|
|
Руководство по управлению Axio Observer Z1 new. Методические указания для студентов и аспирантов химических, биологических и физических специальностей высших учебных заведений
В. М. Бойцов, С. Ю. Вязьмин, А. А. Богданов
Pуководство по управлению инвертированным микроскопом
Axio Observer.Z1
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
СПб АУ НОЦНТ РАН
2011
Р
ОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
__________________________________________________
УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК “САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ – НАУЧНО-ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ ЦЕНТР НАНОТЕХНОЛОГИЙ РАН”
В. М. Бойцов, кандидат химических наук, старший научный сотрудник,
C. Ю. Вязьмин, кандидат химических наук, старший научный сотрудник,
А. А. Богданов, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник
Pуководство по управлению инвертированным микроскопом
Axio Observer.Z1
Методические указания для студентов и аспирантов химических,
биологических и физических специальностей высших учебных заведений
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2011
Рассмотрено и рекомендовано к изданию учебно-методической комиссией
???
Санкт-Петербургского академического университета – научно-образовательного центра нанотехнологий РАН
-------- 2011 г.
О т в е т с т в е н н ы й р е д а к т о р
Чл.-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор М. В. Дубина
Р е ц е н з е н т ы:
кафедра ???
Санкт-Петербургского ??? университета
доктор химических наук, профессор ?. ?. ???, Санкт-Петербургский ??? университет
УДК ???
В. М. Бойцов, С. Ю. Вязьмин, А. А. Богданов. Pуководство по управлению инвертированным микроскопом Axio Observer.Z1: Методические указания. СПб.: СПб АУ НОЦНТ РАН, 2011, ??? с.
Представлено кафедрой (лабораторией)??? нанобиотехнологий.
В методических указаниях рассмотрены основные принципы съемки и обработки изображений с помощью инвертированного микроскопа универсального применения. Изложенный материал будет полезен для освоения методов и получения практических навыков при работе с инвертированными микроскопами.
Предназначено для студентов и аспирантов химических, биологических и физических специальностей высших учебных заведений.
В. М. Бойцов, 2011
С. Ю. Вязьмин, 2011
А. А. Богданов, 2011
СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
1. Введение………………………………………………………………………………………………….....5
2 Описание прибора .8
3 Управление .9
3.1 Обзор органов управления и функциональных элементов .9
Описание органов управления и функциональных элементов 11
3.3 Система управления светом на Axio Observer.D1 и Z1 19
Режим управления светом: OFF 19
Режим управления светом: CLASSIC 20
Режим управления светом: SMART 20
Выбор и настройка режима управления светом на штативе Z1 21
3.4 Система управления контрастностью на Axio Observer. Z1 21
3.5 Сенсорный экран TFT-дисплея на Axio Observer.Z1 22
Структура экрана 22
Структура меню 24
Стартовая страница Home 25
Microscope 26
Settings 33
Display ..41
3.6 Методы освещения и контрастирования ..42
Настройка светлого поля в проходящем свете по КЁЛЕРУ ..42
Настройка фазового контраста в проходящем свете ..44
Настройка дифференциального интерференционного контраста (DIC) в
проходящем свете ..46
Настройка PlasDIC-контраста в проходящем свете ..49
Настройка VAREL-контраста в проходящем свете ..49
Настройка флуоресцентного контраста в отраженном свете ..51
Введение
Оптический микроскоп (от греч. mikros – малый и skopeo – смотрю) – оптический прибор, предназначенный для получения сильно увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), не видимых невооружённым глазом. Различные типы микроксопов применяются для изучения микроструктуры клеток, бактерий, срезов тканей, микрокристаллов, волокон, минералов, микросхем и др. объектов, размеры которых меньше минимального разрешения глаза, равного 0.1 мм. Оптическая микроскопия даёт возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0.2 мкм. Обычно микроскопы имеют двухступенчатую систему увеличения, образованную объективом и окуляром и обеспечивающую увеличение до 1500 крат. В оптическую схему микроскопа входят также элементы, необходимые для освещения объекта. Изучаемый объект обычно помещают перед объективом на расстоянии немного большем фокусного.
Принцип работы типичного микроскопа можно пояснить следующим образом. Объектив образует увеличенное действительное и перевёрнутое изображение в плоскости полевой диафрагмы, лежащей за передним фокусом окуляра. Это промежуточное изображение рассматривается через окуляр, который даёт дополнительное увеличение и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения (порядка 250 мм). При этом на сетчатке глаза образуется действительное изображение предмета. Если окуляр сдвинуть так, чтобы изображение оказалось перед передним фокусом окуляра, то изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его можно получить на экране монитора. Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличений объектива и окуляра: Обычно объективы имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры от 7 до 15, поэтому общее увеличение лежит в пределах от 44 до 1500.
