лекция. Методы изолирования. Методы очистки и концентрирования вытяжек из биоматериала
 Скачать 90.88 Kb.
|
ОБЩИЕ И ЧАСТНЫЕ МЕТОДЫ ИЗОЛИРОВАНИЯ1. Изолирование водой, щавелевой кислотой, которая подкисляет (метод А.А. Васильевой) Измельченный объект (органы трупа) помещают в колбу или стакан и заливают двойным объемом дистиллированной воды, потом подкисляют смесь 10 % раствором оксалатной кислоты к рН 2-3 по универсальной индикаторной бумаге. После двухчасового настаивания при постоянном помешивании смеси получают водное вытяжку, которую процеживают через двойной слой марли. Операцию настаивания повторяют на протяжении часа с одинарным объемом подкисленной воды. Процеженные кислые водные вытяжки объединяют, помещают в делительную воронку и трижды стряхивают с отдельными порциями хлороформа (15, 10, 10 мл). Хлороформные вытяжки объединяют и фильтруют через небольшой бумажный фильтр, загодя смоченный хлороформом, в сухую колбу с надписью "Кислая хлороформная вытяжка". Водный слой в делительной воронке подщелачивают 25 % раствор аммиака к рН 8-9 по универсальной индикаторной бумаге и снова взбалтывают трижды с отдельными порциями хлороформа (15, 10, 10 мл). Хлороформную вытяжку объединяют, фильтруют, как описано выше, в колбу с надписью "Щелочная хлороформна вытяжка". При вытягивании ядов хлороформом из щелочной водной вытяжки образуются стойкие эмульсии, для разрушения которых можно применить центрифугирование содержимого воронки или увеличения к смеси безводного натрия сульфата. 2. Изолирование этанолом, который подкисляет оксалатной кислотой (метод Стаса-Отто) Измельченный объект (органы трупа) помещают в стакан или банку, заливают 96 % этанолом к образованию "зеркальной поверхности" и, смесь подкисляют 10 % спиртовым раствором оксалатной кислоты к рН 2-3 по универсальной индикаторной бумаге и оставляют на сутки при периодическом помешивании. После окончания отмеченного срока кислую спиртовую вытяжку отделяют, фильтруя через смоченный этанолом бумажный фильтр. Операцию вытягивания повторяют 2-3 раза. Спиртовые кислые вытяжки объединяют и испаряют на водяной бане при 40-50°С к густому сиропу. Сиропообразную жидкость обрабатывают 96° этанолом, подливая его по каплям до тех пор, пока этанол не перестанет вызывать помутнения жидкости. Осадку дают отстояться и потом фильтруют его через небольшой фильтр (диаметр 5-6 см), загодя смоченный спиртом. Фильтр промывают небольшим количеством спирта. Фильтрат сгущают в фарфоровой чашке на водяной бане к плотности сиропа и опять повторяют операцию осаждения. Так поступают до тех пор, пока этанол не перестанет осаждать белку. Потом вытяжку снова испаряют на водяной бане к плотности сиропа, остаток растворяют в 25 30 мл теплой воды, которая дистиллирует, и мутный раствор фильтруют через небольшой гладкий фильтр, смоченный водой, в делительную воронку. Водно-спиртовой раствор экстрагируют три раза хлороформом порциями по 15, 10 и 10 мл. Хлороформную вытяжку фильтруют через фильтр, смоченный хлороформом, в сухую колбу с надписью "Кислая хлороформная вытяжка". Водный остаток в делительной воронке подщелачивают 25 % раствором аммиака к рН 8-9 по универсальной индикаторной бумаге и снова проводят экстракцию хлороформом, как описано выше. Объединенные хлороформные вытяжки помещают в сухую колбу с надписью "Щелочная хлороформная вытяжка". 3. Изолирование водой подкисленной серной кислотой (метод В.Ф.