МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Тема: Исследование хлебопекарных дрожжей. Цель работы: Знать основные расы хлебопекарных дрожжей. Уметь проводить микробиологический контроль хлебопекарных дрожжей. Задание:
Материалы и оборудование: Бактериологические петли, пастеровские пипетки (стерильные), предметные стекла, набор растворов красок для окраски по Грамму, фильтровальная бумага, микроскопы; пробирки с питательными средами, спиртовые или газовые горелки, хлебопекарные дрожжи. Теоретическая часть. В производстве хлебопекарных дрожжей используют специально отобранные расы Sacch. cerevisiae. При отборе культуры принимают во внимание способность дрожжей сбраживать тесто, т. е. они должны обладать хорошей подъемной силой и ферментативной активностью, хорошо расти на мелассной среде в условиях глубинной ферментации и давать высокий выход биомассы. Клетки дрожжей должны легко отделяться от культуральной жидкости сепарированием или фильтрацией и хорошо сохраняться в прессованном виде. Подъемную силу дрожжей выражают в минутах, в течение которых определенное количество дрожжей развиваясь в определенном количестве теста, увеличивает его объем на предусмотренную стандартом величину. Для хороших дрожжей подъемная сила не должна превышать 75 мин, зимазная активность — 30—40 мин, мальтазная активность — 50— 80 мин. Зимазную и мальтазную активность определяют по методу Елецкого, в основе которого лежит выделение определенного объема газа в сахарозной и мальтозной среде. Хлебопекарные дрожжи обладают и бродильной активностью, но чтобы достигнуть использования сахаров только для образования биомассы, спиртовое брожение надо ограничить всеми доступными средствами. Это достигается интенсивной аэрацией среды, а также поддержанием низкой концентрации сахара в ней (0,5—1,5%). При высокой концентрации Сахаров имеет место катаболитная репрессия ферментов цикла Кребса и переключение энергетического метаболизма преимущественно на брожение. Чтобы избежать этого, сахар в среду подают непрерывно с постоянной или возрастающей скоростью притока. Чтобы предотвратить чрезмерное размножение побочной микрофлоры, особенно так называемых диких дрожжей, удельная скорость роста которых выше, чем у хлебопекарных дрожжей, процесс ферментации обычно ведут по периодической схеме в течение 10—20 ч. Технология получения дрожжей имеет много различных вариантов. В размножении культуры дрожжей различают следующие стадии: лабораторную; чистой культуры; естественно чистой культуры; товарных дрожжей. В лаборатории размножение дрожжевой культуры идет через три этапа в 10—12%-ной солодовой среде при использовании колб на 100, 1000, 8000 мл, в которых выращивание дрожжей длится по 24 ч. Границы оптимальной температуры 28—32°С, реакция среды рН 4,5—5,5. Для ограничения бактериальной инфекции в начальных стадиях стараются использовать более низкую реакцию среды — рН 4,3—4,6. Допускается также спиртовое брожение. В стадии чистой культуры (ЧК) Дрожжи размножаются в двух герметических аппаратах на 12%-ной мелассной среде, обогащенной солодовым экстрактом и двузамещенным фосфатом аммония: Емкость первого аппарата 80—100 л, второго —800— 820 л. Среда периодически аэрируется. Длительность ферментации 10—20 ч. Получают 2—4 кг дрожжей в пересчете на сухое вещество. В следующей стадии естественно чистой культуры (ЕЧК) получают посевной материал на 7—8%-ной мелассной среде в условиях непрерывной, на первых стадиях менее интенсивной аэрации, а в конце на единицу объема жидкости за 1 мин вводят уже единицу объема воздуха. На последних стадиях дрожжи сепарируют и прессуют. Полученный посевной материал, который называют технической чистой культурой, хранят при 4°С и используют в качестве посевного материала при производстве товарных дрожжей. С целью улучшения качества товарных дрожжей, уменьшения количества сопутствующей бактериальной микрофлоры желательно ЕЧК перед засевом подвергнуть кислотной обработке. Для этого прессованную ЕЧК суспендируют в воде (1:1) и добавляют 100%-ную молочную кислоту в количестве 2% от массы дрожжей, перемешивают и