МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Тема: Изучение роста микроорганизмов и влияние на него рН и температуры культивирования. Цель работы: Изучить влияние факторов внешней среды (рН среды, температуры) на развитие микроорганизмов. Задание:
Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; карандаши по стеклу. Теоретическая часть. В естественных условиях микроорганизмы подвергаются воздействию разных по своей природе факторов, которые могут как стимулировать, так и тормозить их развитие (замедлять метаболические процессы) и даже приводить их к гибели. Температура является одним из наиболее мощных факторов, воздействующих на микроорганизмы. И хотя в целом развитие микроорганизмов происходит в очень широком диапазоне температур, для каждого конкретного вида существуют определенные температурные границы, в которых происходит их жизнедеятельность. Эта температурная зависимость характеризуется тремя точками: - минимальной температурой развития (t minimum). Это такая температура, при незначительном снижении которой скорость роста стремится к нулю (V роста→0); - оптимальной температурой развития (t optimum). Это такая температура, при которой скорость роста является максимальной (V роста = max); - максимальной температурой развития (t maximum). Это такая температура, при незначительном увеличении которой скорость роста стремится к нулю (V роста→0). В зависимости от отношения к той или иной температуре все микроорганизмы делятся на три основные группы: психрофилы, мезофиллы, термофилы. Психрофилы (греческое «психрос» - холод, «филео» - люблю) развиваются при низких температурах. Минимальной температурой развития у них является температура замерзания среды (около -2ºC), оптимальная -15-20ºC, а максимальная – 30-35ºC. К ним относятся обитатели холодных источников северных морей и океанов. Их часто обнаруживают на поверхности рыб. Многие из них, относящиеся к родам Pseudomonas, Achromobacter, способны быстро вызывать микробиальную порчу рыбы, хранящейся при температуре 0ºC. К психрофилам относится большинство светящихся бактерий рода Photobacterium. Их развитие в морской воде вызывает ее свечение. Мезофиллы («мезос» - средний) – наиболее распространенная группа микроорганизмов, развивающихся в температурных пределах от 5-10 до 40-50ºC. Температурный оптимум для них составляет 25-30ºC. К этой группе относятся многие гнилостные бактерии, вызывающие порчу пищевых продуктов при положительных температурах, а также все патогенные и токсичные формы бактерий. Вместе с тем большинство промышленных процессов (получение органических кислот, ферментов и т.д.) осуществляется с помощью мезофиллов. Термофилы («термос» - теплый) развиваются в температурных пределах от 30-35 до +80 и даже до +90ºC с оптимумом 5-60ºC. Они присутствуют в почве, навозе, иле. Среди них есть как споровые, так и неспоровые бактерии. Наибольшее количество термофилов наблюдается в местах, постоянно испытывающих действие высоких температур (например, в горячих источниках). Термофилия широко распространена среди анаэробов. В большинстве это споровые формы (например, представители рода Clostridium), причем споры у них отличаются особой термоустойчивостью. Поэтому они могут переносить стерилизацию и вызывать плоско-кислую порчу консервов. Отрицательное воздействие на микроорганизмы оказывают как низкие, так и высокие температуры, но механизм их действия различен. Низкие температуры оказывают в основном бактериостатическое действие вследствие замедления протекания биохимических процессов (замедления метаболизма). Гибель микроорганизмов (бактерицидное действие) наблюдается в случае чисто механического разрыва клеток образующимися в них кристаллами льда. Чем меньше образующиеся кристаллы льда и чем равномернее они распределены в клетке, тем меньше гибель микроорганизмов. И наоборот, чем крупнее кристаллы, тем больше клеток погибнет. Поэтому наиболее губительны для микроорганизмов температуры, которые соответствуют криоскопической точке цитоплазмы (от -2 до -5,6ºC). Чем дальше температура отстоит от криоскопического значения, тем меньше гибель микроорганизмов. Наиболее губительны для микроорганизмов высокие температуры. Повышение температуры приводит к ускорению биохимических реакций, но скорость реакций в клетке изменяется непропорционально, что приводит к дисбалансу и нарушению протекания метаболических процессов. Высокие температуры (70-80ºC и выше) оказывают бактерицидное действие. Под их воздействием происходит денатурация белка, приводящая к нарушению проницаемости клеточных стенок, потере активности ферментов, изменению структуры цитоплазмы и, как следствие всего этого, гибели клетки. Разные группы микроорганизмов проявляют разную чувствительность к действию высоких и низких температур. Наиболее чувствительны к действию