных веществ). Титрование ведется перманганатом калия в присутствии индикатора – индигосульфокислоты. Параллельно ставят контрольный опыт. Кроме дубильных веществ, титрованием определяют количественное содержание свободных органических кислот и аскорбиновой кислоты. Содержание аскорбиновой кислоты определяют согласно методике, приведенной в ГФ ХIV «Плоды шиповника». Титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия. Также возможно проводить количественное определение аскорбиновой кислоты следующими методами: йодатометрия (титрант – йодат калия, индикатор – крахмал), йодометрия (титрант – раствор йода, индикатор – крахмал, методика включена в Европейскую фармакопею, 2008), йодхлорметрия (титрант – раствор хлорида йода, индикатор – крахмал). В последнее время все чаще для определения содержания биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье стали применяться электрохимические методы – кулонометрическое титрования и потенциометрию. Описана методика потенциометрического титрования дубильных веществ. В отличии от классической перманганатометрии, указанная методика предполагает рН-метрическую фиксацию конечной точки титрования, что исключает необъективность результатов за счет человеческого фактора. Также известна возможность потенциометрического определения суммы свободных органических кислот в ЛРС. В качестве титранта используется 0,1М раствор едкого натра. Титрование необходимо проводить с помощью микробюретки для точной регистрации рН раствора и определения точки эквивалентности. Методика валидирована и разработана для количественной оценки органических кислот в плодах шиповника и рябины обыкновенной. Перспективность кулонометрического метода определения обусловлена простотой аппаратурного оформления, возможностью обеспечения 100% выхода по току, большим числом электрогенерируемых титрантов и, как следствие широким кругом определяемых веществ. Основными контролируемыми параметрами в данном случае являются время и сила тока. Имеющиеся в настоящее время приборы и устройства позволяют автоматически измерять эти параметры с очень высокой точностью. На одной и той же установке можно проводить как кислотно-основное, так и окислительно-восстановительное титрование, меняя лишь состав фонового электролита в кулонометрической ячейке. Во всех вариантах гальваностатической кулонометрии конечную точку титрования можно устанавливать различными методами: визуально, биамперометрически, бипотенциометрически, рН-метрически‚ фотометрически. Из данных литературы известны методики кулонометрического определения содержания свободных органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина, дубильных веществ. Люминесцентный анализ. При исследовании лекарственных растений и лекарственного растительного сырья большие возможности открывает люминесцентный анализ, т.к. многие вещества, вырабатываемые растительным организмом, обладают люминесценцией. Для получения излучения, возбуждающего люминесценцию, пользуются главным образом газоразрядными лампами – ртутными, водородными, криптоновыми, ксеноновыми. Наилучшим источником излучения считается такой, у которого наибольшее количество энергии приходится на долю излучения, необходимого для возбуждения люминесценции. Источники излучения обычно употребляются совместно со светофильтрами, которые из общего излучения выделяют нужный спектральный участок; остальная часть спектра отрезается светофильтрами, как мешающая. Большинство методов, использующих люминесцентные свойства объекта, объединяют под общим названием «макролюминесцентный анализ», исходя из того, что наблюдать люминесценцию можно невооруженным глазом. К макролюминесцентному анализу следует отнести обнаружение зон или пятен на хроматограммах по их свечению в УФ-свете. При рассматривании ЛРС в УФ-свете можно наблюдать характерную люминесценцию в зависимости от его химического состава Люминесцентная микроскопия дает возможность одновременного изучения анатомической структуры объекта и характера его люминесценции, сохраняя основное достоинство люминесцентного анализа – высокую чувствительность и специфичность. Метод люминесцентной микроскопии применяется для определения подлинности ЛРС.Ценным преимуществом люминесцентной микроскопии является возможность его применения для изучения сухого растительного материала, из которого готовят толстые срезы или препараты порошка. Люминесцентная микроскопия листьев.Готовят препараты из порошка листьев, которые рассматривают без включающей жидкости. Наиболее яркая люминесценция характерна для одревесневших элементов - сосудов жилки, механических волокон, а также для кутикулы и кутинизированных оболочек различных эпидермальных образований (волосков, железок и др.). В эпидермальных клетках часто содержатся флавоноиды, обуславливающие коричневую, желтую или зеленовато-желтую люминесценцию. Клетки мезофила содержат различные включения – желтые, голубые, коричневые, зеленовато-желтые – в зависимости от химического состава. Хлорофилл в высушенном растительном материале не люминесцирует. Кристаллы оксалата кальция также не обладают люминесценцией. 1 Жавелевая вода (жавель, от франц. «Javel» – местечко около Парижа, где впервые стали изготовлять эту воду в 1792 году) – раствор солей калия хлорноватистой и соляной кислот (KOCl + KCl). Применяется для беления, ранее применялась также для дезинфекции. Жавелевая вода впервые получена французским химиком Бертолле, изучавшим недавно тогда открытый элементарный хлор. 2 Канадский бальзам (англ. Canada balsam) — смола (терпентин), получаемая из пихты бальзамической, или канадской (Abies balsamea MILL.)], растущей в Канаде. Он добывается из смоляных вместилищ коры, выпячивающихся в виде желваков на наружной поверхности её, и собирается в относительно ничтожном количестве, всего до 20-30 тонн в год. Получение его весьма трудоёмко, так как для извлечения этой смолы каждый бальзамный пузырь в коре прокалывается заостренным носиком железной кружки, в которую бальзам тут же медленно стекает по носику. С одного дерева можно получить за один раз обычно не более 250 г бальзама и притом не чаще, чем через каждые 3 года. Сбор бальзама продолжается с середины июня до половины августа. Канадский бальзам бесцветен или слегка желтоватого цвета, совершенно прозрачен, густоты мёда, приятного запаха, жгучего, горьковатого вкуса. С крепким спиртом не даёт прозрачного раствора; легко растворяется в хлороформе, ксилоле, бензоле, сероуглероде и эфире, но не в бензине. Содержит до 25 % эфирного масла (левый пинен) и две смолы, из которых одна растворима в спирте, другая – нет; кислотное число 84-87. Благодаря своей большой прозрачности, бесцветности, большому показателю преломления (1,55, близкому к стеклу) и тому, что он никогда не мутится, не закристаллизовывается, употребляется для склейки оптических стекол, погружения и заклейки микроскопических препаратов, петрографических шлифов, при изготовлении лака и гистологических препаратов, подлежащих длительному хранению, а также в иммерсионных объективах микроскопов. |