Крамаренка) 100 г измельченного биологического материала помещают в колбу или стакан, заливают 0,0.1 М раствором серной кислоты к образованию зеркальной поверхности. Если рН раствору после перемешивания содержимого колбы выше, чем 2,5, то добавляют по каплям 20% раствор серной кислоты к указанному значению рН. Смесь оставляют на 2 ч. Периодически взбалтывая. После окончания этого времени водное вытяжку отделяют и процеживают через марлю; Операцию вытягивания проводят трижды. Кислые вытяжки собирают вместе и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а осадок снова заливают 20-30 мл 0,01 М раствора серной кислоты (рН 2,5), перемешивают, настаивают 2 г, после чего вытяжку центрифугируют. Центрифугати объединяют, насыщают сульфатом аммония и оставляют на 1-2 ч. Если образовался осадок, его отделяют центрифугированием. Освобожденную от белков кислую жидкость дважды экстрагируют эфиром порциями по 40 мл. Эфирный слой отделяют, а к водной вытяжке добавляют 20 % раствор гидроксида натрия к рН 8,5-9 и проводят трижды экстракцию веществ основного характера отдельными порциями хлороформа, равными третьей части объема водной фазы. Хлороформные вытяжки объединяют, фильтруют через сухой фильтр, а потом растворитель отгоняют на водяной бане при температуре 40-50°С досуха. В зависимости от поставленного задания сухой остаток растворяют в 5-6 мл хлороформа или в 10 мл 0,1 М раствора хлороводородной кислоты и проводят исследование на алкалоиды. При необходимости исследуется и эфирная вытяжка, полученная из кислой водной вытяжки, на вещества, которые экстрагируются с кислой водной среды органическим растворителем. 4. Изолирование ацетоном (метод Карташова В. А.) 5 г гомогенизированной ткани внутренних органов, помещают в флакон (пенициллину) вместимостью 20 мл, добавляют 5 мл ацетону; смесь перемешивают, закрывают полиэтиленовой пробкой и взбалтывают на автоматическом встряхивателе в течение 10 мин. Потом содержимое флакона центрифугируют 5 мин при 2500 о/хв и жидкость надосадочную сливают через небольшой ватный тампон в флакон вместимостью 30 мл. Операцию вытягивания повторяют еще 3 раза. К объединенным ацетоновым вытягиваниям добавляют 20 мл 0,5 М раствора хлороводородной кислоты и вытягивают 2 раза н-гексаном по 10 мл. Органическую фазу отделяют и отбрасывают. Из водной фазы вещества экстрагируют эфиром 2 раза по 10 мл. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют через бумажный фильтр и испаряют под током теплого воздуха досуха. Сухой остаток исследуют на вещества кислотного характера. Водную фазу подщелачивают до рН 11, добавляют 5 хлориду натрия и экстрагируют 2 раза эфиром по 10 мл. Эфирные экстракты объединяют, фильтруют, растворитель испаряют, сухой остаток исследуют на вещества основного характера. 5. Экспресс-метод изолирования производных фенотиазина подкисленным ацетонитрилом (метод Е. М. Саломатіна) 50 г измельченного биологического материала помещают в колбу, подкисляют 10. % раствором хлороводородной кислоты к рН 2-3 и проводят экстракцию ядов 100, 50 и 50 мл ацетонитрилом в течение 30, 15 и 15 мин с использованием механического встряхивателя. Ацетонитрильную вытяжку фильтруют через увлажненный водой, которая дистиллирует, бумажный фильтр в делительную воронку, которая содержит 500 мл 2,5 % водного раствора сульфата натрия. Содержимое делительной воронки перемешивают к образованию гомогенного раствора, подкисляют 6 М раствором хлороводородной кислоты к рН 2,0-3,0 (по универсальному индикатору) и трижды по 10 мин экстрагируют порциями эфира по 100 мл. Что остался после экстракции эфиром, кислый водно-ацетонитрильний раствор подщелачивают насыщенным водным раствором гидроксида натрия к рН 13 по универсальной индикаторной бумаге и трижды экстрагируют по 10 мин порциями эфира по 100 мл. Эфирные экстракты испаряют под вакумом на роторном испарителе при 40°С к объему 35-40 мл и фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 мл. через бумажный фильтр диаметром 5-6 см, что содержит 1,5-2 г безводного сульфата натрия. Испарительную колбу и фильтр промывают 10-15 мл эфира, который присоединяют к фильтрату в мерной колбе. Содержимое колбы доводят до метки и исследуют. 