лекция. Методы изолирования. Методы очистки и концентрирования вытяжек из биоматериала
 Скачать 90.88 Kb.
|
|
Методы изолирования. Методы очистки и концентрирования вытяжек из биоматериала Отбор и подготовка проб к анализу На стадии профподготовки образец очищается от загрязнений, которые не следует отбрасывать, так как они могут быть источником дополнительной информации. Пробоподготовка — это стадия риска потерять анализируемое вещество и объект. Поэтому нелишне помнить о необходимости строгих и логически оправданных действий, направленных на сохранение образцов, отобранных для анализа, для дальнейшего исследования. На стадии пробоотбора в анализе наркотических средств следует учитывать возможность уничтожения или фальсификации объекта; анализируемая проба может быть мала по массе, загрязнена и иметь химический состав, отличный от первоначального из-за воздействия окружающей среды при неправильном хранении. При пробах небиологического происхождения (растительное сырье, порошки, таблетки, экстракты и проч.) навеска для анализа отбирается произвольно, если только она не оговорена методикой и не ограничена малым объемом образца. Самая маленькая проба должна быть проанализирована самыми чувствительными методами. Критерием выбора метода в этом случае является предел обнаружения вещества. Образцы небиологического происхождения, как правило, изымаются в процессе оперативно-следственных мероприятий и являются вещественными доказательствами. Вид, количество биообразца, исследуемая аликвота в случае судебно-химического анализа, устанавливающего причины смерти, регламентируются соответствующими методическими письмами и рекомендациями. Наиболее распространенным биологическим объектом для обнаружения в нем наркотических средств является моча. Выбор этого биообъекта для анализа обусловлен несколькими причинами. Во-первых, моча представляет собой один из самых информативных объектов, так как большинство наркотических веществ и их метаболиты выводятся из организма с мочой. Во-вторых, по существующим юридическим нормам процесс отбора биопробы не должен причинять обследуемому физического неудобства. Среди других биообъектов при анализе наркотических средств могут быть взяты на анализ кровь, слюна, волосы и др. Процедура отбора пробы мочи должна обязательно проводиться под наблюдением персонала для предупреждения замены или порчи пробы. Необходимо учитывать, что проба может быть заменена образцом в заранее принесенном контейнере (грелка, склянка и т.д.), проба может быть испорчена добавлением воды, принесенного с собой уксуса, отбеливателей и других химических реагентов. Объем отбираемой мочи должен быть не менее 250 мл. В случае меньшего количества биообразца в итоговом протоколе этот факт должен быть обязательно отмечен. Сразу же после отбора пробы осуществляется предварительный осмотр ее с целью выяснения возможной фальсификации. В него входит: а) измерение температуры мочи; не позднее 5 минут после отбора температура отобранной биожидкости должна находиться в пределах 32,5 — 37,70С; в случае значительного отклонения измеренной температуры отбор пробы повторяется с более тщательным наблюдением за процессом отбора; б) измерение рН мочи, которое должно находиться в пределах 5 — 7; в) визуальный осмотр (цвет, мутность) должен подтвердить естественность отобранной пробы. Отобранная проба разливается в две ёмкости для хранения и транспортировки, для чего она маркируется, кодируется и опечатывается. Один из образцов анализируется на содержание наркотических средств, другой представляет собой образец для контрольного анализа. При анализе мочи, точно так же как и других биологических объектов, на содержание одурманивающих веществ необходимо обращать внимание на потенциальные фоновые соединения как эндогенного, так и экзогенного характера, присутствие которых в анализируемом образце неизбежно при любом способе пробоподготовки. Такими фоновыми эндогенными соединениями будут низкомолекулярные продукты метаболизма белков, аминокислот и сахаров (биогенные амины, мочевина, соли карбоновых кислот и др.), небольшие количества пептидов, сахаров, стероидов, пигмента уробилина и других веществ. Среди разнообразных экзогенных фоновых соединений будут присутствовать продукты биотрансформации веществ, поступивших с пищей, и различных лекарственных веществ, используемых наркоманами для усиления наркотического эффекта, снятия синдрома абстиненции, смягчения "выхода" из состояния наркотического опьянения (барбитураты, производные 1,4-бензодиазепина), а также метаболиты других химических веществ, попавших в организм (красители, антиоксиданты, продукты табакокурения и т.