низких температур термофилы и мезофиллы, а к действию высоких – психрофилы и мезофиллы. Наибольшей устойчивостью к действию высоких температур обладают споры. Воздействие высоких температур широко используется для подавления развития микроорганизмов. Реакция среды рН определяется концентрацией ионов водорода. Хотя в целом микроорганизмы развиваются в очень широком диапазоне, каждой физиологической группе и даже отдельным видам соответствуют определенные значения рН (оптимальная зона рН), в пределах которых происходит их развитие. Плесневые грибы, дрожи и бактерии рода Acetobacter лучше всего развиваются в кислой среде при рН = 3-5. Такие микроорганизмы называются ацидофильными. Для большинства бактерий наиболее благоприятна нейтральная или слабощелочная среда с оптимумом рН 7,0-7,3. Изменение рН в кислую сторону губительно отражается на гнилостных бактериях. Наоборот, уксуснокислые бактерии к кислой среде устойчивы. Особенно чувствительны к изменению реакции среды азотофиксирующие бактерии, в частности азотобактер. Он лучше всего развивается при рН 7,4-7,6, поэтому в кислых почвах его практически нет. Клубеньковые бактерии тоже лучше развиваются при слабощелочной реакции среды, хотя зона рН, при которой они могут развиваться, значительно шире, чем у азотобактера. Влияние рН на развитие микроорганизмов основано на том, что реакция среды влияет на активность ферментов, так как каждый фермент проявляет свою активность только при определенных значения рН. От концентрации ионов водорода зависит также поступление питательных веществ внутрь клетки и физическое состояние белков. Так, денатурация и выпадение большинства белков в осадок под действием высоких температур наиболее быстро и полно происходит в слабокислой среде. Увеличение кислотности среды наряду с температурой широко используется для подавления развития микроорганизмов при консервировании пищевых продуктов. Практическая часть
Посев проводят в четыре пробирки на МПА с различным значением рН: в одной из них рН равно 3, во второй – 5, в третьей – 7 и в четвертой – 9. Перед началом посева каждую пробирку подписывают: указывают значение рН и ставят свой номер. Для посева используют бактерии или из чистой бульонной культуры, или из плотной питательной среды. Посев производят бактериальной петлей или бактериальной иглой с соблюдением правил асептики. При посева на плотную среду пользуются иглой, а на жидкую – петлей. Петлю или иглу стерилизуют перед каждым посевом в пламени спиртовки (фламбирование). После посева пробирки с засеянными средами помещают в штатив и ставят в термостат. Термостатирование проводят в течение 24-48 ч при температуре 37ºC. После этого выращенные культуры микроорганизмов переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
Сначала готовят взвеси из культур бактерий, образующих и не образующих споры. Для этого берут две пробирки со стерильным изотоническим раствором. В одну вносят культуру сенной палочки (образует споры), а во вторую – молочнокислого стрептококка (не образует споры). Обе пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. После кипячения пробирки охлаждают и из каждой делают посев при помощи петли на косой агар. Перед каждым посевом петлю стерилизуют. Пробирки с посевами подписывают, указав культуру, которая в них посеяна, и свой номер, помещают в штатив и ставят в термостат. Посевы термостатируют 24 ч при температуре 37ºC. После этого выращенные культуры переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
Посеять споры плесневого гриба в три чашки Петри на сусло-агар (СА) или среду Сабуро с агаром. Предварительно готовят водяную суспензию спор. Для этого берут культуру плесневого гриба со зрелыми органами размножения (конидиями или спорангиями) и проводят по ним бактериальной петлей, предварительно смоченной в воде (чтобы споры лучше к ней прилипали). Затем вносят петлю в стаканчик или пробирку с водой (перенося туда споры) и тщательно перемешивают. Переносить споры в пробирку можно несколько раз. После этого стерильной бактериальной петлей берут каплю водяной суспензии спор плесневого гриба и осторожно наносят ее на СА, прикасаясь ребром петли в центр каждой чашки. При повторных посевах петлю можно не стерилизовать. Все чашки необходимо подписать, указав на каждой из них температуру выращивания, и поставить свой номер. Все надписи делаются только на дне чашек. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и ставят посевы на выращивание. Выращивание микроорганизмов при температурах 5ºC проводят в холодильнике, а при температуре 25ºC – в комнатных условиях, недалеко от батарей центрального отопления (при этом чашки надо накрыть темным материалом, чтобы не попадал свет), при 40ºC – в термостате. Через 48-72 ч все чашки переставляют в холодильник и хранят там до следующего занятия.
