МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Тема: Методы посева и культивирование продуцентов. Цель работы: Дать студентам представление о способах культивирования продуцентов, как самостоятельного разряда микроорганизмов, Ознакомить студентов с поверхностными и глубинными способами посева микроорганизмов, аэробными и анаэробными методами культивирования. Научится проводить посев на плотные и жидкие питательные среды. Задание:
- на скошенный мясо-пептонный агар; - уколом в столбик питательной среды; - петлей на среду в чашку Петри; - шпателем или тампоном на среду в чашку Петри; - в толщу питательной среды.
Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; насос Камовского, эксикатор, анаэростат, карандаши по стеклу. Теоретическая часть. Для выделения культуры микробов из исследуемого материала (молока, мяса, воды, почвы и т. д.) в лабораторных условиях используют метод посева и пересева. Посевом называется внесение части исследуемого мате    риала в чистую, стерильную питательную среду, пересевом— перенос части выросшей на питательной среде культуры микробов на другую, свежую стерильную питательную среду (рис. 1).П о с е в на плотнуюпитательнуюсреду. Техника посева зависит от консистенции питательной среды, на которой желают вырастить культуру микробов. Посев производят с помощью бактериологический петли и иглы или пипетки Пастера.  Рис. 1. Пересев из одной пробирки в другую С целью предупреждения загрязнения среды микрофлорой воздуха пробирки держат наклонно над пламенем горелки или спиртовки. Далее поступают следующим образом: 1) в левую руку берут пробирку с микробной культурой и пробирку со стерильной питательной средой и держат в наклонном положении между большим и указательным пальцем; в правой руке держат петледержатель в вертикальном положении над пламенем горелки, прокаливают петлю до появления красного цвета, затем наклоняют горизонтально и 2—3 раза быстро проводят через пламя петледержатель; 2) взяв мизинцем и безымянным пальцами правой руки наружный конец ватной пробки, вынимают около пламени пробку из пробирки, после чего обжигают края обеих пробирок. Следят за тем, чтобы пробки ни к чему не прикасались; 3) вводят петлю в пробирку с микробной культурой. Для охлаждения петли нужно сначала прикоснуться к поверхности агара, где нет культуры, после чего осторожно снимают небольшое количество культуры или каплю жидкости (если среда жидкая) и быстро переносят (не прикасаясь к стенкам пробирки!) во вторую пробирку со стерильной питательной средой; петлю опускают до конденсационной воды, находящейся на дне пробирок со свежими средами, и делают посев культуры одним из трех способов: посев штрихом — проводят зигзагообразную линию, свободно скользя петлей по поверхности среды от одного края пробирки к другому; посев чертой — проводят петлю по прямой линии посредине поверхности питательной среды; посев сплошной — растирают материал непрерывными круговыми движениями по всей поверхности питательной среды; 4) вынимают петлю, обжигают края пробирок и внутренние концы пробок (если пробки загораются, дуть на них ни в коем случае нельзя); следует быстро ввести их в пробирки, наружный конец гасят рукой или пинцетом; 5) прокаливают петлю на пламени и ставят ее на место; 6) па пробирке карандашом или чернилами по стеклу ставят дату посева, название культуры микроба. В столбики МПЖ или МПА сеют уколом (рис. 2). С этой целью стерильной иглой с набранным на нее материалом прокалывают столбик агара или желатин в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подходила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки, иглу извлекают, обжигают на пламени спиртовки до красного каления (убивают оставшихся на петле микробов), после чего край пробирки еще раз обжигают на огне, проводят через пламя пробку и закрывают пробирку. Край пробирки во время посева держат, не отнимая, около огня, фиксируя левую руку в этом положении упором о край стола. Бактериологическую петлю помещают в штатив, а пробирку, отметив на ней номер экспертизы, дату посева и место, откуда был взят материал, помещают в термостат. Посев в жидкую среду. При посеве в жидкую питательную среду стерильную бактериологическую петлю с набранным на нее материалом вносят в пробирку с соблюдением всех предосторожностей, описанных выше. Материал тщательно растирают по стенке пробирки у верхнего края среды, все время смывая его средой. При посеве пастеровской (рис. 3) пипеткой поверхность обжигают на пламени спиртовки, охлаждают, отнеся в сторону от огня, затем обломав стерильным пинцетом запаянный конец, набирают в нее материал, быстро вносят в пробирку и производят посев так же, как это делают петлей, соблюдая правила стерильности.  