6 Изолирование барбитуратов подщелоченной водой ( метод Валовая) До 100 г измельченного биологического материала добавляют воду и 10 % раствор гидроксида натрия (180 и 20 мл соответственно). Смесь перемешивают и оставляют на 30 хв при периодическом помешивании, потом процеживают и центрифугують в течение 30 хв при 3000 о/мин. К центрифугату добавляют 120 мл 10 % раствору вольфрамата натрия и 0,5 М раствор серной кислоты к рН 2. После чего смесь нагревают в течение 20 хв на кипящей водяной бане, а потом центрифугують в течение 30 мин. Центрифугат процеживают через ватный тампон, сливая из осадка. Тампон промывают 10 мл воды, присоединяя ее к процеженному центрифугату. К кислой вытяжке добавляют ровный объем эфиру и взбалтывают в течение 15 мин. Органическую фазу отделяют и взбалтывают из 50 мл 10 % раствора гидроксида натрия, после чего отделяют водный слой, подкисляют его 25 % раствором серной кислоты к рН 2 и взбалтывают с равным объемом эфира. Отделяют эфирный слой, и проводит с ним анализ экстракта на барбитураты. 7. Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной кислотой (метод В. И. Поповой) 100 г измельченного биологического материала (печенка, почки, мозг) заливают 0,01 М раствором серной кислоты (80 мл), жидкость доводят 30 % раствором серной кислоты к рН 2,0-3,0 и оставляют на 2 г при периодическом помешивании. Потом вытяжку сливают, операцию настаивания с подкисленной водой, повторяют еще 2 раза по часу, заливая объект новыми порциями 0.01 М серной кислоты (по 80 мл). Вытяжки объединяют, процеживают через 3 слоя марли, измеряют объем, потом центрифугируют (3000-5000 о/мин) в течение 20-30 мин. 25 или 50 мл центрифугата вносят к колонке (40 х 2,5 см), заполненной гелем сефадекса G, - 25 (размер частиц в сухом состоянии 100-300 мкм). На полиэтиленовой трубке в нижней части колонки открывают зажим - внесенная к колонке вытяжка наряжайся гелем (над гелем должен оставаться небольшим слоя жидкости). После этого в колонку дважды вносят по 2 мл 0, 01 М раствора серной кислоты, каждый раз открывая зажим. Для элюирования барбитуратов колонку соединяют с установленным выше сосудом, заполненным 0,01 М раствором серной кислоты, и открывают зажим внизу колонки. Первые 150 мл элюата отбрасывают, а следующие 200 мл переносят в делительную воронку, куда добавляют 50 мл хлороформу; содержимое воронки взбалтывают 10 мин. Экстракцию новыми порциями хлороформа проводят еще 2 раза. Хлороформные вытяжки объединяют, испаряют при 40°С досуха и исследуют. 8. Изолирование метаболитів производных 1,4-бенздиазетина (метод Б.Н.Ізотова с соавторами) До 25 г гомогенизата органа добавляют 6 М раствор хлороводородної кислоты в соотношении 1:2 и проводят гидролиз объекта в колбе с обратным холодильником на глицериновой бане при температуре 140-145°С в течение 60 мин. Гидролизат центрифугируют при 5000 о/хв в течение 15 хв, фильтруют и экстрагируют трижды порциями 50, 25, 25 мл смесью хлороформ-пентанол (9:1). Органическую фазу отделяют в мерную колбу на 100 мл. фильтруя через слой безводного сульфата натрия, и доводят до метки, после чего исследуют на бензофеноны (продукты метаболизма производных 1,4-бенздиазепина). Начало формы Особенности интерпритации результатов в анализе биологических объектов. Используя полученные результаты, токсиколог должен не только подтвердить или опровергнуть предположение о присутствии одурманивающих средств в анализируемом образце, но и различить случаи хронического и разового использования наркотических средств. Последнего можно достичь, если сопоставить концентрации обнаруженного вещества и его метаболитов. Как правило, более высокие концентрации