выдерживают 1 Ч. Для этих же целей можно использовать фуразолидон (0,05% к объему дрожжевой суспензии) при выдержке в течение 1 ч. Товарные дрожжи обычно получают в три этапа. Сначала размножают первый посевной материал (задаточные дрожжи), затем вторые задаточные дрожжи и из них получают товарные дрожжи. Получение первых задаточных дрожжей идет без притока среды; длительность процесса 6—7 ч. На втором этапе стремятся полностью исключить спиртовое брожение, поэтому дрожжи выращивают в условиях очень интенсивной аэрации, лимитируя концентрацию сахара в среде, по проточному методу культивирования. Чаще всего длительность этого этапа 10—12 ч. Последний этап производства товарных дрожжей длится 10— 24 ч. Практическая часть
Степень загрязнения ЧК и ЕЧК посторонними дрожжами определяют на элективной среде — ацетатной, непригодной для размножения производственных дрожжей-сахаромицетов. Исследуемый материал (1—2 капли) из аппарата или комочек прессованных дрожжей ЧК или ЕЧК (около 0,5 г) стерильно вносят в пробирку с ацетатной средой, помещают в термостат при 30 °С и ведут ежедневные наблюдения. Появление пленки на поверхности среды или помутнения через 5 и более суток дает основание считать, что культура чистая, не содержит посторонних дрожжей. Если пленка образовалась через 3—4 дня, дрожжи ЧК или ЕЧК удовлетворительные. Появление пленки через 1—2 сут свидетельствует о неудовлетворительном качестве дрожжей ЧК или ЕЧК и их непригодности в качестве засевных. при работе по удлиненным схемам.
Для определения количества бактерий в пробах, содержащих дрожжи, Розмановой Н. В. предложен метод высева на среды с антибиотиком нистатином. Нистатин подавляет рост дрожжей и грибов в концентрации 40—60 ед. на 1 мл среды. Водно-спиртовой (1:1) раствор нистатина готовят с таким расчетом, чтобы в 1мл его содержалась фунгицидная концентрация, достаточная для подавления дрожжей. В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл раствора нистатина, заливают расплавленную и охлажденную до 43—450С среду и хорошо перемешивают. Далее все операции проводят как обычно при высеве проб на плотные питательные среды. Активность нистатина в процессе хранения снижается, поэтому при появлении на средах слабого роста дрожжей количество вносимого в чашки нистатина увеличивают б 2—3 paза. 3. Определить процентное содержание сахаромицетов и посторонних микроорганизмов Микроскопирование. При микроскопировании оценивают качество дрожжей — по величине и однородности клеток—сахаромицетов и наличию посторонних микроорганизмов. В нескольких миллилитрах стерильной воды размешивают петлю дрожжей. Каплю полученной суспензии смешивают на предметном стекле с метиленовым синим. Просматривают несколько полей зрения, определяя морфологическое состояние дрожжевых клеток, процент мертвых клеток, несовершенные дрожжи и бактерии. Определение процентного содержания сахаромицетов и посторонних микроорганизмов. Если подъемная сила или стойкость готовой продукции резко ухудшились, микробиологический состав прессованных дрожжей и степень их заражения посторонними дрожжами и бактериями определяют упрощенным методом — посевом на сусло-агар с мелом или усложненным методом на несколько элективных питательных сред для выявления количества клеток вредных микроорганизмов и распределения их по группам. Присутствие Bacillus subtilis можно определить следующим образом: пробирку с 2 мл взвеси дрожжей (из I разведения) помещают на 20—30 мин в кипящую воду, прибавляют 5 мл стерильного солодового сусла и ставят в термостат при 37 °С на одни-двое суток. При наличии данных бактерий появляется типичная морщинистая пленка. При исследовании дрожжей на присутствие Proteus vulgaris производят посев капли I и II разведения в конденсационную воду скошенного агара. Через 24—48 ч роста при 37 °С Proteus vulgaris обнаруживают по тонкому бактериальному налету, поднимающемуся по стенке пробирки. В доброкачественных прессованных дрожжах допускается присутствие посторонних дрожжей не более 30 %, кислотообразующих бактерий — не более 15—35%, гнилостных бактерий не должно быть. 4. Качество