Интенсивность роста бактерий на средах с различными значениями рН определяется по степени мутности среды. Перед этим ставят содержимое каждой пробирки, на которой был проведен посев на предыдущем занятии, тщательно перемешивают (вращая пробирки между ладонями) и затем сравнивают друг с другом. Для оценки интенсивности развития бактерий пользуются условными обозначениями: рост отсутствует (-); рост слабый (+); рост умеренный (++); рост сильный (обильный) (+++). Степень мутности оценивается визуально. Полученные данные фиксируют в таблице 1 и делают вывод о влиянии рН на развитие взятых для посева бактерий. Таблица 1 Интенсивность развития бактерий при различных значения рН
Действие высоких температур на спорообразующие и неспорообразующие бактерии определяют по характеру роста микроорганизмов на косом агаре (сплошной, в виде отдельных колоний или обильный, слабый, умеренный, отсутствие роста). Полученные данные фиксируют в таблице 2 и формулирую выводы. Таблица 2 Действие температуры на спорообразующие и неспорообразующие бактерии
Для распознавания изучаемых бактерий (микрококки, сарцины, бациллы и неспороносные палочки) из двух пробирок с рН 7 и нулевой концентрацией соли готовят мазки, высушивают и фиксируют их, а затем окрашивают по Грамму и микроскопируют с увеличением объектива 90х или 100х. Увиденное под микроскопом зарисовывают в тетрадь и формулируют выводы.
Показателями влияния температуры на рост плесневых грибов служат величина колоний и интенсивность их спороношения. Для определения этих показателей чашки Петри, на которых росли грибы, переворачивают и со стороны дна чашки измеряют при помощи линейки диаметр выросших при разной температуре колоний. Полученные результаты записывают в таблицу 3 и делают выводы. Для оценки интенсивности спороношения, как и в предыдущих опытах, пользуются следующими условными обозначениями: спороношение отсутствует (-); спороношение слабое (+); спороношение умеренное (++); спороношение сильное, или обильное (+++). Полученные данные заносят в таблицу 3 и делают выводы о влиянии различных температур на рост и спороношение плесневого гриба. Таблица 3 Интенсивность развития плесневого гриба при различных температурах
Вопросы для самоконтроля
Лабораторная работа № 6 Тема: Выделение чистых культур бактерий. Количественный учет микроорганизмов. Цель работы: Научиться проводить посев на плотные и жидкие питательные среды и выделять чистые культуры бактерий. Знакомство с техникой количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер и измерения величины микробных клеток с помощью окуляр -микрометра. Задание:
- методом рассева в глубине среды; - по методу Дригальского. 2. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорганизмов чашечным методом. 3. Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для определения микробного числа. 4. Провести количественный учет клеток дрожжей, содержащихся в предоставленной суспензии (подсчет клеток дрожжей в исходной (неразбавленной) суспензии и суспензии, разбавленной в 2,5 и 10 раз в трехкратной повторности; 5. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева при объективе 20 или 40. 6. Определить: 1) цену деления окуляр - микрометра с помощью объектив - микрометра; 2) величину, размеры дрожжей. 7. Оформление протокола исследования. Материалы и оборудование: Питательные среды: МПА, МПБ, МПЖ, Китт – Тароцци в пробирках; пробирки с бактериальной культурой для засева; бактериологические петли; стерильные пастеровские пипетки; три чашки Петри и один стерильный завернутый шпатель на двух студентов; карандаши по стеклу; микроскоп и осветитель, объектив-микрометр, окуляр-микрометр, камера Горяева, бактериологическая петля, стерильные пипетки на 1–2 мл, капельница с водой, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор, чистые культуры грибов. Теоретическая часть. Чистые культуры – это потомство одной микробной клетки (без примеси других), выросшее на питательной среде. Выделение чистой культуры микроба является основой бактериологической работы, так как чаще всего исследуемый материал содержит смесь различных видов микробов. Изучение свойств микроорганизмов и установление их видовой принадлежности возможно только при наличии чистой культуры. Основной задачей при выделении чистых культур из материала, содержащего смесь различных микробов, является получение отдельных микробных колоний (потомство одной микробной клетки на плотной питательной среде). При выделении чистых культур микробов из исследуемого материала, часто содержащего смесь микробов, используют различные методы: механические, химические и биологические. Методы механического разделения микроорганизмов. Метод Пастера (метод разбавлений) заключается в том, что из исследуемого посевного материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: каплю посевного материала вносят в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую и т.