ГЛАВА-1. Методы фармакогностического анализа. Основные понятия, термины и определения
 Скачать 1.03 Mb.
|
|
Временные препараты готовят, соблюдая следующую последовательность операций: 1. Моют и тщательно вытирают предметное и покровное стекла. Чтобы не сломать очень хрупкое покровное стекло его ополаскивают в воде, помещают в складку полотенца между большим и указательным пальцами правой руки и осторожно вытирают круговыми движениями пальцев. 2. Наносят на предметное стекло включающей каплю жидкости - воду, глицерин, раствор реактива или красителя. 3. Делают несколько срезов изучаемого органа при помощи бритвы. 4. Выбрав самый тонкий срез, кладут его на предметное стекло в каплю жидкости. 5. Закрывают срез покровным стеклом так, чтобы под него не попал воздух. Для этого покровное стекло берут двумя пальцами за грани, подводят нижнюю грань к краю капли жидкости и плавно опускают. 6. Если жидкости много и она вытекает из-под покровного стекла, избыток ее удаляют кусочком фильтровальной бумаги. Если под покровным стеклом остались места, заполненные воздухом, добавляют жидкость, поместив каплю ее рядом с краем покровного стекла. Приготовление крупных размягченных объектов. Коры, корневища, толстые корни, крупные плоды, семена при изготовлении среза держат в руке. Подравнивают скальпелем поверхность и делают срез бритвой или лезвием. Приготовление срезов в бузине. Цилиндрические палочки из сердцевины бузины разрезают на куски длиной 1-1,5 см, кладут на стол и разрезают скальпелем пополам по длине. Между половинками кладут тонкий корень, лист. Бузину с объектом плотно зажимают пальцами и делают срезы, ориентируя лезвие вдоль щели, а не поперек; начинают срез не с края, а с поверхности бузины, срезают объект вместе с бузиной, которую затем отбрасывают. Приготовление срезов в пробке. Берут небольшие (около 1 см) «бархатные» пробки, лишенные темных ходов. Перед употреблением для размягчения пробки кипятят в воде примерно 15 мин, затем надрезают на ¾ скальпелем и, поместив в разрезе объект, делают бритвой срез. Приготовление срезов в парафине. Из куска парафина скальпелем вырезают прямоугольник (блок) размером 1×2 см, который удобно держать в руке. В верхнюю часть парафина вставляют нагретый на пламени горелки кончик препаровальной иглы; в расплавленную ямку быстро опускают размягченное семя или плод. Через несколько минут парафин застывает. Выравнивают поверхность парафина и отрезают верхушку объекта. Делают срезы вместе с парафином, который затем отбрасывают. Техника приготовления постоянных препаратов. Временные препараты, о которых шла речь выше, не могут сохраняться: при высыхании воды. Ткани и клетки растительного объекта настолько изменяются, что они становятся негодными для дальнейшего исследования. Однако часто препараты необходимо сохранять в течение долгого времени, особенно при научной работе, почему возникла необходимость в приготовлении постоянных препаратов. Живую часть растения, из которой хотят приготовить постоянный препарат прежде всего фиксируют. Сущность фиксации заключается в быстром умерщвлении клеток и тканей, при котором сохраняется их прижизненная структура, а все коллоиды переводятся в нерастворимое состояние и приобретают способность воспринимать красители. Фиксацию осуществляют путем погружения материала в различные ядовитые жидкости или крепкий спирт. Материал, заготовляемый для гистохимических исследований, обычно фиксируют этиловым спиртом 96% концентрации и оставляют в нем на хранение. Однако для фиксации сильно одревесневших органов растений лучше взять 80%-ый его раствор и через несколько дней добавить в банку с материалом глицерин (до 1/3 объема спирта). Материал для эмбриологических исследований (бутоны цветков, пылинки), а иногда и для гистологических лучше фиксировать специальными жидкостями (например, уксусным алкоголем или фиксатором Чемберлена). По истечении срока фиксации такой материал следует промыть тремя сменами 80%-го раствора этилового спирта и хранить его в растворе такой же концентрации. Если срезы готовят из живого материала, то для лучшего действия красителей их необходимо зафиксировать спиртом. Органы растений и небольшие растения, которые предполагают использовать для демонстрации, фиксируют 4%-м раствором формалина и хранят в 8%-м его растворе или в смеси 25%-го раствора формалина со спиртом любой концентрации. Для простейших препаратов достаточно тонкие срезы делают при помощи тонкой бритвы. Для получения срезов определенной толщины используют специальные приборы – микротомы. Наиболее тонкие срезы переносят в чистое часовое стекло, в которое наливают при помощи пипетки небольшое количество водного раствора