Вино. Микробиологический контроль производства вина

• Название: Микробиологический контроль производства вина
• Дата: 04.04.2022
• Размер: 109.42 Kb.
• Имя файла: Вино.docx
• Тип: Документы; #440812

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования

«Иркутский национальный исследовательский технический университет»

Институт высоких технологий

Кафедра химии и пищевой технологии имени проф. В.В. Тутуриной

Задание по теме

«Микробиологический контроль производства вина»

Выполнили студенты:

группы ТПб-19-2

Козулина В.А.

Рахимова Д.Т.
Принял:

Лозовая Т.С.


Иркутск 2021

1. Характеристика посторонних микроорганизмов на производстве вина

Таблица 1 – характеристика посторонних микроорганизмов

Группа м/о	Источники попадания в производство	Особенности	Вред для производства	Признаки появления	Способы выявления	Питательные среды для выявления
Бактерии Lactobacillusbrevis	Ягоды винограда, винодельческое оборудование (бродильные чаны)	Грамположительные, стержневидные виды молочнокислых бактерий которые являются гетероферментативными.	Прогоркание вина	Вино теряет блеск, мутнеет, во вкусе ощущаются тона горечи. Цвет вина изменяется, красящие вещества выпадают в осадок. Вино становится непригодным к употреблению.	Для определения присутствия и учета количества лактобацилл навеску исследуемого материала разводят в физиологическом растворе и высевают в жидкие накопительные среды или же сразу на твердые среды.	Питатель-ная среда MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe); Среда Рого-за; Питатель-ная среда для культи-вированиялактоба-цилл с эта-нолом; Молочная питательная среда для культивиро-вания лак-тобацилл; Капустный агар; Среда для выделения молочно-кислых бак-терий (по Нетру-сову А.И.); Глюкозо-пептонная среда (ГПС); Среда Ло-урия-Бертони (LB).

Продолжение таблицы 1

ДрожжиродовPichia, Hansenula, Candida	Ягоды винограда; резервуары, бочки.	Пленчатые дрожжи, отличаются от винных меньшими размерами, склонно-стьюобра-зовывать ветвистые скопления, напомина-ющие ми-целий. Характерной способностью пленчатых дрожжей является наличие жировых капель на одном или двух полюсах клетки.	Цветение вина	Помутнение вин, разлитых в бутылки.  .	Метод Коха, выделение клеток дрожжей при помощи отделителя Годюруа, метод Клинкгаммера, Метод Линднера.	Питательная среда Лурия-Бертани (LB); питательнаясреда YPD; питательная среда YPDS;мясопептонный глюкозный агар, среда Сабуро, пивное сусло-агар, морковныйагар.
РодHanseniaspora, H'sp. uvarum	Поврежденные ягоды винограда, виноградный сок.	Значительно мельче винных дрожжей, имеют характерную заостренную на обоих концах форму, напоминающую лимон.	Недоброды, ухудшение органолептики.	Используют сахар и дают много летучих кислот.Продукты брожения сообщают виноматериалу не только посторонний тон, но и тормозят рост и бродильную энергию.	Метод Коха, вы-деление клеток дрожжей при по-мощи от-делителя Годюруа, метод Клинк-гаммера, Метод Линдне-ра.	Жидкая среда и плотная, приготовленнаяна основе солодового экстракта.

Продолжение таблицы 1

винных дрожжей как при брожении виноградного сусла, так и при брожении вин (при шампанизации), являясь причиной недобродов

2. Принципиальная схема производства вина

Сборка

Виноград




Приёмка

Дробление

SO₂

Отжатая мезга

Отдых

Декантация клея с фильтрацией

Обработка холодом

Холодная фильтрация

Отдых виноматериала

Розлив с укупоркой

Бракераж

Этикетирование

корковая пробка



Этикетка




Мезга

Брожение

τ= 20-30 дней,

t = 27-29 ⁰C

Отжим

Осветление

Купаж

Оклейка

Обработанный виноматериал


2.1 Обоснование выбора точек отбора проб

1. 
   Разводка чистой культуры дрожжей. Отбор пробы производится для контроля количества клеток ЧК.
   
2. 
   Виноград ручной уборки. В данной точке отбор проб осуществляется для определения количества микроорганизмов в смывной воде, так как в ней могут быть посторонние микроорганизмы, которые в дальнейшем могут серьёзно повлиять на весь технологический процесс.
   
3. 
   Необработанный виноматериал на хранении. Отбор пробы производится для контроля наличия клеток.
   
4. 
   Мезга. В данной точке определяется наличие микроорганизмов, которые могли попасть при приёмке и дроблении.
   
5. 
   Бродящее сусло в бродильном резервуаре. Здесь определяется физиологическое состояние клеток, так как оно оказывает очень сильное влияние на процесс брожения.
   
6. 
   Виноматериал по окончании брожения. В данной точке отбора пробы определяется наличие посторонних микроорганизмов, которые на последующих этапах могут повлиять на качество готового продукта.
   
7. 
   Сусло после осветления и декантации. Здесь определяется количество микроорганизмов для контроля перед последующими этапами.
   
8. 
   Холодная фильтрация. Розлив с укупоркой. После каждого из этих этапов проверяется наличие микроорганизмов для предотвращения последующей порчи продукта.
   
