МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Тема: Методы экстрагирования из микробной массы ферментов, витаминов и липидов. Цель работы: Иметь представление о методах микробиологического производства ферментов, витаминов и липидов. Задание:
Материалы и оборудование: Жидкая питательная среда с культурой Staphylococcus, ацетон, пустые флаконы, выпарные чашки, баня водяная, шкаф вытяжной, 5% раствор соляной кислоты, культура Аspergillus. Теоретическая часть. Продуценты ферментных препаратов. Технические препараты ферментов. Для получения ферментных препаратов используют как микроскопические грибы, так и бактерии и дрожжи. Иногда получение технического ферментного препарата кончается проведением процесса ферментации, например в спиртовой промышленности для осахаривания крахмала используют жидкую культуру Aspergillus niger, выращенную глубинным методом культивирования на спиртовой барде с добавками крахмала (1%) и различных солей. Впоследствии ее добавляют в жидком виде в количестве 10—12% к осахариваемому затору. Однако активность ферментов в культуральной жидкости быстро снижается. Поэтому широко практикуют получение сухих технических ферментных препаратов. Технические препараты ферментов. Комплексный амилолитический ферментный препарат получают путем выращивания плесневых грибов на твердой питательной среде с последующей сушкой и измельчением полученной массы. Более активный препарат фермента получают путем экстракции такого «грибного солода» с последующим выпариванием и сушкой. Еще более активные ферментные препараты можно выделить из культуральной жидкости путем осаждения амилазы ацетоном и дальнейшим высушиванием коагулята при температуре 27—28°С. Для осаждения фермента часто используют и сульфат аммония. Предварительно культуральную жидкость выпаривают при температуре 40°С до 40%-ного содержания сухих веществ. Коагулят сушат вместе с наполнителем. В Японии для пищевых нужд используют технический препарат амилазы, полученный адсорбцией фермента из культуральной жидкости особо обработанным крахмалом. Затем амилазу вместе с крахмалом лиофилизируют. Препарат, содержащий пектиназу, получают из отходов производства лимонной кислоты — мицелия Aspergillus niger, высушивая его или коагулируя из экстракта белковую фракцию мицелия. Этот препарат используют для осветления соков и увеличения их выхода при обработке ягод и фруктов. В качестве продуцента амилазы применяют Aspergillus awamori или другую культуру рода Aspergillus. Характерной особенностью синтеза целлюлазы Т. lignorum на среде с молочной сывороткой является активное накопление ферментов в культуральной жидкости в интервале 36—54 ч и довольно быстрое падение активности в последующие часы. Максимум накопления целлюлазы в культуральной жидкости совпадает по времени с максимальным потреблением лактозы среды и рН 7,6— 7,8. Далее, в течение нескольких часов (в среднем 2—4) происходит повышение рН до 8,0—8,1 и резкое падение активности целлюлазы почти вдвое. Об окончании ферментации можно судить по рН среды 7,8, внешнему виду мицелия — плотный желтого цвета и прозрачной культуральной жидкости. Повышение рН до 8,0 и выше сопровождается началом автолиза мицелия и помутнения культуральной жидкости. Быстрое падение активности целлюлаз в культуральной жидкости через несколько часов после завершения ферментации происходит, по-видимому, из-за действия протеолитических ферментов, образующихся за счет наличия сывороточного белка в среде. Осаждение целлюлаз из культуральной жидкости можно осуществить ацетоном, изопропанолом и танином с желатином. При использовании ацетона, изопропанола и этанола необходимо добавить три объема осадителя на объем культуральной жидкости. Исходный рН среды 7,6—7,8, температура 10—15°С. Осадок отделяют через 20—30 мин после добавления осадителя. Высаливание сульфатом аммония необходимо вести при 80% насыщении, исходном рН среды 7,8 и температуре 10—15°С. Длительность формирования осадков 24 ч. Отделяют осадок центрифугированием при 3000—4000 об/мин в течение 10—15 мин. Ферментный осадок лиофильно или под вакуумом сушат при 25—30°С до остаточной влажности 10—12%. Наиболее эффективно осаждение целлюлозы танином и желатином. Выделение и очистка ферментов. Ферменты, растворенные в цитоплазме клеток, легко экстрагируются из них водой или разбавленными растворами солей. Затем эти ферменты очищают и отделяют друг от друга, фракционируя сульфатом аммония. Ферменты, связанные со структурными элементами клеток, можно