Рис. 2 Посев уколом Рис. 3. Пользование пипеткой Пастера После использования пипетки ее помещают в сосуд с дезинфицирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты или др.). Методы культивирования анаэробов. Для культивирования анаэробов на искусственных питательных средах требуется поддерживать в среде анаэробные условия не только в момент посева, но и в период их роста. Для создания анаэробных условий применяют физический, химический, биологический и комбинированный методы. Физический метод. В жидких питательных средах (Китт- Тароцци) анаэробные условия создаются путем: а) удаления поглощенного средой кислорода кипячением в течение 10—15 мин с последующим быстрым охлаждением под струей холодной воды, после чего тотчас же производят посев и помещают в термостат; б) заливки поверхности жидкости слоем индифферентного масла (вазелинового, парафинового), прекращающим доступ в среду атмосферного воздуха; в) разливка среды в узкие пробирки высоким столбиком;  Рис. 4. Культура анаэробов в чашках Петри, помещенных в эксикатор, соединенный с масляным насосом г) добавления к жидким средам до их стерилизации кусочков печени, мышц, картофеля, яичного белка, а, также углеводов (глюкозы и др.), расщепляемых анаэробами в процессе размножения. Анаэробные условия создаются путем удаления воздуха из анаэростатов или эксикаторов (рис. 4) или замене его каким-либо индифферентным газом (водородом, углекислым газом, азотом). Снижения давления воздуха в эксикаторах и анаэростатах до 0,0001 МПа (1 мм рт. ст.) путем выкачивания его при помощи вакуум-насоса под контролем ртутного манометра достаточно для выращивания строгих анаэробов. На дно эксикатора для поглощения избытка влаги помещают 20—30 г сухой поваренной соли или 5—6 г хлористого кальция. Анаэростат представляет собой металлический Цилиндр с герметически закрывающейся крышкой и краном, посредством которого он присоединяется к насосу. После выкачивания воздуха кран закрывают, и анаэростат помещают в термостат. Атмосферный воздух из герметически закрытых сосудов часто вытесняют каким-либо другим, индифферентным газом (например, водородом или азотом).Химическийметод. Химический метод основа на химической реакции, протекающей в герметически замкнутом сосуде, где происходит связывание свободного кислорода воздуха.  Рис. 5. Прибор Аристовского Для этого используют пирогаллол и щелочь или гидросульфат натрия и углекислый натрий. Посевы в пробирках и чашках Петри помещают в эксикатор или аппарат Аристовского (рис. 5), на дно которого помещают открытую чашку Петри, насыпают углекислый натрий и гидросульфит натрия. Смесь слегка увлажняют водой и перемешивают; эксикатор герметически закрывают и помещают в термостат. В результате химической реакции происходит поглощение кислорода и создаются анаэробные условия. Биологическийметод. Биологический метод предусматривает совместное культивирование аэробов и анаэробов. В герметически закрывающийся сосуд помещают пробирки с посевом анаэробов и аэробов из расчета 10—15 пробирок с посевами аэробов на 1 пробирку анаэробов. Сосуд герметически закрывают и помещают в термостат. Аэробы при своем росте поглощают кислород и тем самым создают условия для роста анаэробов. Комбинированныйметод. Метод заключается в комбинировании для создания анаэробных условий физического метода с химическим или биологическим, а также химического метода с биологическим. Практическая часть
Берут петлю, обжигают ее в пламени спиртовки вводят в емкость, в которой находятся микроорганизмы, затем охлаждают и берут материал для посева. Если материал для посева жидкий, то его набирают в стерильную пастеровскую или градуированную пипетку. Петлю и пипетку держат тремя пальцами правой руки (большим, указательным и средним). В левую руку берут пробирку с жидкой питательной средой и открывают пробку пальцами правой руки, прижав ее мизинцем к ладони или держа между указательным пальцем и мизинцем. Осторожно вводят петлю или пипетку в пробирку с питательной средой и погружают в нее. Если материал вязкий и с петли не снимается, его растирают на стенке сосуда, а затем смывают жидкой средой. Из пипетки материал для посева вливают. После проведения посева пробирку закрывают пробкой, которую в течение всего посева держат в руке, и содержимое тщательно перемешивают, осторожно встряхивая, чтобы не замочить пробку, или вращая сначала в одну сторону, затем в другую сторону. При посевах культур, растущих в виде поверхностной пленки, последнюю очень осторожно снимают и опускают на поверхность свежей питательной среды, не давая погрузиться вглубь. Полученные посевы термостатируют в течение 24 часов при температуре 37ºC.
