МУ бт микр. лаб 2014. Методические указания к лабораторным работам по дисциплине биотехнология микроорганизмов для студентов специальности 5В070100 Биотехнология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Тема: Отделение биомассы микробов от культуральной жидкости. Цель работы: Изучить методы выделения и очистки конечных продуктов биотехнологического производства. Задание: 1. Изучить теоретическую часть лабораторной работы. 2. Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости. 3. Определение массы сухого мицелия. 4.Оформить отчет по результатам лабораторной работы. 5. Ответить на контрольные вопросы. Материалы и оборудование: микроскоп, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор, чистые культуры грибов, колбы, пробирки. Теоретическая часть. Продукты микробного синтеза поступают из биореактора в виде водных суспензий или растворов, при этом характерно невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ. В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы - сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод. Технологические приемы, используемые для отделения клеток от среды зависят от природы продуцента. Например, сахаромицеты (хлебопекарные дрожжи) имеют относительно большие клетки и способны флотироваться, поэтому после сгущения биомассы флотацией их отделяют на обычных барабанных вакуум-фильтрах. В дальнейшем биомассу, снятую с фильтра, подвергают прессованию и получают продукт с высоким содержанием живых клеток, имеющих высокую хлебопекарную активность. Дрожжи же рода Candida, служащие источником кормового белка плохо флотируются и фильтруются. Поэтому дрожжи, растущие на углеводородах, а также бактерии-продуценты белка на основе метана и метанола, на первом этапе сепарируются, причем в несколько ступеней. Оставшаяся вода удаляется путем выпаривания, а все компоненты жидкой фазы остаются в конечном продукте. К аналогичному приему прибегают и при производстве бактериальных энтомопатогенных препаратов и удобрений. Конечный продукт удается получить в активной форме лишь в принципе отказавшись от выделения его из культуральной жидкости: содержимое реактора выпаривают и сушат в условиях, обеспечивающих жизнеспособность конечного продукта. Неутилизированные компоненты культуральной жидкости могут отразиться на способности продукта к хранению. При выделении и очистке метаболитов биомасса, если она не содержит заметных количеств целевого продукта, осаждается добавлением извести или других твердых компонентов, увлекающих клетки или мицелий на дно - физическое осаждение. Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру. Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость. Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор. Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления). Химические и химико-ферментативные методы более избирательны. Клетки могут быть разрушены толуолом или бутанолом, антибиотиками, ферментами. Культуральную жидкость освобождают от сопутствующих растворимых веществ и фракционируют. Освобождение от растворимых веществ производят несколькими способами: 1. Осаждение - физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ). Осаждение органическими растворителями основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Устойчивость белковых растворов обусловлена наличием гидратного слоя у молекулы. Если его разрушить, белки осаждаются. Для этого молекулы добавляемых веществ должны быть более гидрофильны, чем молекулы белков. В качестве осадителей используют этанол, метанол, ацетон, изопропанол. При разных количествах растворителя и разных значения рН осаждаются разные фракции. Пример: 50% этанол осаждает 80% протеазы и 3-5% амилазы, 70% спирт осаждает 98% амилазы. Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия. 2. Экстракция. При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной - из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями. 3. Адсорбция - частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент - твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму. Более тонкую очистку веществ осуществляют несколькими способами. Наибольшее распространение получила хроматография. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта). По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. Гораздо более эффективен метод аффинной хроматографии (хроматография по сродству). В основе этого метода лежат биологически важные взаимодействия, происходящие на поверхности белковых молекул. При аффинной хроматографии используется нерастворимый матрикс, ковалентно связанный со специфичными лигандами (антителами или субстратом ферментов), которые присоединяют определенный белок. Экстракты разрушенных клеток можно фракционировать, подвергая их высокоскоростному центрифугированию. Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора. При ультрацентрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить. Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить. Электрофорез - метод разделения белков и нуклеиновых кислот в свободном водном растворе и пористом матриксе, в качестве которого можно использовать полисахариды, например, крахмал или агарозу. Биомолекулы обычно несут суммарный положительный или отрицательный заряд, обусловленный наличием на их поверхности положительно или отрицательно заряженных групп аминокислот. Виды сепарации: 1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости, то жидкость предварительно вспенивают, затем отделяют ее верхний слой с клетками. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости. 2. Фильтрация - задержание биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Применяют фильтры однократного или многократно использования: барабанные, дисковые, ленточные, тарельчатые, карусельные, вакуум-фильтры, фильтр-прессы различных конструкций, мембранные фильтры. Диаметр пор может превышать размеры клеток. Иногда биомассу сдувают с поверхности фильтра сжатым воздухом или срезают специальным ножом. 3. Центрифугирование - осаждение взвешенных в жидкости частиц с применением центробежной силы. Требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) поставлена задача максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие. Практическая часть 1. Отделение биомассы гриба от культуральной жидкости На аналитических весах взвешивают пустые бумажные фильтры, предварительно высушенные до постоянной массы (вес записывают), и вставляют в воронки. Колбу открывают, и содержимое фильтруют через фильтр. Отделенная от культуральной жидкости биомасса гриба является материалом для определения массы сухого мицелия. После фильтрования замеряют объем культуральной жидкости и доводят до 100 мл дистиллированной водой. 2. Определение массы сухого мицелия Фильтры с биомассой гриба помещают в сушильный шкаф при температуре 130С на 40 мин (до полного высушивания). Затем фильтры переносят в эксикатор для охлаждения на 10-15 мин, после чего взвешивают на аналитических весах. Разность между массой фильтра с сухим мицелием и массой пустого фильтра является массой сухого мицелия (Х), образовавшегося за период культивирования гриба в термостате: Х = Мм - Мф , (2.1) где Х – масса сухого мицелия, г; Мф - масса пустого фильтра, г; Мм - масса фильтра с высушенным мицелием, г. Контрольные вопросы:
Лабораторная работа № 8 Тема: Изучение ферментативной активности (бродильной, протеолитической, целлюлозолитической) микроорганизмов. Цель работы: Ознакомиться с биохимическими свойствами микробов. Задание:
Материалы и оборудование: Посевы предыдущего занятия, бактериологические петли, пастеровские пипетки (стерильные), предметные стекла, набор растворов красок для окраски по Грамму, фильтровальная бумага, микроскопы; пробирки с питательными средами для определения биохимических свойств бактерий (МПА, МПБ, МПЖ среды с углеводами и индикатором Андреде), молоко цельное, лакмусовое, метиленовое, пробирки с бактериальной культурой для посева на эти среды, спиртовые или газовые горелки. Теоретическая часть. Биохимические свойства микробов обусловлены наличием в клетке различных ферментов, которые производят расщепление и синтез различных химических веществ. Изучение этих свойств микроорганизмов имеет большое практическое значение в технологии многих пищевых производств (молочном, пивоварении, хлебопечении и др.), а также при дифференциации видов микробов. При изучении биохимических свойств микробов практический интерес представляет определение сахаролитических, протеолитических и редуцирующих свойств. Сахаролитические свойства микробов. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению многоатомных спиртов и некоторых углеводов, именуемых сахарами, на альдегиды, кислоты, газообразные продукты (СО2, СН4, и Н2). Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахар используют специальные жидкие, полужидкие и плотные питательные среды с соответствующими углеводами и индикатором. Набор жидких или полужидких сред с углеводами и индикатором называют «пестрым» рядом. Название «пестрый» ряд обусловлено тем, что под действием ферментов растущего микроба использованные сахара расщепляются до продуктов промежуточного распада (кислота). В результате накопления кислоты снижается рН среды, изменяется цвет индикатора и среды. При отсутствии у микроба какого-либо фермента углеводы не расщепляются, рН остается неизменным, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется. Для определения сахаролитической способности бактерий используют чаще всего среды Гиса с индикатором Андреде. Они состоят из пептонной воды, углеводов и индикатора (кислый фуксин, обесцвеченный раствором едкой щелочи). Применяют также полужидкие среды с индикатором «ВР» (водно-голубой краситель, обесцвеченный розоловой кислотой). Если исследуемая культура микроба под действием фермента разлагает углевод с образованием кислоты, то происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды (в розово-малиновый цвет с индикатором Андреде или в голубой с индикатором «ВР»). Кислота вступает в реакцию с щелочью или розоловой кислотой и нейтрализует их. Если расщепление углевода идет до конечных продуктов, т.