Разрешающая способность микроскопа, т.е. его способность давать раздельные изображения двух соседних точек объекта, ограничена дифракцией света, в результате которой изображение бесконечно малой светящейся точки имеет вид яркого пятна (диск Эри) с концентрическими тёмными и светлыми кольцами постепенно убывающей яркости. Предел разрешения микроскопа определяется при сближении точек до такого расстояния, когда падение освещённости в промежутке между ними становится незаметным для глаза и точки сливаются в одну. Установить однозначно этот предел трудно. Чаще всего для его определения используется критерий Рэлея, в соответствии с которым точки считаются разрешёнными, когда расстояние между ними равно радиусу диска Эри. При этом в случае самосветящихся некогерентных излучателей освещённость в промежутке между точками составляет 80 % от освещённости в максимуме. Человеческий глаз может замечать контраст в освещённости до 4 %. Этому соответствует наименьшее расстояние, разрешаемое в микроскопии. Когерентные излучатели на таком расстоянии не разрешаются и для получения 20 %-ного контраста должны быть установлены на расстоянии r = 0.84λ/A, где λ – длина волны света, A – числовая апертура. Разрешающая способность микроскопа прямо пропорциональна апертуре объектива, и для ее повышения пространство между объективом и предметом заполняется жидкостью с большим (n > 1) показателем преломления. Максимальная апертура "сухих" объективов и апертура объективов с масляной иммерсией может быть доведена до 1.4. При этом в видимой области возможно разрешение структур с расстоянием между элементами
0.2 мкм. Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличения. Увеличение в пределах 500-1000 А называется полезным, т. к. при таком увеличении глаз различает все элементы структуры объекта, разрешаемые микроскопом. Более слабые увеличения не позволяют выявить все детали, а большие увеличения бесполезны, т. к. никаких новых подробностей структуры не выявляют.
Глубина резкого изображения микроскопа, характеризующая возможные пределы продольного перемещения бесконечно тонкого объекта без заметного ухудшения резкости, складывается из волновой глубины, обусловленной дифракционным размытием точки вдоль оптической оси, и геом. глубины, связанной с конечной остротой зрения наблюдателя.
Степень подобия изображения в микроскопии самому объекту зависит от апертуры объектива. Если объект – дифракционная решётка, освещённая параллельным пучком света, то дифрагированные волны образуют в плоскости апертурной диафрагмы объектива пространственные спектры объекта разных порядков (первичное изображение объекта). Эти спектры представляют собой совокупность дифракционный максимумов, расположенных в задней фокальной плоскости объектива на расстоянии тем большем, чем меньше интервал между штрихами решётки, т.к. чем мельче структура, тем на больший угол отклоняется дифрагированный свет. Следовательно, для разрешения мелких структур нужна большая апертура. Изображение решётки в плоскости увеличенного изображения (вторичное изображение) возникает в результате интерференции пучков света, исходящих из дифракционных
максимумов разных порядков. Получаемое изображение тем ближе к оригиналу, чем больше максимумов участвует в формировании изображения.
Микрообъективы по степени исправления хроматической аберрации разделяются па ахроматы и апохроматы. У ахроматов исправлена хроматическая аберрация для двух длин волн и остаётся небольшая окраска изображения, апохроматы дают бесцветное изображение объекта, т.к. хроматическая аберрация исправлена для трёх длин волн. Существуют также суперапохроматы – линзовые системы, ахроматизованные одновременно в УФ и видимой областях спектра (250-700 нм). Планахроматы и планапохроматы имеют плоское поле зрения, что особенно важно для микрофотографии. Кроме того, микрообъективы различаются: по длине тубуса, на которую они рассчитаны, по среде между объективом и препаратом на сухие и иммерсионные системы различных типов, по методу наблюдения на обычные и фазово-контрастные, по типу препаратов с покровным стеклом и без него и т.д.