прессованных дрожжей. Товарные прессованные дрожжи относятся к скоропортящимся продуктам. Согласно ГОСТу готовые дрожжи должны иметь сероватый цвет с желтоватым оттенком, без пятен, плотную, не мажущуюся консистенцию, специфический дрожжевой запах, без плесневого и других посторонних запахов, свойственный прессованным дрожжам вкус; влажность — не более 75 %, подъем теста до 70 мм — не более 75 мин; кислотность 100 г дрожжей в день выработки — не более 120 мг, после 12 суток хранения при температуре от 0 до 4°С — не более 360 мг в пересчете на уксусную кислоту; стойкость —не менее 48 ч при температуре хранения 5 °С и 10 сут при температуре хранения от 0 до 4°С; мальтазная активность — 60—90 мин, зимазная — 50—60 мин при определении газометрическим способом. Вопросы для самоконтроля
Лабораторная работа № 10 Тема: Методы получения аминокислот из микробной массы. Цель работы: Иметь представление о технике выделения из микробной массы аминокислот. Задание:
Материалы и оборудование: Каждому студенту – пробирку с жидкой питательной средой с культурой Bac. subtilis или Bac. Mesentericus, центрифуга, раствор серной кислоты, 25 % раствор сульфита натрия, кипящая водяная баня, шкаф сушильный, выпарные чашки, мерные пипетки, жидкая среда с культурой аспергилла, сухой порошок гидроксида кальция, 20% раствор серной кислоты, фильтр бумажный, бумаги индикаторные. Теоретическая часть. В состав природных белков обычно входят следующие аминокислоты: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глицин, глутаминовая кислота, гистидин, глутамин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, оксипролин, пролин, серии, тирозин, треонин, триптофан и валин. Восемь аминокислот организм животных не может синтезировать, поэтому их называют биологически незаменимыми аминокислотами. К ним относятся фенилаланин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и валин. Эти аминокислоты должны регулярно и в нужном количестве поступать в организм вместе с пищевыми продуктами. Недостаток одной из этих аминокислот в пище может стать фактором, лимитирующим рост и развитие организма. В растительных продуктах, составляющих основу питания человека и животных, в недостаточном количестве может быть лизин, метионин и иногда триптофан. Препараты этих аминокислот имеют большое значение в формировании правильного питания человека и в сбалансированности кормов для домашних животных. В пищевой промышленности и кулинарии многих стран в качестве специи используется натриевая соль глутаминовой кислоты, придающая ощущение сытости. Сейчас во всем мире в больших количествах получают глутаминовую кислоту или ее натриевую соль (около 100 ООО т в год), L-лизин и метионин (по 50 000 т в год). Большую часть этого количества дает микробиологический синтез (за исключением получения метионина). Для биосинтеза используют ауксотрофные мутанты, т. е. бактерии, которые под влиянием мутагенных факторов (облучение, химическое воздействие и др.), утратили способность самостоятельно синтезировать какую-нибудь необходимую для роста и развития аминокислоту, например гомосерин, а с другой стороны, приобрели способность к сверхсинтезу другой аминокислоты. Это значит, что для роста и размножения таких бактерий в среде должны содержаться определенные аминокислоты — гомосерин, треонин или метионин и т. д. Очень часто этим мутантам необходим и биотин. Такие бактерии называют гомосериндефицитными или биотиндефицитными. В то же время эти мутанты обладают способностью в большом количестве синтезировать другую аминокислоту — лизин или глутаминовую кислоту и выделять их в окружающую среду. Мутагенные факторы могут изменить нормальный биосинтез аминокислот в клетке, воздействуя на генетический аппарат. Если в результате облучения или воздействия химических факторов ДНК не дает информацию для синтеза фермента и в клетке не синтезируется, например фермент гомосериндегидрогеназа, катализирующий превращение полуальдегида аспарагиновой кислоты в гомосерин, то клетка может синтезировать необходимые для своего существования белки только в том случае, если в питательной