д.). Преданалитическая обработка мочи может состоять из различных операций: прямое концентрирование, экстракция растворителем, лиофилизация, хроматографическое разделение или сорбция на твердом сорбенте или комбинация различных операций (концентрирование— экстракция, лиофилизация — экстракция и др.). Прямое концентрирование достигается упариванием некоторого количества мочи до небольшого объема на водяной бане либо роторном испарителе или лиофилизацией. Приемы концентрирования и очистки биообразца с использованием сорбции изложены в методических указаниях "Химико-токсикологический анализ наркотических и других одурманивающих веществ" (М.: МЗ СССР, 1987). Жидкость-жидкостная экстракция как метод изолирования анализируемых соединений из мочи остается на сегодняшний день самым распространенным приемом выделения наркотических средств из биообъектов. В основе ее лежит распределение вещества между двумя несмешивающимися жидкими фазами. Количественно такое распределение можно охарактеризовать величинами коэффициента распределения (Кр) или логарифма отношения коэффициентов распределения (log Р) вещества в различных органических растворителях, не смешивающихся с водой (см. Приложения), и величиной фактора извлечения (процент извлечения). Фактор извлечения будет зависеть от химической природы экстрагируемого вещества, и в первую очередь от константы его ионизации (рКа) (см. Приложения), значения рН мочи при выполнении экстракции, селективности экстрагента и внешних условий процесса (температура, техника выполнения и т.д.). Начало формы Конец формы Большинство анализируемых биообъектов, содержащих токсические вещества, делятся на следующие категории в зависимости от их морфологических особенностей, определяющих соответствующие схемы пробоподготовки. Жидкости с небольшим содержанием биологического материала — промывные воды желудка, вода, вино, пиво, спирты, минеральная вода. Жидкости с заметным содержанием биологического материала — кровь, желудочный сок и содержимое кишечника, чай, кофе, молоко, сиропы, супы. Твердые вещества, которые являются простыми соединениями или простыми смесями, — таблетки, капсулы, сахар, соль, остатки "неизвестного" порошка и т.д. Твердые вещества, которые являются сложными смесями, — хлеб, жиры, масла и все виды живых тканей (мускулы, волосы, ногти, мозг, печень, почки), растительные ткани, цветы. Каждая из этих групп требует своей аналитической схемы, так как методы изолирования, описанные для мочи (тип 1), не всегда пригодны для крови (тип 2) и тканей (тип 4), и наоборот (схемы 17 — 20). Методы изолирования, которые включают этап удаления белков, обычно необходимый для типа 4, совсем не обязательны для такого биоматериала с небольшим содержанием белка, как моча. Правильные результаты анализа в целом и экстракции в частности во многом зависят от доинструментального этапа, т.е. преданалитической техники обработки образца. Для каждого биообъекта необходимо предусмотреть в связи с его спецификой следующее: 1) корректный отбор пробы; 2) хранение пробы; 3) подготовку пробы к экстракции; 4) схему и метод экстракции; 5) наличие эндогенных и экзогенных веществ, влияющих на чистоту экстракта и конечный анализ яда и его метаболитов. Если первые четыре фактора связаны с техникой экстракционной обработки, учет последнего фактора требует от исследователя знания токсико- и фармакокинетических параметров биологической матрицы и анализируемого образца. На содержание эндогенных и экзогенных компонентов в экстракте