Типы микроскопов определяются либо областью применения, либо методом исследования. Биологические микроскопы предназначены для исследований в микробиологии, гистологии, цитологии и т.д., а также используются для наблюдения прозрачных объектов в химии, физике, минералогии и т.п. Препарат при этом заключается, как правило, между покровным и предметным стёклами стандартных размеров. В биологических исследованиях используется также люминесцентные микроскопы для наблюдения микрообъектов в свете их люминесценции. Оптическая схема люминесцентного микроскопа отличается от обычной схемы выбором источника света и установкой светофильтров в осветительной системе и после объектива. Первый светофильтр выделяет ту область спектра излучения источника, которая возбуждает люминесценцию самого объекта или специальных красителей, которыми обработан объект; второй светофильтр пропускает только свет люминесценции. Люминесценция объектов возбуждается УФ или коротковолновой частью видимого спектра, и поэтому источниками света в люминесцентных микроскопах служат ртутные лампы или лазерные источники света. В инвертированных микроскопах объектив располагается под наблюдаемым объектом, а конденсор сверху. Эти микроскопы предназначены для исследования культуры тканей, находящихся в специальных сосудах с питательной средой. Металлографические микроскопы используются для исследования микроструктуры металлов и др. непрозрачных объектов. Образцы металла предварительно полируются и протравливаются, благодаря чему зерна структуры становятся отличными друг от друга по отражению. Поляризационные микроскопы применяются для исследования в поляризованном свете анизотропных объектов: минералов, огнеупорных и текстильных материалов, биологических препаратов и пр. Проходя через эти объекты, поляризованный свет претерпевает изменения, по которым можно судить об основных оптических характеристиках микрообъектов: количестве оптических осей и их ориентации, силе двойного лучепреломления, вращении плоскости поляризации, плеохроизме. В отличие от обычного микроскопа в осветительной системе поляризационного микроскопа установлен поляризатор, а после объектива – анализатор. Стереомикроскопы благодаря возможности получения объёмных изображений служат для проведения препарировальных работ в биологии и выполнения технологических операций в микроэлектронике. В офтальмологии, отоларингологии и др. при микрохирургических операциях применяются стереомикроскопы специальной конструкции. Измерительные микроскопы используются в машиностроении для точных измерений линейных размеров объекта. Существует также много типов специализированных микроскопов или установок, построенных на базе микроскопов: УФ- и ИК-микроскопы, используемые для проведения исследований за пределами видимой области спектра; микроустановки – для съёмки движения микроорганизмов, процесса деления клетки, роста кристаллов; высокотемпературные микроскопы – для исследования металлов, нагретых до 2000 °C; микроскопы с дистанционным управлением для исследования радиоактивных материалов; интерференционные микроскопы – для исследования фазовых объектов в проходящем и отражённом свете; микроскопы для изучения следов элементарных частиц в толстослойных ядерных эмульсиях; проекционные микроскопы – для получения на экране изображения микропрепаратов; микроскопы для проведения различных видов спектрального анализа в проходящем и отражённом свете, в свете флуоресценции, комбинацонного рассеяния, эмиссии; микроскопы-фотометры (в т. ч. сканирующие, цитофотометры), микроскопы-микрофлуориметры, микроскопы-микроспектрофотометры и т. д.
Конфокальная микроскопия – один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеянного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем
сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой , проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек, в основном, задерживается диафрагмой.
Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.
Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.
Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача – исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.
Люминесценцией называется излучение света телами, избыточное над тепловым при той же температуре и имеющее длительность, которая значительно превышает периоды оптического излучения. В зависимости от способов возбуждения люминесцентного свечения различают катодолюмицесценцию (при бомбардировке вещества электронами), электролюминесценцию (при прохождении электрического тока), фотолюминесценцию (при освещении) и хемилюминесценцию (при химических реакциях). В микроскопии применяется фотолюминесценция, возбуждаемая обычным светом или лазерным источником.
Люминесцентное излучение является неравновесным и вызывается сравнительно небольшим числом центров люминесценции (атомов, молекул или ионов), переходящих в возбужденное состояние под действием источника люминесценции. Возвращение возбужденного центра в нормальное или менее возбужденное состояние сопровождается люминесцентным излучением. Длительность этого излучения определяется временем жизни возбужденного состояния. Время жизни метастабильного возбужденного состояния достигает 10−4 с, что соответственно увеличивает и длительность люминесценции.
Люминесценцией, которая сразу прекращается после того как заканчивается действие возбудителя свечения, называется флуоресценцией. Люминесценция, сохраняющаяся длительное время после прекращения действия возбудителя свечения, называется фосфоресценцией. Подразделение люминесценции на флуоресценцию и фосфоресценцию условно.
Фотолюминесценция возбуждается электромагнитным излучением видимого или ультрафиолетового диапазона и подчиняется правилу Стокса: длина волны фотолюминесценции обычно больше, чем длина волны возбуждающего света. В терминах квантовой теории фотолюминесценция возникает за счет поглощения фотона возбуждающего света с энергией hν и возникновения вследствие этого фотона с энергией hνлюм меньшей, чем hν. Разность энергии возбуждающего и испускаемого фотона – избыточная энергия – энергия, затраченная на процессы, не связанные с фотолюминесценцией (например, на энергию теплового движения). Обычно избыточная энергия больше нуля в соответствии с правилом Стокса. Иногда возникает антистоксовское излучение, подчиняющееся условию, противоположному правилу Стокса. Это происходит в тех случаях, когда с энергии возбуждающего фотона добавляется определенная часть энергии теплового движения частиц люминесцирующего вещества. |
|
|
Скачать 1.09 Mb.