среде уже содержится готовый гомосерин. Так как аспарагиновая кислота является исходным пунктом биосинтеза не только гомосерина, но и треонина, изолейцина, метионина, а также лизина, то отсутствие упомянутого фермента влияет на биосинтез всех этих аминокислот. Прекращение биосинтеза гомосерина одновременно прекращает биосинтез треонина, изолейцина и метионина, поэтому эти аминокислоты также должны содержаться в среде роста данной культуры. В данных условиях весь ход биосинтеза аминокислот в клетке идет в направлении от аспарагиновой кислоты к лизину. В результате изучения ауксотрофных мутантов выяснено, что продуценты орнитина являются аргинин- или цитруллиндефицитными; продуценты гомосерина или диаминопимелиновой кислоты треониндефицитными; продуценты изолейцина — лизин-дефицитными; продуценты тирозина — фенилаланиндефицитными. Иногда встречаемые природе бактерии способны в процессе роста накопить в среде до 2—5 г/л свободных аминокислот, но ауксотрофные мутанты продуцируют их в значительно больших количествах — 20—100 г/л. Еще 50 лет назад ученые Осборн и Мендель доказали, что в белке пшеницы мало лизина. В настоящее время установлено, что лизин в организме является не только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций — является предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и стронция в клетки и др. В настоящее время во многих странах препарат лизина добавляют к хлебу для повышения его биологической ценности, а также для улучшения внешнего вида. Доказано, что лизин улучшает аппетит, способствует секреции пищеварительных ферментов, предотвращает кариес зубов у детей. Лизин является самой дефицитной в кормах животных незаменимой аминокислотой. Установлено, что добавка лизина в количестве 0,1—0,4% к кормам значительно увеличивает продуктивность домашних животных. Для биосинтеза лизина используют гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др. Активный продуцент лизина Brevibacterium sp. 22 получен в Институте биохимии им. А. Баха АН СССР под руководством В. Букина. Продуценты лизина культивируются на средах, содержащих углеводы или уксусную кислоту, источники азота и кислород. В клетках бактерий лизин синтезируется из пировиноградной, аспарагиновой и янтарной кислот по схеме, показанной при получении лизина необходимо исключить нежелательные побочные процессы. Так, при недостаточной аэрации может идти образование аланина или молочной кислоты вместо синтеза лизина. Очень важным фактором является концентрация дефицитных аминокислот — гомосерина, метионина и треонина. Для нормального роста и биосинтеза лизина культурой Brevibacterium sp. 22 оптимальной считается концентрация треонина в 800 мг, метионина — 200 мг на литр питательной среды. Кроме того, для развития культуры необходим тиамин в концентрации 200 мкг на 1 л среды. Важным регулятором процесса является биотин. Одна и та же культура Brevibacterium sp. 22 при концентрации биотина в среде, равной 1—4 мкг/л, продуцирует глутаминовую кислоту, а при концентрации 15—20 мкг/л — лизин. Считают, что биотин изменяет проницаемость клеточной оболочки. При концентрации биотина 2,5 мг/л стимулируется также образование молочной кислоты. Важную роль играет треонин, являясь обязательным фактором роста на начальном этапе ферментации. Однако концентрация его не должна быть большой, так как на дальнейших этапах ферментации (при синтезе лизина) он может действовать как ингибитор фермента аспартаткиназы. Присутствие лизина усиливает ингибирующие свойства треонина. Среду для получения лизина готовят из мелассы (7—12% сахара), кукурузного экстракта (1—2%), солей аммония (1 — 2%), одно- и двузамещенного фосфата калия (по 0,05%). В Институте микробиологии им. А. Кирхенштейна было показано, что кукурузный экстракт можно заменить концентратом клеточного сока картофеля (побочный продукт при производстве крахмала), дрожжевым гидролизатом или вытяжкой из пшеничных отрубей. После стерилизации такую среду используют для выращивания посевного материала, а также и для главной ферментации. Сначала культуру размножают на качалке в колбах, затем