е. до СО2 и воды, то наличие газа определяется в газовках (если среды жидкие) или пузырьки газа обнаруживают в толще полужидкой среды. Посевы на углеводные среды (с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом, дульцитом и др.) проводят распрямленной в виде стержня бактериологической петлей уколом по центру среды. Для обнаружения газа в пробирку со средой перед стерилизацией помещают небольшой клочок ваты или маленькую запаянную с одного конца стеклянную трубочку (поплавок). Пузырьки газа задерживаются ватой или собираются в верхнем конце трубочки, вытесняя среду, заполнившую трубку при стерилизации. Протеолитические свойства микробов. Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.) и определяют путем посева микробов в желатин, на свернутую кровяную сыворотку и молоко. При росте в молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через несколько дней вызывают пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы, выпадением осадка и просветлением молочной сыворотки. В посевах на молоке определяют способность микробов свертывать молоко (в результате ферментации лактозы и образования молочной кислоты) и пептонизацию. Если молоко после культивирования микробов не свернулось, его кипятят в пробирке, вынув пробку, так как молоко при кипячении может выбрасываться из пробирки и вызывать ожог. Если после кипячения молоко не свернется, то углевод не разлагается. Посевы в МПЖ культивируют 5-7 сут при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, реповидное, в форме чулка и т.д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина. В посевах со свернутой кровяной сывороткой протеолитические микроорганизмы также вызывают разжижение, а непротеолитические не изменяют ее консистенцию. На молочном агаре (смесь водного раствора агар-агара и обезжиренного молока) вокруг колоний протеолитических микробов образуются зоны просветления вследствие разложения казеина. Зоны протеолиза широкие, зоны пептонизации узкие. Распад белков под действием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, протекает неодинаково: некоторые виды бактерий образуют конечные продукты распада – индол, сероводород, аммиак. а) Определение индола. Определяют по способности микроба расщеплять аминокислоту триптофан под действием фермента триптофаназы. Предложено несколько методов определения индола. Наиболее часто употребляется метод Эрлиха – Боме. Реактив Эрлиха – Боме: 1 г парадиметиламидобензальдегида растворяют в 95 мл 960 спирта и 20 мл НCl (плотность 1,19). К 5 мл 2-3-дневной бульонной культуры добавляют 2-3 мл эфира. Встряхивают и реактив добавляют по стенке. В присутствии индола весь эфирный слой или его нижняя часть окрашивается в красный цвет. Можно индол обнаружить путем использования индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу пропитывают первым реактивом Эрлиха, затем ее высушивают на воздухе и нарезают на тонкие полоски. Первоначальный цвет пропитанных реактивом Эрлиха бумажек желтый. Хранят индикаторные бумажки в стерильной банке с притертой пробкой. Для определения индола делаю посев в пробирку с МПБ, под пробирку вставляют индикаторную бумажку (нижний конец бумажки не должен прикасаться к среде) и культивируют при 370С в течение 24-48 ч. Если исследуемая культура бактерий разлагает белок с образованием индола, нижняя часть индикаторной бумажки окрашивается в малиновый цвет. б) Определение сероводорода. Для определения сероводорода производят посев исследуемой культуры бактерий на мясопептонный бульон (с 3% пептона) или пептонную воду. Между стенкой пробирки и ватной пробкой помещают фильтровальную полоску бумажки, пропитанной 10%-ным раствором уксуснокислого свинца. Если засеянные микроорганизмы расщепляют белковые вещества с образованием сероводорода, то полоска фильтровальной бумажки чернеет в результате образования сернистого свинца. К числу микробов, вызывающих расщепление белковых веществ с образованием сероводорода, относятся некоторые виды паратифозной группы бактерий, гнилостные бактерии. в) Определение аммиака. Присутствие аммиака обнаруживают так же, как и сероводород, но для этого используют лакмусовую бумажку. При наличии аммиака розовая лакмусовая бумажка принимает синюю окраску. К таким микробам относятся флюоресцирющие бактерии, уробактерии и др. Практическая часть
Вопросы для самоконтроля
Лабораторная работа № 9 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||