метаболитов свидетельствуют о хроническом применении, а значительное превышении концентрации вещества над концентрацией метаболита – об остром отравлении (разовом употреблении). Для правильной интерпретации результатов анализа важно знание формы м способа введения. Внутривенное введение или ингаляция в начальный момент дают более высокие концентрации вещества в крови, чем внутримышечное, оральное, подкожное. В случае анализа трупного материала равные концентрации, обнаруженные в печени и крови, свидетельствуют о хроническом использовании высоких доз наркотических веществ. В случае острого отравления концентрация анализируемого вещества в печени значительно превышает концентрацию его в крови. Высокие концентрации одурманивающих средств в крови на раннем этапе после внутривенного или орального введения будут соответствовать более высоким концентрациям в легких и печени, в то время как в период выведения концентрация в желчи и моче будет выше, чем в крови. Одурманивающие средства основного характера дают сравнительно низкие концентрации крови, а отношение концентраций в печени и крови часто выше 10. Соединения кислого характера дают умеренно высокие концентрации в крови и это отношение находится в пределах от 2 до 5. Для веществ нейтрального характера наблюдаются высокие концентрации в крови и почти одинаковое содержание в других тканях. Для корректной интерпретации полученных данных такого биообъекта, как моча, необходимо также знание дозы. Времени, способа и периодичности введения вещества, кинетики распределения. Однако надо оговориться, что в случае наркотиков подобная информация редко доступна и не всегда полна. Тем не менее, можно высказать следующие замечания: Чем больше введенная доза, тем больше вероятность их обнаружения. Высокие дозы обычно дают высокие концентрации в плазме и моче. Так, например, при использовании 30мг кодеина он может быть детектирован в моче в течении 1 – 6 часов после употребления, а при дозе в 60 мг – в течении 1 – 10 часов. Концентрация вещества в плазме зависит от его распределения в организме, метаболизма и выведения. Для каждого вещества его фармакокинетика индивидуальна. Концентрация наркотических веществ в моче варьируется по сравнению с плазмой и зависит от объема и рН мочи. Каждое вещество сохраняется в организме разное время. Такое вещество как кокаин, элиминируется из организма относительно быстро. Например, обычная доза кокаина может быть детектирована в течении дня и менее. Ежедневное употребление кокаина позволяет его обнаруживать в течении двух - трех дней после окончания употребления. При курении одной сигареты гашиша в день в моче детектируются каннабиноиды в течении одного - двух дней после последнего употребления и в течении трех – пяти дней более чувствительными методами. Ежедневное курение позволяет обнаружить каннабиноиды в течении трех и более недель после прекращения употребления. Общим правилом считается, что употребление гашиша приводит к аккумуляции веществ и их метаболитов в организме. Чем чаще прием, тем больше вероятность их обнаружения. Различные вещества охраняются в организме по-разному в зависимости от их химического строения и частоты употребления. Вещества, подобные кокаину, быстро выводятся из организма, поэтому отбор пробы мочи должен производиться как можно скорее после приема наркотика. Для веществ, которые медленно выводятся из организма (например, компоненты гашиша), время отбора мочи не имеет решающего значения. Поскольку концентрация большинства веществ в моче (за исключением этанола) не коррелирует их концентрацией в крови и степенью наркотического воздействия, время употребления наркотического вещества по концентрации в моче не может быть установлено. Конец формы Начало формы |