в ферментаторах объемом 100 и 3000 л. Количество посевного материала 5—10%, оптимальная температура 30—33°С, рН 7,4. Длительность ферментации посевного материала на каждой стадии около 24 ч. Главная ферментация идет 50—70 ч при аналогичных режимах. Концентрация лизина в растворе достигает 20—40 г/л, а выход по сахару — 25—35%. Концентрация клеточной биомассы 10—15 г/л (по сухой массе). Проточная культура обладает повышенной лизин-синтезирующей способностью (на 20—25% выше по сравнению с периодической), поэтому рациональной является комбинированная технология получения лизина: непрерывная ферментация на стадии приготовления посевного материала и периодический процесс главной ферментации. При наличии хорошо герметизированной и автоматически управляемой ферментационной аппаратуры можно осуществить трехступенчатый процесс, который обеспечивает 20— 30 г/л лизина при выходе культуральной жидкости из третьего аппарата (табл. 16). Высокую концентрацию лизина (до 60 г/л) в культуральной жидкости можно получить на мелассной среде, если во время ферментации вести подкормку путем дробной подачи части питательной среды при соблюдении точной регуляции культивирования. Мелассу можно заменить на сахарозу, диффузионный сок сахарной свеклы, глюкозу или гидролизаты крахмала, древесины, торфа, а также на уксусную кислоту.Для получения кристаллического лизина клеточную массу центрифугируют, а культуральную жидкость пропускают через катионит КУ-2 или КВ-4-Р-2. Лизин элюируют 2,0—3,5%-ным раствором NH4OH, элюат упаривают в вакууме при температуре 60°С до V20—7зо части исходного объема. Затем при помощи НС1 устанавливают рН 4,5—5,0, охлаждают до 14—18°С и кристаллизуют. Фильтрацией или центрифугированием кристаллов получают технический лизин, содержащий 94—96% лизина монохлоргидрата. Для получения чистого лизина кристаллы технического лизина в небольшом количестве воды нагревают до 70°С, добавляют активированный уголь, перемешивают и фильтруют. При помощи НС1 устанавливают рН 4,9, раствор упаривают и кристаллизуют. Кристаллы сушат при температуре 60°С. Полученный таким образом лизин содержит 99,9% лизина монохлоргидрата, 0,1% золы и не более 0,001% тяжелых металлов. После отделения лизина из фильтрата еще выделяют бетаин, используемый в медицине (препарат асидин), а также в животноводстве. Для кормовых нужд на Ливанском опытном биохимическом заводе (Латвийская ССР) получают концентрат лизина. В соответствии с методом, разработанным в Институте биохимии им. А. Баха АН СССР совместно с Институтом микробиологии им. А. Кирхенштейна АН ЛатвССР, после ферментации культуральную жидкость подкисляют до рН 5,0—6,0, добавляют для стабилизации 0,15%-ный раствор бисульфита натрия и выпаривают в вакуум-аппаратах до 40—50%-ного содержания сухих веществ. Полученный жидкий концентрат лизина (ЖКЛ) можно использовать для обогащения кормов. При высушивании жидкого концентрата лизина в распылительных сушилках (температура поступающего воздуха 300°С, выходящего — 90—100°С) до влажности 5—6% получают сухой кормовой концентрат лизина (ККЛ). Термическое обезвоживание продуктов ферментации лизина может вызвать связывание лизина с редуцирующими сахарами среды. При соединении глюкозы или других соединений, содержащих карбонильные группы, с е-аминогруппой лизина, он переходит в форму, не усвояемую организмом. Поэтому надо следить, чтобы в процессе ферментации были полностью использованы все редуцирующие вещества, рН раствора лизина перед высушиванием и упариванием должен быть кислым, необходимо также стабилизировать среду сульфитом натрия или гексаметафосфатом натрия. Сухой ККЛ очень гигроскопичен, поэтому сразу после сушки его упаковывают в полиэтилен - бумажные мешки. Менее гигроскопичный и сыпучий концентрат получают, высушивая лизин вместе с наполнителями — костяной мукой, кормовыми дрожжами, пшеничными отрубями и др. Гигроскопичность снижается, если оставшиеся в культуральной жидкости сахара и органические кислоты усваивают специальные культуры дрожжей в процессе дображивания. Биологическая и зоотехническая проверки показали, что по