красителя. Через несколько минут (это зависит от концентрации красителя) краситель удаляют и срезы несколько раз промывают водой или 50%-м раствором этилового спирта до полного удаления лишней краски. Желательно контролировать это под микроскопом. Окрашивают срезы одним красителем или применяют комбинированное окрашивание двумя или даже тремя красителями. Например, двойную окраску гематоксилином и сафранином осуществляют следующим образом. Срезы помещают в раствор гематоксилина Делафильда. Через несколько минут (время определяют опытным путем) среза промывают водой, а затем 50%-раствором этилового спирта. Далее переносят их в 1%-ый спиртовой раствор сафранина на 10-20 минут. Окраску сафранином проводят при нагревании. Избыток сафранина удаляют, промывая срезы в 50%-м растворе этилового спирта. Неодревесневшие стенки клеток окрасятся в сине-фиолетовый цвет, а одревесневшие в красный. Для лучшего окрашивания срезов надо сначала перенести их на несколько минут в разбавленную жавелевую1 воду, промыть обычной водой, а затем уже помещать в раствор красителя. Окрашенные и промытые срезы переносят по одному на предметные стекла в заранее подготовленные капли расплавленного глицерино-желатина. В процессе работы следует подогревать предметные стекла с каплями глицерино-желатина под настольной электрической лампой или на чашке с горячей водой, закрытой большим стеклом. Другую каплю глицерино-желатина наносят на чистое покровное стекло и аккуратно накрывают им срез. При этом под покровным стеклом не должно остаться пузырьков воздуха. Избыток глицерино-желатина, выступивший из под покровного стекла, удаляют кусочком фильтровальной бумаги. После застывания среды препарат готов. Рекомендуют подчистить края покровного стекла и окантовать лаком, олифой или нитроэмалевой краской, что удлинит срок годности препарата. Перед заключением окрашенных срезов в канадский бальзам2 их обезвоживают и пропитывают растворителем бальзама – ксилолом. Все необходимые операции со срезами осуществляют в одном или нескольких часовых стелах, применяя пипетки и деревянные палочки. В часовом стекле с окрашенными срезами сначала заменяют воду на 96%-ый раствор этилового спирта. Для лучшего обезвоживания спиртовой раствор меняют два-три раза, затем заменяют его на абсолютный спирт – на карбоксилол, а последний на чистый ксилол. Смену ксилола проводят два-три раза. Из ксилола при помощи деревянной лопаточки один или несколько срезов переносят на чистое предметное стекло, наносят на них каплю канадского бальзама и накрывают чистым покровным стеклом. Рекомендуют и на покровное стекло нанести небольшую каплю бальзама, что будет препятствовать появлению пузырьков воздуха под ним. Избыток канадского бальзама, который вытек из под покровного стекла, удаляют при помощи фильтровальной бумаги. После высыхания бальзама препарат готов для исследований. Просветление и окраска тканей. Чтобы ткань хорошо просматривалась под микроскопом, её необходимо поместить во включающую жидкость. Наиболее часто образцы заливаются дистиллированной водой, раствором глицерина различной концентрации, маслом, раствором хлоралгидрата, щёлочи и т.д. Вода, глицерин и масло относятся к так называемым индифферентным жидкостям, ткань в них не претерпевает изменения. В растворах хлоралгидрата и щёлочей (KOH, NaOH) ткань становится более прозрачной, поэтому их называют просветляющими. Для усиления эффекта просветления образцы ткани кипятятся в растворе щёлочи несколько минут. Для выявления специфических гистологических элементов ткань подвергают окраске микрохимическими реактивами. Для просветления препаратов используют различные жидкости в зависимости от природы объекта, плотности тканей, структуры клеток. Они обеспечивают видимость объекта и называются просветляющими. Вода как индифферентная жидкость часто используется для включения препаратов, так как в воде не меняется форма, величина клеток, структура и окраска тканей. Крахмальные зерна хорошо видны, алейроновые зерна распадаются, жирное масло сливается в крупные капли, слизь растворяется. Ткани остаются темными и неясно различимыми. Глицерин используется разведенный водой 1:1 (неразведенный глицерин отнимает от тканей воду, сморщивает и деформирует их). Только для растворимых в воде включений (например, слизь) пользуются неразведенным глицерином или смешивают его со спиртом в равных частях. Глицерин относится к индифферентным жидкостям, но перед водой он имеет то преимущество, что ткани в нем долго не высыхают. Кроме того, глицерин обладает слабыми просветляющими свойствами: при продолжительном воздействии глицерина ткани становятся более прозрачными. Хлоралгидрат применяется