влияют: 1) возраст, пол и вес пациента, определяющие во многом распределение яда и его метаболизм; 2) параллельное присутствие других экзогенных химических веществ (лекарственные средства, кофеин, табак, алкоголь и др.), изменяющих фармакокинетические и фармакодинамические параметры яда; 3) диета — свободные жирные кислоты связываются с альбуминами и конкурируют на этапе связывания яда с белком: так, если токсическое вещество введено до приема пищи, то вследствие особенностей всасывания усиливается реабсорбция яда в тонкой кишке и соответственно повышается его концентрация в крови; 4) генетический эффект — относительно человека подобная информация очень разноречива, однако необходимо отметить, что отдельные индивидуумы обладают повышенной толерантностью к действию некоторых химических агентов; если для одних доза введенного яда является смертельной, то для других эта же доза относительно безвредна (по крайней мере не вызывает летального исхода); 5) другие факторы, действие которых необходимо предусматривать, — болезнь (может дать повышенный фон некоторых эндогенных соединений), работа с соединениями бытовой или индустриальной химии (повышенный фон эндо- и экзогенных веществ). Ниже приводятся некоторые особенности различных биообъектов. Моча — наиболее распространенный объект исследования на лекарственные токсические соединения и наиболее простой биообъект (среди других) для анализа вследствие низкого содержания белковых компонентов. Важным показателем мочи как биообъекта является рН, поэтому работа с ней требует постоянного внимания к изменению рН. Величина рН мочи повышается со временем из-за действия бактериальной флоры, выделяющей аммиак. Такое увеличение можно предотвратить путем ее хранения при пониженных температурах (при анализе очень лабильных веществ — в замороженном виде). Действие бактериальной флоры можно замедлить добавлением натрия фторида, борной кислоты и других бактериостатических препаратов, однако надо учитывать их дальнейшее участие в экстракции и образовании фона. Мочу можно лиофилизировать, предварительно переведя летучие соединения в соответствующие соли. Из потенциальных эндогенных соединений необходимо отметить присутствие низкомолекулярных продуктов метаболизма аминокислот и сахаров (амины, мочевина, карбоновые кислоты и др.), небольших количеств пептидов и сахаров (в норме), стероидов и пигмента уробилина, окрашивающего мочу в желтый цвет (λмакс = 490 мм) и мешающего спектрофотометрическому определению. Преданалитическая обработка мочи состоит из различных операций: прямого концентрирования, экстракции растворителем, хроматографического разделения или сорбции на твердом сорбенте. Как правило, изолирование из мочи проводят по схеме 17. Кровь. Уровень токсических веществ и их метаболитов у живых объектов и в крови трупа неодинаков вследствие биохимических изменений. Содержание токсического вещества в артериальной или венозной крови также будет различным. Даже положение тела у живого пациента — стоя, сидя или лежа — влияет на биохимический состав пробы, так как в этом случае меняется содержание белков в крови, что особенно важно для токсических веществ, в значительной степени связывающихся с белком.  Обработке экстракцией может быть подвергнута цельная кровь, плазма или сыворотка. Если для предотвращения свертывания крови использовались антикоагулянты, то необходимо учитывать, что гепарин вытесняет жирные кислоты из мест их связывания с альбумином. Это влияет, с одной стороны, на увеличение связывания токсических веществ с белками, с другой — на переход жирных кислот в органический растворитель при экстракции. Для уменьшения энзиматической активности кровь рекомендуется хранить в холодильнике в замороженном виде. Поскольку стеклянные стенки посуды содержат большое количество свободных гидроксильных групп, возможно связывание полярных токсических соединений стенками посуды за счет образования водородной связи. Это явление особенно важно учитывать при анализе следовых количеств вещества. Предварительное силилирование стенок посуды позволяет свести это