д. до 8…10 колб или пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться, и можно получить такие разведения (последние), в которых во всей колбе или пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей среде, изолировать одну микробную клетку от другой будет трудно, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется для изолирования чистых культур, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микробов в материале перед его посевом в плотную питательную среду. Метод Коха (метод пластинчатых разводок). Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПА или МПЖ. Равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями. Каплю разведенного материала переносят во вторую пробирку, из второй в третью и т.д. (количество разведений зависит от предполагаемого загрязнения материала микробами). Содержимое каждой пробирки, начиная с первой, выливают в стерильные чашки Петри. Для этого вынимаю пробку из пробирки и после обжигания края пробирки быстро выливают агар в чашку со слегка подогретым на пламени спиртовки дном, приподнимая крышку чашки настолько, чтобы прошел край пробирки. Легким покачиванием чашки агар равномерно распределяют по дну и дают ему остыть. После застывания среды посевы помещают в термостат (вверх дном, чтобы конденсат не осаждался на поверхности среды) для культивирования. При посеве микроорганизмов на плотную среду они не могут распространяться по всей среде, как это имеет место в жидкости, а размножаются только на том месте, куда первоначально попали. Из каждой жизнеспособной клетки образуется видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов – колония. В настоящее время этот метод применяется для выделения чистых культур редко, но имеет большое практическое значение для количественного учета микроорганизмов в определенном объеме исследуемого материала. Он заключается в том, что в пустую стерильную бактериологическую чашку вносится точно отмеренное количество (чаще от 1 до 0,1 см3) исследуемого материала, после чего чашка заливается расплавленным и охлажденным до45-48ºC МПА. После тщательного перемешивания посевного материала со средой и застывания агара посевы помещают в термостат и культивируют при определенной температуре для определения группы микроорганизмов. Метод Дригальского основан на механическом разобщении микробных клеток на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь на том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 2-3 дня образует колонию – массу микробных клеток. Колония образуется путем деления одной клетки и в связи с этим представляет собой чистую культуру микроорганизма (т.е. особи одного вида). Для посева по методу Дригальского используют несколько чашек Петри, залитых плотной питательной средой. На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя или бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности среды. Этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала, номер анализа, дату посева и номер чашки, фамилию студента. Обычно в первой чашке появляется рост в виде сплошного налета. В следующих количество колоний меньше и встречаются изолированные, из которых отсевом легко выделить чистую культуру. Метод нагревания исследуемого материала применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (гнилостных, маслянокислых бактерий и т.д.). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85 ºC в течение 20-30 мин. Вегетативные формы погибают во время прогревания, а споры микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную среду прорастают, формируя колонии. Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ. Метод используется при изолировании культур микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Например, такой метод используется для выделения культур туберкулезных бактерий, которые устойчивы к действию кислот, щелочей и спирта. Исследуемый материал перед посевом заливают 15%-ным раствором кислоты или антиформином и выдерживают в термостате 3-4 ч. После воздействия кислоты или щелочи клетки возбудителя туберкулеза остаются живыми (поскольку они кислото- и щелочеустойчивы), а все другие микроорганизмы погибают. После нейтрализации кислоты или щелочи, высева материала на плотную питательную среду получает рост только возбудитель туберкулеза. Методы обогащения. Их часто применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов (например, сальмонелл и др.) из материалов, в которых мало выделяемых микроорганизмов, но содержится большое количество сопутствующей микрофлоры. Для увеличения численности выделяемого вида микроорганизма вначале делают посев исследуемого материала в питательные среды, которые содержат вещества, стимулирующие его рост и угнетающие или задерживающие размножение сопутствующей микрофлоры. Например, для выделения