В правой руке, как писчее перо, держат петлю, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку держат между большим и указательным пальцами левой руки так, чтобы ее основание находилось на поверхности кисти. Посев осуществляют под контролем глаз. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки вынимают из пробирки пробку, держа ее за наружный конец, не прикасаясь к части пробки, которая входит внутрь пробирки. Пробку вынимают над пламенем горелки, после чего обжигают ее края. Нужно следить за тем, чтобы пробка ни к чему не прикасалась. Затем вводят петлю с материалом для посева в пробирку до дна и делают посев или на поверхность питательной среды, или в конденсационную воду. Пересев культуры из одной пробирки в другую осуществляется аналогично. Только в левую руку берут сразу две пробирки, а затем правой рукой (мизинцем и безымянным пальцем) вынимают сразу две пробки. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
При проведении посева на поверхность плотной питательной среды в чашку Петри чашка стоит на столе. Левой рукой приоткрывают ее крышку с одной стороны так, чтобы в щель могла пройти петля, на которой находится материал для посева. Небольшое количество исследуемого материала втирают бактериальной петлей в поверхность питательной среды. Посев делают одним из трех способов: штрихом, чертой, сплошной. Затем петлю вынимают из чашки Петри и закрывают ее. Прокаливают петлю в пламени горелки и ставят ее на место. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
Материал, засеваемый в толщу питательной среды, должен быть в жидком состоянии. Для этого из материала, подлежащего посеву, готовят взвесь (в стерильной воде или физиологическом растворе), затем набирают ее в стерильную пипетку в объеме 0,1; 0,5 или 1 мл (в зависимости от предполагаемого микробного загрязнения) и выливают в пустую стерильную чашку Петри. После этого чашку заливают мясо-пептонным агаром (10-15 мл), предварительно расплавленным и остуженным до 40-45 ºC (если приложить колбу со средой к руке, то она не должна вызывать ощущения ожога, т.е. рука не должна отдергиваться). Для равномерного распределения материала в среде чашку Петри прижимают за крышку к столу и делают круговые вращения, следя за тем, чтобы содержимое не попало на крышку. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
Посев уколом в столбик делается иглой. В правой руке, как писчее перо, держат иглу, предварительно прокаленную в пламени горелки и охлажденную, с взятым для посева материалом. Пробирку с питательной средой (мясо-пептонный агар, желатин и др.), застывшей в виде столбика, берут в левую руку, открывают пробку (как указано выше) и в центр среды до дна пробирки вкалывают иглу с находящимся на ней материалом. Полученные посевы термостатируют 24 часа при температуре 37ºC.
При помощи петли исследуемый материал вносят на поверхность питательной среды у края чашки Петри, а затем шпателем или тампоном распределяют его равномерно по всей поверхности агара. При большом количестве бактерии растут в виде пленки, покрывающей всю поверхность питательной среды. Такой характер микробного роста получил название сплошного, или газонного. Посев газоном производят в том случае, когда нужно получить большое количество микробной культуры одного вида.
Характер роста колоний изучают при помощи лупы или при малом увеличении микроскопа. Для микроскопирования колоний чашку Петри с агаровой культурой помещают дном вверх на предметный столик микроскопа, рассматривают и делают описание колоний.
При описании роста микробов на МПБ указывают: - на характер помутнения; - образование пленки на поверхности среды (тонкая, толстая, морщинистая, складчатая, слизистая и т.д.); - количество, характер и цвет осадка (точечный, обильный, зернистый, слизистый, хлопьевидный, серый, беловато-желтый и т.д.); - наличие пристеночного кольца и его характер: узкое, широкое, тонкое, узловатое, серой, синеватое и т.д. Для анаэробов отмечают еще и наличие газообразования.
Рост на плотных средах может быть сплошным или в виде отдельных колоний, обильным, слабым или умеренным. При описании роста колоний обращают внимание на следующие факторы: - форму (круглая, овальная, неправильная, звездчатая и др.); - размер (мельчайшие или росинчатые, мелкие, точечные, крупноточечные). Более крупные колонии измеряют по их диаметру (2-3-5 мм); - поверхность (плоская, выпуклая, блюдцеобразная, с приподнятым центром, складчатая, влажная, блестящая, матовая, сухая); - края (ровные, волнистые, зубчатые, бухтообразные, бахромчатые и др.); - прозрачность (прозрачные, полупрозрачные и непрозрачные); - цвет (синеватые, серовато-синеватые, серые, беловато-серые, желтые, оранжевые и др.). 7.3 Характер роста по уколу. Характер роста по уколу указывает на отношение микроба к кислороду воздуха: аэробы растут в виде гвоздя, шляпкой вверх, факультативные анаэробы растут равномерно по всему уколу, облигатные (строгие) анаэробы – в нижней части укола. При выращивании на желатине одни виды бактерий (протеолитические) его разжижают, другие – не разжижают.
Из колоний, выросших при выделении чистой культуры, готовят мазки, окрашивают их по Грамму и микроскопируют при максимальном увеличении микроскопа для установления однородности формы микробных клеток. Увиденное в микроскопе зарисовывают в тетрадь. Вопросы для самоконтроля.
Лабораторная работа № 5 |