явление к минимуму. Альтернативой является использование посуды из полипропилена или тефлона, хотя при этом необходимо считаться с загрязнением пробы мономерами смолы. Из других эндогенных соединений помимо жирных кислот в экстрактах из крови встречаются различные стероидные гормоны (тестостерон и др.), холестерин, которые в крови находятся в связанном состоянии с протеинами плазмы. Слюна является продуктом секреции желез ротовой полости. Отобранную пробу слюны центрифугируют и для хранения замораживают, чтобы замедлить активность ферментов. Хранить лучше всего в склянках из тефлона или полипропилена, чтобы избежать поглощения следовых количеств анализируемого вещества стенками стеклянной посуды. Установлено, что неионизированные формы токсического вещества, находящиеся в водном растворе плазмы, пассивно диффундируют в слюну, так что существует прямая зависимость между концентрацией анализируемого вещества в слюне и его концентрацией в крови. Волосы представляют собой относительно гомогенный (с точки зрения агрегатного состояния) биологический субстрат. Являясь легкодоступными для отбора, они представляют значительный интерес в качестве объекта при проведении химико-токсикологического анализа как на неорганические, так и на органические яды. В последние годы установлено, что в волосах наркоманов обнаруживаются опиаты, амфетамины, фенциклидин, метаквалон, кокаин, каннабиноиды. Таким образом, возникает возможность обнаружения наркотиков в отдаленные сроки после окончания их приема и в тех случаях, когда анализ биожидкостей дает отрицательный результат. Важно, что наркотические вещества не метаболизируют в волосах. Для отбора пробы на площади около 1 см срезается прядка волос как можно ближе к основанию. При этом очень важно, чтобы волосы не изменяли своего относительного положения. Прядка фиксируется липкой лентой на бумаге, помечается верх и низ прядки. Принимая во внимание скорость роста волос (примерно 1 см в месяц), образец делится на кусочки различной длины и исследуется. При этом появляется возможность проследить динамику поступления наркотического вещества в организм пациента. Анализ волос длиной 6 — 8 см (6 — 8 месяцев) позволяет судить о степени тяжести наркотической зависимости. Ногти содержат 10,1 — 13,7% воды и 0,15 — 0,76% жироподобных веществ (холестерин и его эфиры). Из органических веществ основным является белок кератин, устойчивый к воздействию различных химических веществ, а из минеральных веществ — кальций, фосфор, цинк, мышьяк и др. В нашей стране факт накопления в ногтях наркотических соединений, и прежде всего опиатов, установлен недавно Е.А. Симоновым. Однако данных по определению наркотиков в ногтях еще недостаточно. Желчь является продуктом секреторной деятельности печени, желчного пузыря и двенадцатиперстной кишки. Эта жидкость содержит большое количество воды, эндогенных веществ, подобных тем, которые находятся в крови, плазме и сыворотке, а также желчные кислоты и пигменты. Желчь различается по величине рН (в пределах 6,7 — 8,3), что заставляет контролировать рН в ходе подготовки к экстракции, а при необходимости использовать подходящий буфер. Рекомендуется также пробу центрифугировать при низких скоростях (для удаления холестерина) и осадить белки добавлением смеси хлороформ — метанол (2:1) или хлороформ — изопропанол (9:2). При экстракции из желчи желчные кислоты образуют стойкую эмульсию, поэтому для разделения фаз необходим длительный период центрифугирования; так как большинство токсических веществ выделяется из желчи в виде конъюгата с глюкуроновой кислотой, желчь перед экстракцией подвергают гидролизу или обработке β-глюкуронидазой, а затем уже проводят экстракцию. Экстракты из желчи часто окрашены, что затрудняет их спектрофотометрирование. Предварительное осаждение белков несколько осветляет пробы. Вследствие липофильного характера большинства эндогенных веществ желчи экстракты обладают значительным фоном, особенно при использовании неполярных растворителей. Желчь экстрагируется по схеме 18. Фекалии. Этот биообъект анализируется на содержание