выделить только после разрушения клеточной оболочки — дезинтеграции. Клетки можно разрушить механически — растирая, замораживая и оттаивая, подвергая действию ультразвука, или же ферментативно, используя специальные ферментные препараты. Для разрушения клеток биомассу вначале промывают децимолярным раствором сахарозы (рН 7,3), содержащим какой-либо буфер, этилендиаминтетрауксусную кислоту и альбумин. Затем добавляют стеклянные микрошарики и гомогенизируют в дезинтеграторе 1—2 мин при 13000 об/мин. Клеточные стенки и стеклянные микрошарики отделяют центрифугированием. Если фермент содержится в липопротеидных комплексах, не растворимых в воде, тогда при помощи бутилового спирта в количестве 3—6% объема ферментного раствора из него извлекают липиды. Фермент остается в водном слое, а липиды переходят в слой бутилового спирта. Концентрирование растворов ферментов достигают, избавляясь прежде всего от балластных белков. Если фермент термостабилен, например рибонуклеаза, то от белков освобождаются нагреванием раствора. Осадок отделяют центрифугированием. Для коагуляции белков и очистки фермента используют также органические растворители — ацетон, этиловый спирт, метиловый спирт, диоксан. Дальнейшую очистку ферментного препарата, содержащего в небольших количествах примеси белков, сходных по физико-химическим свойствам с ферментом, ведут методом ионообменной хроматографии. Белки в ионообменном процессе взаимодействуют с ионитом и при помощи электростатического взаимодействия связываются с его поверхностью. Для элюирования белков с поверхности ионита используют изменение концентрации при рН пропускаемого через ионит буфера или введение нейтральных солей (NaCl, КС1). Получение витаминов. Рибофлавин. Цианкоболамин. Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды. Культура, способная синтезировать какой-либо витамин, называется аутотрофной по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный витамин, она является аутогетеротрофной. Витамины группы В. Сравнительно богаты витаминами группы В дрожжи (хлебопекарные, пивные, кормовые). Изменяя условия среды, содержание отдельных витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Например, небольшие добавки марганца способствуют накоплению инозита в клетках. Так, повышенные дозы кобальта (100— 500 мкг хлорида кобальта на 100 г) увеличивают содержание пиридоксина (витамин Вб) в культуральной жидкости. Рибофлавин. Для получения препарата витамина В2 используют культуру дрожжей Candida guilliermondia, бактерии Clostridium acetobutylicum, даже продуцент лизина Brevibacterium и др. Однако наибольшую продуктивность в биосинтезе рибофлавина имеет дрожжеподобная культура Eremothecium ashbuii, дающая до 6000 мкг рибофлавина на 1 г сухого вещества питательной среды. Рибофлавин накапливается в клетках микроорганизмов либо в виде флавинадениннуклеотида, либо в свободном виде. В последнем случае он представляет собой желтые кристаллы, находящиеся в вакуолях. Максимального количества биомассы культура Eremothecium ashbuii достигает на второй день культивирования. В это время наблюдается интенсивное спорообразование и синтез рибофлавина. При старении культуры, особенно через 4—5 сут культивирования, клетки начинают автолизироваться и рибофлавин переходит в среду. Микроорганизм Eremothecium ashbuii развивается и синтезирует рибофлавин на синтетических средах с уменьшенным содержанием углеводов (0,25—1,5%) и повышенным количеством пептона (1—5%), в присутствии витаминов — тиамина, биотина и инозита, а также аминокислот — лейцина, аргинина, метионина, гистидина и тирозина. Биосинтез рибофлавина стимулируют ацетат аммония и ненасыщенные жирные кислоты, а замедляет железо, поэтому питательную среду предварительно обрабатывают для уменьшения содержания железа до 5—10 мкг на 1 л. В производственных, условиях питательную среду готовят из 1—3% мелассы, гидроля или глюкозы, 3—8% кукурузного экстракта или дрожжевого автолизата, добавляя N, Р205, К, Mg, Zn. Процесс ведут по методу глубинной ферментации при интенсивности аэрации 1,5—2,0 м3/мин воздуха на каждый кубический метр культуральной жидкости и температуре 29—30°С. Ферментация Длится до стадии лизиса мицелия и образования спор. Многочисленными опытами на животных установлена высокая биологическая эффективность как кристаллического препарата витамина В12, так и его кормовых концентратов. В природе витамин В12 синтезируют только микроорганизмы, например Ргоpionibacterium shermanii, метанобразующие