в виде раствора; 20 частей хлоралгидрата растворяют при нагревании в 5 частях воды и прибавляют 5 частей глицерина, чтобы хлоралгидрат не выкристаллизовывался. Хлоралгидрат является одним из лучших просветляющих средств. Он отличается способностью быстро проникать в ткани, при этом воздух вытесняется, крахмальные зерна разбухают и расплываются; жирные и эфирные масла сначала сливаются в более крупные капли, затем постепенно растворяются; белковые вещества, хлорофилл и другие включения разрушаются; темно окрашенные ткани светлеют; кристаллы остаются без изменения. Препарат, помещенный в раствор хлоралгидрата, обычно подогревают, иногда дают вскипеть; это усиливает и ускоряет просветляющее действие реактива. Большим недостатком хлоралгидрата является его деформирующее действие на ткани вследствие сильного разбухания оболочек. Щелочь применяется в виде водных растворов. Концентрация и продолжительность действия определяются свойствами объекта. Обычно используют 3-5% раствор, редко – 10-15%. Раствор едкой щелочи является сильным просветляющим средством. Крахмальные зерна разбухают и превращаются в клейстер; при продолжительном действии щелочи или при нагревании препарата в этом реактиве жиры омыляются, растворяются белковые вещества, просветляются темно окрашенные ткани. В растворе щелочи оболочки клеток сильно набухают и легко разрываются при надавливании. Вследствие сильного разбухания клеток теряется представление об их истинных размерах; впрочем это не всегда бывает важно. Из щелочей используют едкое кали, едкий натр, реже раствор аммиака; последний имеет то преимущество, что не вызывает сильного разбухания оболочек клетки. Перекись водорода используют в виде 3% раствора. Более высокие концентрации более активны, но в этом случае перекись водорода будет действовать не только как просветляющий, ни и как мацерирующий (размягчающий) реактив. 1.3.3. Техника микроскопического исследования лекарственного сырья Препараты цельного и резаного сырья. Листья, травы, цветки. Препараты для микроскопического анализа готовят из сырья, предварительно просветленного в растворе щелочи. Для этого кусочки листовой пластинки (с краем листа, жилкой), венчика и чашечки, иногда стеблей (в безлистном сырье) кипятят в пробирке с 5% водным раствором КОН 1-2 мин в зависимости от толщины листа. Затем содержимое пробирки выливают в чашку, жидкость сливают, сырье промывают и оставляют в воде. Кусочки сырья берут лопаточкой или препаровальной иглой, если листья тонкие и собираются в складочки. Предметное стекло в воде подводят под кусочек листа и вынимают его иглой на стекло; кусочек должен лежать гладко. Если лист надо рассматривать с двух сторон, кусочек листовой пластинки режут на две части скальпелем на предметном стекле, одну часть осторожно переворачивают и помещают обе части рядом. Плотные листья при рассмотрении раздавливают лопаточкой или скальпелем; иногда готовят срезы в пробке, бузине. Готовые препараты и срезы просматривают в растворе хлоралгидрата. Иногда при анализе листьев и трав на эфирное масло, млечники, вместилища со смолой, кутикулу используют микрохимические реакции с раствором судана III. Если требуется приготовить срез листа, выбирают кусочек, содержащий главную жилку; мелкие листья берут целиком. Препарат готовят таким образом, чтобы срез прошел поперек главной жилки, и попала часть мезофилла с более мелкими жилками. Обращают внимание на форму главной жилки, число, форму и расположение проводящих пучков в жилке. В пучках отмечают расположение ксилемы и флоэмы, а также наличие кристаллоносной обкладки, структуру мезофилла (палисадная ткань расположена с одной или с двух сторон, имеется губчатая ткань; в изолатеральном листе палисадная ткань располагается снизу и сверху) и других включений. Резаные листья, травы, цветки исследуют так же, как цельное сырье. Плоды и семена. Для анализа плодов и семян делают поперечные срезы, иногда продольные; рассматривают элементы кожуры с поверхности. Обычно готовят поперечные срезы из предварительно обработанного сырья (увлажненное в камере или размягченное в водяных парах). Мелкие объекты режут в пробке, сердцевине бузины или парафине. Препараты кожуры готовят из плодов и семян после длительного кипячения в 5% растворе КОН (мацерация) и последующего раздавливания и разделения тканей препаровальной иглой. Резаные плоды и семена обычно не используют; в чаи и сборы их добавляют цельными. Просматривают препараты в растворе хлоралгидрата и проводят микроскопические реакции на жирное и эфирное масла, слизь, механические элементы. Коры. Готовят поперечные и продольные срезы коры после предварительного размягчения. Резаные коры. Препараты