сальмонелл проводят посев в среды обогащения Кауфмана, Мюллера и др. При выделении культур молочнокислых бактерий из почвы или растений посевы делают на стерильное обезжиренное молоко, содержащее 5% этилового спирта для подавления роста гнилостных бактерий. После культивирования из накопительной среды проводится высев на плотные питательные среды в чашки Петри для выделения чистых культур микроорганизмов. Биологические методы выделения чистой культуры (заражение лабораторных животных) применяются для изолирования культур патогенных микроорганизмов из исследуемого материала, загрязненного большим количеством сапрофитных бактерий. Подозревая исследуемый материал на наличие определенного вида возбудителя, заражают этим материалом (вводят внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно) лабораторное животное, которое наиболее восприимчиво к данному виду патогенного микроба. Количественный учет микроорганизмов путем счета колоний(чашечный метод Коха) Этот метод является наиболее распространенным для определения общей микробной обсемененности различных субстратов. Сущность чашечного метода заключается в том, что производят посев определенного объема исследуемого материала в чашки Петри с плотной питательной средой. При последующем выращивании посева в термостате из каждой клетки в результате размножения образуется колония; количество их подсчитывают. В качестве питательной среды для учета бактерий применяют мясопептонный агар, для подсчета плесневых грибов и дрожжей - сусло-агар. Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний. Приготовление разведений. Количество микроорганизмов в объектах внешней среды, как правило, велико, поэтому для получения отдельных колоний готовят ряд разведений исследуемого вещества. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиологическом растворе (0,5%-ый водный раствор NаСl), обычно пользуют десятикратными последовательными разведениями (1:10, 1:100, 1:1000 т. д.). При исследовании продукта твердой консистенции на технических весах отвесить, с помощью часового стекла и стерильного скальпеля пробу продукта (1-10 г), перенести в стерильную ступку и растереть в однородную массу, добавляя стерильный кварцевый песок. Полученную навеску количественно и асептически перенести в колбу со 100 мл стерильного физиологического раствора - получится 1-е разведение (1:100). Суспензию в колбе тщательно взболтать в течение 3-5 мин, стерильной пипеткой взять 1 мл полученной суспензии и перенести в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl. Это второе разведение 1:103. Суспензию этого разведения перемешивают с помощью другой стерильной пипетки, вбирая и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензий и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл этой взвеси и переносят ее во вторую пробирку – это разведение 1:104. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения исследуемого образца определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате. Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 1000 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата. Посев на агаризованные среды в чашки Петри для поверхностного роста. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляет на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве случаев выдерживают 2-3 суток при 30° С крышками вниз для подсыхания поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара. Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05, 0,1 или 0,2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке Петри. Из каждого разведения делают, таким образом, 4-6 параллельных высевов. Для параллельных рассевов из одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений, используют новую стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов, перевернув их вверх дном. Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные количества плотной среды, заготовленные в пробирках по 10-15 мл. Культуру вносят в пробирки с расплавленным и охлажденным до 40-45° С агаром, а затем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара. Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов, содержащихся во взвесях (суспензиях). Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных камер имеет ограниченное применение, связанное с тем, что в счетных камерах проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе 8–40. Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три поперечно расположенные плоские площадки (см. рисунок). Средняя площадка продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине нанесена квадратная сетка. Две боковые площадки расположены на 0,1 мм выше средней. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов, по разному сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат (ABCD, сторона которого равна 1/20 мм, площадь 1/400 мм2, а объем при высоте камеры 1/10 мм – 1/4000 мм3, или 1/4000000 мл. Так называемый большой квадрат АВСД состоит из 16 малых квадратиков.  