биологическим свойствам концентрат лизина ценнее, чем кристаллический лизин. Производство ККЛ почти в 2 раза дешевле производства кристаллического лизина, кроме того, легче очищаются сточные воды. Учитывая содержание ряда биологически активных веществ в концентрате лизина, а также его стабилизирующие свойства, выгодно на основе жидкого концентрата лизина и сухого концентрата лизина с наполнителем готовить витаминно-аминокислотные премиксы. Сухой премикс получают на основе ККЛ с отрубями путем добавления предусмотренного соответствующей рецептурой количества витаминов и других биологически активных веществ. При этом учитывается не только собственно лизин ККЛ, но также бетаин и рибофлавин. Лизин можно получать, работая по двухступенчатому методу. На первой ступени при помощи микробиологического синтеза (аналогичного биосинтезу лизина) или химического синтеза (из толуола, керосина и др.) получают а, е-диаминопимелиновую кислоту. На второй ступени проводят ферментативное декарбоксилирование а, е-диаминопимелиновой кислоты. Практическая часть 1. Выделение аминокислот из микробной массы. 1 метод. Отделяют микробную массу от питательной среды, сливают жидкую фракцию в выпарную чашку и концентрируют выпариванием до половины объема. После этого подкисляют концентрат раствором соляной кислоты (0,2-0,4 мл раствора на 1 мл концентрата). В этот момент происходит выпадение кристаллов глутаминовой кислоты или лизина. Кристаллы отделяют декантированием, растворяют кипящей водой в соотношение 1:5, повторно кристаллизируют и сушат выпариванием. 2 метод. На лабораторной работе группа студентов делится на две бригады, первая бригада выделяет белок из муки злаковых культур, вторая – из измельченных бобовых культур. Для создания лучших условий экстрагирования белков необходимо просеять муку, выделяя фракцию с размером частиц не более 100 мкм, и отбрасывая оболочки и более крупные частицы, богатые крахмалом. Взвесить в химическом стакане навеску муки массой 10 г, постепенно прилить к ней 60 мл 10 % (NH4)2SO4. Суспензию настаивать 10…15 мин для растворения белков. Содержимое стакана разлить поровну в две центрифужные пробирки. Разделить суспензию на центрифуге при скорости вращения ротора 500 об/мин и продолжительности процесса центрифугирования 10 мин. Фугат собрать в чистый химический стакан и определить с помощью биуретового метода Яроша концентрацию белка. Для этого в пробирку объемом 20 мл прилить 2,4 мл раствора мочевины, 0,1 мл фугата и 2,5 мл биуретового реактива. Записать время внесения биуретового реактива. Смесь хорошо перемешать и поместить в водяную баню с температурой 40 °С на 10 мин. Затем охладить ее до 20 °С под струей холодной воды или на воздухе. Через 30 минут после внесения биуретового реактива определить оптическую плотность раствора, пользуясь кюветами № 5 и светофильтром № 6 ФЭК-56. Количество белка определить по предварительно построенной калибровочной кривой. В три пробирки объемом 20 мл налить по 5 мл фугата и провести экстракцию белков раствором сульфата алюминия разной концентрации. В первую пробирку добавить 5 мл 0,5 % Al2(SO4)3 c температурой 3…5 °С, во вторую – 5 мл 2,5 % Al2(SO4)3 c температурой 3…5 °С, в третью – 5 мл 5 % Al2(SO4)3 c температурой 3…5 °С. Содержимое каждой из пробирок тщательно перемешать и провести высаливание белков при температуре 3…5 °С (в холодильнике) в течение 15 мин. Образовавшийся осадок отделить фильтрованием через складчатый фильтр. В фильтрате определить количество белка с помощью биуретового метода Яроша в соответствии с пунктами 5 и 6. Рассчитать коэффициент извлечения белка  где сн – концентрация белка в фугате, г/л; ск – концентрация белка в фильтрате, г/л. Полученные экспериментальные данные и результаты расчетов внести в табл. 1. Таблица 1. Экспериментальные данные и результаты расчетов выделения белков из белоксодержащих продуктов
Построить график зависимости концентрации остаточного белка от концентрации экстрагента и сравнить эффективность выделения белка из различного сырья. Вопросы для самоконтроля:
Лабораторная работа № 11 | ||||||||||||||||||||||||||||