готовят путем кипячения кусочков в 5% растворе КОН в течение 3-5 мин, промывания в воде, раздавливания на предметном стекле, затем рассматривают препарат в растворе хлоралгидрата. Для проведения микрохимических реакций на одревесневшие элементы, крахмал (иногда) и на действующие вещества (дубильные, антраценопроизводные и некоторые другие) используют соскоб коры или 10% отвар после охлаждения. Подземные органы (корни, корневища, клубни, луковицы). Подготовленное сырье (размоченные и размягченные объекты) исследуют на поперечных и продольных срезах. Толстые срезы рассматривают в лупу (10×). Обращают внимание на общее строение, а на тонких срезах выявляют диагностические признаки. Резаное сырье исследуют после кипячения кусочков в 5% растворе КОН, промывания в воде и раздавливания на предметном стекле. Препарат рассматривают в растворе хлоралгидрата. С помощью микрохимических реакций устанавливают наличие запасных питательных веществ (крахмал, инулин, жирное масло), механических элементов и некоторых других действующих веществ. Для этого берут соскоб в виде грубого порошка или 10% отвар после охлаждения. Анализ растительных порошков. Для приготовления препаратов на предметное стекло помещают 1-2 капли включающей жидкости, смачивают в ней конец препаровальной иглы или скальпеля и берут исследуемый порошок; переносят его на предметное стекло в жидкость и осторожно, чтобы не попал воздух, накрывают покровным стеклом. Если при этом жидкости под стеклом оказалось мало, добавляют ее пипеткой рядом с покровным стеклом (она быстро затягивается под стекло). Если жидкости окажется много, ее удаляют, не снимая стекла, полоской фильтровальной бумаги. Необходимо соблюдать следующее правило: на предметное стекло нужно вначале вносить включающую жидкость, а затем порошок, чтобы не загрязнить реактивы. Препараты готовят в растворе хлоралгидрата или в растворах КОН и NaOH, медленно нагревают до полного просветления, выявляют все диагностические признаки. При необходимости проводят микрохимические реакции. Крахмал рассматривают в воде, глицерине (без нагревания), проводят микрохимические реакции с раствором Люголя. Ликоподий рассматривают в растворе хлоралгидрата после нагревания. Микрохимическую реакцию на жирное масло проводят с раствором судана III (нагревание). Порошкообразное лекарственное сырье может использоваться в виде таблеток, брикетов и сложных порошков (астматол). Их анализ проводят по «Определителю порошкованного сырья». 1.3.4. Анатомо-диагностические признаки лекарственного сырья различных морфологических групп Растительное лекарственное сырье разных морфологических групп различается по диагностическим признакам. Листья. Основными диагностическими признаками являются характер строения эпидермы, типы волосков, железок, устьиц, форма кристаллических включений, форма вместилищ, млечников, секреторных каналов и др. Эпидерма. При исследовании лекарственного сырья отмечают размеры и форму клеток. Клетки эпидермы бывают с прямыми или извилистыми боковыми стенками, иногда с четковидным утолщением. Имеет значение и характер кутикулы (пленка, покрывающая эпидерму, состоящая из кутина): например, эпидерма листьев толокнянки, эвкалипта имеет толстый слой кутикулы, эпидерма листа красавки, горицвета – складчатую кутикулу. На эпидерме листа есть устьица; форма их, расположение (с одной или с двух сторон листа), характер окружения их клетками эпидермы являются постоянными и характерными для каждого вида, для некоторых семейств. Например, у большинства растений семейства яснотковых устьица окружена двумя клетками эпидермы, которые расположены так, что их смежные стенки перпендикулярны к устьичной щели. У некоторых растений имеются водяные устьица, расположенные на верхушке и зубчиках листа. Устьице окружено тремя околоустьичными клетками, из которых одна заметно меньше двух других. В эпидерме листьев крапивы имеются клетки, содержащие цистолиты. Нередко эпидермальные клетки, окружающие волосок, образуют розетку (сенна, термопсис), которая является важным диагностическим признаком. Волоски. Их форма разнообразна (рис. 20). Встречаются волоски простые и головчатые. Простые волоски бывают одно- или многоклеточные, ветвистые, извилистые, звездчатые, многолучевые, пучковые, Т-образные, жгучие (у крапивы). Поверхность волоска может быть гладкой или бородавчатой, что зависит от характера слоя кутикулы, покрывающей волосок. Головчатые волоски отличаются размером, строением ножки и головки. У некоторых растений в головке волосков, под кутикулой, скапливается эфирное масло. Головка может быть шаровидной, овальной, одно-, двух- и многоклеточной, ножка – одно- и многоклеточной.
|