бактерии, Bact. Megatherium и др. Для синтеза молекулы витамина В12 в питательной среде должен быть кобальт, а также 5, 6- диметилбензимидазол, который некоторые микроорганизмы синтезируют сами. Для получения медицинского препарата витамина B12 широко используют Propionibacterium freudenreichii или Рг. shermanii, их выращивают по методу глубинной ферментации, на среде, содержащей 1 % гидролизата казеина, 1% пептона, 1,25% лактата натрия, 0,3% дрожжевого экстракта, соли кобальта и 5,6-диметилбензимидазол. В анаэробных условиях ферментация культуры Propionibacterium длится 72 ч при температуре 28—30°С. За это время в культуральной жидкости накапливается 3000—10 000 мкг/л витамина B12. Биосинтез витамина В12 может идти и при аэробных условиях, используя актиномицеты, например Actinomyces olivaceus. В этом случае среду готовят из кукурузного экстракта или барды спиртовой промышленности, гидроля, крахмала, глюкозы, сульфата аммония и солей кобальта. Образование активной формы витамина и в этом случае стимулируют добавки 5,6-диметил-бензимидазола. Для получения кристаллов витамина B12 культуральную жидкость центрифугируют и выделяют содержащую витамин клеточную массу. Затем ее гидролизуют и очищают полученный раствор витамина. Очистку витамина B12 из водных растворов можно провести, обрабатывая раствор: 1) бензиловым спиртом, добавляя к экстракту хлороформ и экстрагируя витамин водой; 2) гидроокисью цинка; 3) смесью крезола и тетрахлоруглерода (1 : 1); 4) хроматографически, пропуская через колонку с А120з и элюируя витамин 50% смесью вода — ацетон. Очищенный раствор витамина кристаллизуют. Получают темно-фиолетовые кристаллы витамина B12 с 75—76%-ной степенью чистоты. Выход витамина составляет 67—70%. Себестоимость витамина, полученного в процессе стерильной ферментации, сравнительно высока, поэтому для нужд животноводства его получают по более простому) методу метанового брожения, используя в качестве сырья отходы пищевой промышленности. Получение липидов. Под липидами в данном случае подразумеваются растворимые в неполярных растворителях клеточные компоненты микроорганизмов. Их концентрация составляет до 75% сухой биомассы. В состав липидов микроорганизмов входит сравнительно много ненасыщенных жирных кислот. Так, в липидах плесневого гриба Penicillium soppii из жирных кислот содержатся пальмитиновая — 22%, стеариновая — 7,6%, олеиновая —45,2% и линолевая — 20% от общего их количества. Соотношение насыщенных и ненасыщенных кислот зависит не только от свойств продуцента, но и от условий культивирования. Низкая температура стимулирует синтез ненасыщенных жирных кислоту грибов. Общее количество и соотношение жирных кислот зависит и от присутствия К, Mg, Na и их соотношения в среде. Синтез липидов стимулируют ингибиторы углеводного обмена, например арсенит натрия. Для производства липидов микробного происхождения может быть использовано дешевое сырье, они в перспективе могут заменить жиры и масла растительного и животного происхождения, используемые для технических нужд. Таким дешевым исходным сырьем являются гидролизаты древесины или торфа, а также продукты нефти. В качестве примера можно привести культивирование дрожжей Lipomyces lipoferus на гидролизатах торфа, нейтрализованных известковым молоком до рН 6,0 и содержащих 1,5% РВ. К среде добавляют дополнительно КН2РО4— 0,1 г/л, MgS04 — 0,04 г/л и СаС12 —0,04 г/л. Содержание азота в гидролизате вполне достаточно для роста культуры. Содержание липидов в биомассе после 4—5 сут выращивания составляет 50% по сухому веществу. В их состав входят 5,0 — 6,0% фосфолипидов, 4,8 — 6,5% стеринов, 2,1 — 10,7% моно- и диглицеридов, 2,3—9,6% свободных жирных кислот, 70,7—75,1% триглицеридов и 1,7—2,1% эфиров стеринов и воска. Липиды выделяют из биомассы экстракцией эфиром. Из 1 т сухого торфа можггЪ получить 40—50 кг липидов. По физико-химическим свойствам они близки к растительным маслам, которые используют во многих отраслях промышленности для технических нужд. Возможно отобрать такие культуры микроорганизмов и создать условия культивирования, чтобы в биомассе накапливалось меньше липидов (15—30%), но больше белков (30—40%)- В этом случае после экстракции липидов получают ценный кормовой препарат — микробный жмых. В последнее время доказано, что микроорганизмы могут выделять липиды из клеток в культуральную жидкость. Культура дрожжей Rhodotorula glutinis выделяет из клеток уксусную (40%), миристиновую (1%), пальмитиновую (14%), стеариновую (1,5%), олеиновую (29%), линолевую (3%), линоленовую (0,5%) и 3-дигидроксигексадекановую (8,5% ) кислоты (данные приведены в процентах к общей массе экстрацеллюлярных липидов). При культивировании Candida bogoriensis в среде образуются игольчатые кристаллы липидов с температурой плавления 74—76°С. Практическая часть 1 метод. Культуру микроорганизмов отделяют центрифугированием. К осадку добавляет при постоянном перемешивании 5 мл ацетона на 1 г осадка. Перемешивание проводят в течение 10-15 мин. Жидкую фракцию отделяют и выпаривают ацетон на водяной бане. В выпарной чашке остаются микробные липиды. Культуру Аspergillus заливают кипящей водой в соотношение 1:5, перемешивают в течение 10 минут и подкисляют раствором соляной кислоты. Жидкую фракцию отделяют центрифугированием. Затем к ней добавляют ацетон в количестве 1 мл на каждый мл жидкости и помещают в морозильную камеру холодильника для выпадения кристаллов ферментов. После этого кристаллы ферментов отделяют декантацией. 2 метод. Засеять питательную среду суспензией спор гриба. Для этого в пробирку с культурой гриба на скошенной агаризованной среде налить стерильную воду до верхнего края косяка. Конидий перевести концом стерильной пипетки во взвешенное состояние и отобрать 1 мл суспензии спор, перенося ее затем в колбу со стерильной средой. После засева среду тщательно перемешать путем встряхивания и пересыпать в стерильную кювету, потом закрыть ее крышкой. Кювета имеет перфорации для воздухообмена. Операции по засеву среды необходимо производить, соблюдая асептические условия, возле пламени спиртовки. Кюветы с засеянной средой поместить в термостат. Выращивание проводить в течение 48…54 ч при температуре 33 °С в течение первых 12 ч роста и 28…30 °С – в последующие. Выросшая культура имеет вид коржа с пушистой поверхностью. Провести экстракцию ферментов из выросшей культуры гриба. Корж тщательно измельчить в кювете с помощью шпателя и на технических весах взвесить 5 г поверхностной культуры. Шпатель обязательно погрузить в дезинфецирующий раствор. Взвешенную порцию поместить в фарфоровую ступку и тщательно растереть пестиком со 100 мл забуференной дистиллированной воды, которую получают смешивая 10 мл ацетатного буфера (рН 4,7) и 90 мл дистиллированной воды. После чего поместить в термостат на 30 мин при 30 °С. По истечению времени экстракции содержимое фарфоровых ступок перенести на капроновый фильтр и хорошо отжать для отделения экстракта от биошрота (остатков питательной среды и мицелия). Осветлить полученный экстракт (вытяжку) путем центрифугирования. Для этого мерным цилиндром отмерить 25 мл фильтрата и перенести в центрифужные стаканчики, которые устанавливают на роторе центрифуги попарно напротив друг друга. Центрифугирование длится 5 мин при 3 тыс. оборотах. Осветленный экстракт слить в колбу для дальнейшего анализа. Определить амилолитическую способность (АС) экстракта, используя капельный метод (по Климовскому и Родзевич). В основе метода лежит способность фермента амилазы, находящегося в вытяжке, катализировать гидролиз крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов. Для определения АС важно строго соблюдать температурные условия реакции. Для этого все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до 30 °С в ультратермостате в течение 10 мин. В широкую пробирку залить 25 мл раствора крахмала. Не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавить воду, а затем вытяжку от 1 до 25 см3. Общий объем реакционной смеси должен составлять 50 см3. Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять. Содержимое в пробирке перемешать палочкой и отметить время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала: • каждые 60 с из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирать палочкой каплю пробы; • каплю помещать на белую фарфоровую пластину, соединяя эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдать окраску; • реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 с; • изменение окраски йода отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси. Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах 10…20 мин. Если время гидролиза крахмала менее 10 мин, то определение повторяют, уменьшая объем вытяжки, а увеличивая объем воды. Если гидролиз крахмала не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, увеличивая объем ферментной вытяжки и уменьшая объем воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза. Вопросы для самоконтроля:
Лабораторная работа № 12 |