Счетная камера Горяева: вид сверху. Камера Горяева имеет площадь 9 мм2 и разбита на 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду). Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают чистым покровным стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков распределиться по всей сетке, не выступая в желобок между стенками. Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым площадкам камеры до появления ньютоновских колец. Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик микроскопа и микроскопируют с объективом ´10–40 (в поле зрения должны быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов). Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80 малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной линией пополам, считают только на двух из четырех границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают. Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в пяти больших квадратах (80 малых) – 240 клеток, тогда в одном малом квадратике среднее количество клеток – 240 : 80 = 3. Пересчет на 1 мл суспензии с учетом разведения производят по формуле N = а · 1000K/h · S, где N – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в малом квадрате; h – глубина камеры, мм; S – площадь малого квадрата, мм; K – разведение исходной суспензии; 1000 – коэффициент пересчета мм3 в мл (1 мл = 1000 мм3). Определение размеров клеток проводят под микроскопом с помощью окулярной линейки (микрометра) или окулярного винтового микрометра, используя чаще всего 24-часовые культуры микроорганизмов. Размеры клеток особенно удобно определять, пользуясь фазово-контрастным устройством. Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка длиною 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микрометр вставляют в окуляр. Однако делениями окуляр - микрометра нельзя непосредственно измерять величину клетки, т. к. последние рассматриваются через объектив и окуляр, а деления линейки – только через верхнюю линзу окуляра. Поэтому, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необходимо определить цену деления окулярного микрометра для данного микроскопа. Определение цены деления проводят с помощью объективного микрометра. Объективный микрометр – пластинка с отверстием в центре. В отверстие вставлено стекло, на котором нанесена линейка длиною в 1 мм. Эта линейка разделена на 100 частей, так что одно деление объективного микрометра соответствует 0,01 мм, или 10 мк. Для определения цены деления окулярного микрометра объектив-микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение линейки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при котором будут определять размер клеток. Перемещая столик микроскопа и поворачивая окуляр, устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были параллельны и одна перекрывала другую. Определение цены деления окулярного микрометра проводят по принципу нониуса, т. е. совмещают одну из черточек шкалы окулярного и объективного микрометров и находят следующие совмещения. Устанавливают, скольким делениям объективного микрометра соответствует одно деление окулярного микрометра. Например, два деления объект - микрометра (20 мк) соответствуют пяти делениям окуляр - микрометра, следовательно, одно деление окуляр - микрометра равняется 4 мк (20:5). Если теперь на столик микроскопа положить препарат с клетками микроорганизмов и рассмотреть его при этом же увеличении, то можно измерить величину клетки. Для этого определяют, какому числу делений окулярной линейки соответствует величина измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра. Очень удобно измерять размеры клеток с помощью винтового микрометра MOB-1-15-х, правила работы с которым подробно изложены в инструкции, прилагаемой к прибору. Практическая часть
Берут 3-5 пробирок, в которых находится по 5-10 мл питательного желатина или мясо-пептонного агара и расплавляют их содержимое на водяной бане. Пробирки с расплавленной средой охлаждают до 43-45ºC и ставят в теплую воду, чтобы предупредить застудневание среды. В одну из пробирок стерильной пипеткой или петлей вносят исследуемый материал. Затем другой стерильной пипеткой или петлей часть содержимого первой пробирки переносят во вторую, из второй – в третью и т.д. Засеянные пробирки со средой хорошо перемешивают, зажав их между ладонями (вращают несколько раз то в одну, то в другую сторону). Приготовленные таким образом разведения бактерии выливают из пробирок в чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок. После загустевания среды чашки помещают в термостат и термостатируют 24 часа при температуре 37 ºC. Количество выросших в чашках Петри колоний уменьшается по мере увеличения разведения взятого на посев материала.