токсического вещества, которое экскретируется вместе с желчью, а также если известно, что оно не полностью абсорбировалось в желудочно-кишечном тракте после орального введения. Для длительного хранения пробы замораживают или лиофилизируют, чтобы замедлить действие бактериальной флоры и уменьшить неприятный запах. Основная преданалитическая обработка состоит в гомогенизации пробы. Высушенные образцы, как правило, дают более воспроизводимые результаты. Экстракция проводится по схеме 18 или 20 при соответствующих значениях рН. Основные эндогенные соединения — желчные кислоты, стероиды, сахара и порфирины. Вследствие присутствия в биообъекте большого количества экзогенных веществ, поступивших с пищей, результаты анализа отличаются большой вариабельностью. Печень представляет собой центральный орган химического гомеостаза. К основным функциям относятся обмен белков, углеводов, липидов, ферментов, витаминов, водный, минеральный и пигментный обмен, секреция желчи, детоксицирующая функция. Ее многообразные функции обусловливают присутствие самых разнообразных эндогенных и экзогенных соединений в экстракте. Это — продукты белкового обмена (самый разнообразный белок и продукты его метаболизма вплоть до аммиака и мочевины), углеводного обмена (промежуточные продукты синтеза гликогена, окислительного фосфорилирования, реакций цикла Кребса), жирового обмена (метаболиты стероидов, полупродукты синтеза нейтральных, фосфо- и гликолипидов, холестерина и т.д.), продукты биотрансформации экзогенных, в том числе токсических, веществ, синтеза желчных кислот (холевая, дезоксихолевая и другие желчные кислоты). Пигментный обмен приводит к образованию так называемых билинов — окрашенных веществ, которые вносят соответствующий фон и мешают спектрофотометрическому определению. Разрушение гемоглобина приводит к образованию открытых тетрапирролов, издавна известных как желчные пигменты: образованные в результате ферментативного расщепления билирубины (билирубин и биливердин) выводятся с желчью в виде глюкуронидов. Бактерии кишечника восстанавливают билирубин до бесцветных структур, которые на воздухе окисляются до желто-коричневых продуктов, придающих окраску фекалиям и моче (стеркобилин и уробилин). Биливердин и билирубин представляют собой кислоты и поэтому растворимы в водных растворах едких щелочей. Их соли с большинством ионов нещелочных металлов в воде нерастворимы; кальциевая соль билирубина является главным компонентом желчных камней. Для большинства билинов характерно интенсивное поглощение света в видимой области (биливердин — 680 нм, билирубин — 450 нм, уробилин — 490 нм). С точки зрения присутствия эндогенных соединений в экстракте из печени этот объект является самым неудобным вследствие их большого разнообразия. Даже самая длительная и многоэтапная экстракция, например, кислых лекарственных средств дает в хлороформном экстракте до восьми разнообразных эндогенных соединений. Ткани мозга. Этот вид биообъекта отличается высоким содержанием липидов, и прежде всего фосфолипидов, стеринов и др. Среди продуктов метаболизма белковых веществ необходимо отметить присутствие низкомолекулярных пептидов (в том числе и обладающих опиатными свойствами). Из стеринов в тканях мозга отмечается значительное присутствие холестерина (0,25 — 0,30% в сухом веществе). Больше всего холестерола содержится в нервной ткани, особенно в белом веществе. В целом в мозговой ткани содержание его равняется 2 — 3%, в сером веществе - 0,9 - 1,4%, а в белом веществе - 4 - 5,3%. При экстракции из тканей мозга необходимо учитывать, что холестерол хорошо растворим в ряде органических растворителей (хлороформ, диэтиловый эфир, горячий этанол, бензол, сероуглерод, толуол, ацетон). В воде он нерастворим, но легко набухает, образуя стойкую эмульсию, вследствие чего может удерживать огромное количество воды, превышающее его массу в 100 раз. Поэтому становится очевидной необходимость предварительного (перед экстракцией) удаления липидов из пробы, что требует прежде всего разрушения комплекса "липид — жирорастворимое лекарство". |