Расплавленную питательную среду разливают в 3 чашки Петри с толщиной слоя не менее 0,5 см. Застывшую среду обязательно подсушивают. В первую чашку петлей вносят небольшое количество исследуемого материала и шпателем Дригальского или шпателем, сделанным из пастеровской пипетки, втирают его в поверхность питательной среды. Затем шпатель (не обжигая и не набирая нового материала) переносят сначала во вторую чашку, а затем в третью. В каждой из них оставшийся на шпателе материал втирают в поверхность питательного агара. Вместо шпателя можно использовать бактериальную петлю. Для этого ее с небольшим количеством микроорганизмов кладут плашмя на питательную среду и проводят, не повреждая поверхности, штрихи по всей среде или по секторам, разделив дно чашки (если среда прозрачна) на 4 или 8 частей. Штрихи можно проводить в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Нужно стараться, чтобы штрихи, наносимые петлей, располагались как можно ближе друг к другу, так как это удлиняет линию посева и дает возможность получить изолированные колонии микробов. 3. Определение микробного числа почвы Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и сусло - агар (для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асептических условиях, суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водопроводной воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5-10 мин. Из надосадочной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку, заполненную 9 мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:103). Встряхивают суспензию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью пробирку с 9 мл воды (разведение 1:104). Посев производят из второй или третьей пробирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при 37° С 48 ч, а с СА выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет выросших колоний проводится на следующем занятии. 4.Определение микробного числа воздуха Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седиментационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в течение определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха. Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на водяной бане стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Чашки ставят в месте отбора проб и открывают на 5, 10 и 15 мин. Время выдержки отмечают на крышке чашки. Затем чашки с МПА термостатируют при 37° С 48 ч, а с СА - при 24° С 6-7 суток, перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на следующем занятии. 5. Определение микробного числа воды Микробное число воды - это общее количество микроорганизмов, содержащееся в 1 мл воды. Для санитарно-микробиологического исследования водопроводной воды пробы берут из уличных водоразборов и кранов внутренних водопроводов. Краны обжигают, затем полностью открывают и спускают воду 10 мин., а затем отбирают пробы воды с соблюдением требований асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л. Если вода подвергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5%-ого стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в агаризованную среду 1 мл воды вносят в пустую стерильную чашку Петри, куда затем наливают 10-12 мл расплавленного МПА (45° С) и тщательно перемешивают. После застывания агара посевы инкубируют при 37° С 24 ч. Из одной пробы воды засевают 3 параллельных чашки и не только на МПА, но и на сусло - агар для выявления роста дрожжей и грибов, в этом случае посевы инкубируют 2-З суток при температуре 24° С. 6. Определение микробной загрязненности предметов обихода и рук Для анализа микробной загрязненности столов, оборудования, полотенец, халатов, рук персонала используют тампонный метод. Для этого готовят ватные тампоны, стерилизуют их, погружают в пробирки с 2 мл стерильной воды или изотонического раствора хлорида натрия, при этом тампон не должен касаться поверхности жидкости, смачивают тампон непосредственно перед взятием проб. Для отбора проб с плоских крупных поверхностей (столы) используют трафареты из проволоки или жести, которые предварительно стерилизуют фламбированием; затем накладывают их на поверхность стола, производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см2, ограниченной трафаретом; тампон помещают в пробирку, добавляют еще 8 мл жидкости и тщательно прополаскивают тампон (салфетку) с последующим отжимом его. Общую микробную загрязненность определяют, засевая 1 мл смыва, в глубину расплавленного МПА в чашке Петри, как это описано для определения микробного числа воды. Посевы выращивают сутки при 37° С, подсчитывают количество выросших колоний и определяют общую микробную загрязненность данного объекта. Для выявления дрожжей и грибов делают посев на сусло-агар. Смывы с рук получают, тщательно протирая ладони, межпальцевые и подногтевые пространства влажным стерильным тампоном на деревянной пилочке. Тампон погружают в ту же пробирку, в которой он смачивался, добавляют еще 8 мл стерильной воды. Смывы с поверхности предметов содержатся в 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10. Для приготовления разведения 1:100 1 мл исходного смыва (1:10) помещают в пробирку и доливают к нему 9 мл стерильной водопроводной воды. Берут две стерильные чашки Петри, нумеруют их со стороны дна (№ 1 и 2). В первую чашку вносят 1 мл исходного разведения смыва (1:10), во вторую - 1 мл разведения 1:100. Заливают в каждую чашку 15-30 мл расплавленного и охлажденного до 35° С МПА. После застывания агара посев термостатируют при 37° С сутки. Параллельно ведут посев на 2 чашки со стерильным СА. Этот посев выдерживают при 24° С 4- 5 суток. В отчете по данной работе указать классификацию и способы стерилизации питательных сред, этапы подготовки микробиологических материалов для количественного учета чашечным методом, схему подготовки разведении и посева, описать конкретную задачу. Вопросы для самоконтроля
Лабораторная работа № 7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||