9. 
   На данном этапе проверятся пробки, бутылки на наличие микроорганизмов и механических загрязнений, так как на этом этапе недопустимо наличие посторонних микроорганизмов в смывной воде.
   
10. 
    Каждый узел линии переработки, технологическая тара. На протяжении всего процесса технологии производства должен осуществляться контроль на наличие механических загрязнений и запаха, микроорганизмов в смывной воде, т.к. наличие этих факторов может серьёзно повлиять на технологический процесс и качество готового продукта.
    

3. Схема микробиологического контроля

Объект контроля	Место отбора, периодичность	Определяемые показатели	Метод контроля	Нормативный документ	Нормы
Разводка чистой культуры дрожжей	Дрожжанка, ежедневно, через 6-12 ч.	Физиологическое состояние клеток дрожжей и их количество. Наличие посторонних микроорганизмов.	Микроскопирование, окрашивание препарата, подсчет количества клеток в 1 см3	ГОСТ 31730-2012	Разводка должна содержать не менее 80 млн клеток чистой культуры дрожжей в 1 см3, из них почкующихся – не менее 30%, мертвых- не более 5%. Посторонние микроорганизмы не допускаются.
Виноград ручной сборки	Транспортная единица, выборочно перед подачей на переработку	Количество микроорганизмов в смывной воде, БГКП и КМАФАиМ.	Микроскопирование смывной воды	ГОСТ 31782-2012 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Не более 1-2 клеток микроорганизмов в одном поле зрения микроскопа
Необработанный виноматериал на хранении	Каждый резервуар, не реже 1 раза в месяц - столовые, не реже 1 раза в квартал – крепленые.	Наличие посторонней микрофлоры, БГКП и КМАФАиМ.	Микроскопирование после предварительного центрифугирования	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Наличие до 10 клеток в одном поле зрения микроскопа. При наличии яблочной кислоты допускается присутствие молочнокислых бактерий для прохождения яблочно-молочного брожения.
Бродящее сусло и мезга	Бродильный резервуар, емкость для настаивания, в случае задержки брожения.	Физиологическое состояние клеток дрожжей. Наличие посторонней микрофлоры, температура.	Микроскопирование, окрашивание препарата.	ГОСТ 30712-2001	Мертвых клеток дрожжей – не более 5%, посторонних микроорганизмов не более 1% от общего количества.
Виноматериал по окончании брожения	Каждый резервуар, не позже 2 недель по окончании брожения.	Наличие посторонней микрофлоры, наличие яблочной кислоты, БГКП и КМАФАиМ.	Микроскопирование после предварительного центрифугирования.	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Посторонние микроорганизмы не допускаются. Допускается в высококислотных виноматериалах наличие молочнокислых бактерий для прохождения яблочно-молочного брожения.
Сусло после осветления и декантации	Отстойный резервуар или технологическая емкость, 1-2 раза в процессе осветления через 6-12 ч.	Количество микроорганизмов, БГКП и КМАФАиМ.	Микроскопирование	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Не более 1-2 клеток микроорганизмов в одном поле зрения микроскопа.
Вина, подготовленные к розливу	Каждый резервуар, перед розливом.	Наличие микроорганизмов, БГКП и КМАФАиМ.	Микроскопирование после предварительного центрифугирования.	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Не более 1 клетки микроорганизмов в 10 полях зрения микроскопа.
Пробки	Склад, или цех розлива, при приемке, 1 раз в смену при подаче на розлив, 1 раз в месяц в процессе хранения.	Наличие микроорганизмов, наличие механических загрязнений, БГКП и КМАФАиМ в смывах.	Микроскопирование после предварительного центрифугирования смывной воды (3 пробки обмывают в 50 см3 стерильной воды).	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Смывная вода должна быть прозрачной и бесцветной, наличие микроорганизмов не допускается.
Бутылки	Цех розлива (перед подачей на розлив), 1 раз в смену.	Наличие микроорганизмов, наличие механических загрязнений, БГКП и КМАФАиМ в смывах.	Микроскопирование после предварительного центрифугирования смывной воды (внутреннюю поверхность 2 бутылок обмывают 50 см3 стерильной воды).	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Смывная вода должна быть прозрачной и бесцветной, наличие микроорганизмов не допускается.
Оборудование по переработке сырья	Каждый узел линии переработки, пред началом переработки и после каждой мойки и обработки.	Наличие микроорганизмов в смывной воде, наличие механических загрязнений и запаха, БГКП и КМАФАиМ в смывах.	Микроскопирование мазка, взятого с поверхности площадью 10×10 см увлажненным 10 мл воды тампоном. Отжатую с тампона каплю используют для микроскопирования.	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	При микроскопировании смыва с поверхности оборудования и тары допускается наличие 1-2 клеток микроорганизмов в 1 поле зрения микроскопа, механических загрязнений и запаха быть не должно.
Резервуары, бочки, буты и др.	Каждая единица технологической тары, после мойки и обработки.	Наличие механических загрязнений и запаха, микроорганизмов в последней смывной воде, БГКП и КМАФАиМ в смывах.	Микроскопирование последней смывной воды или мазка с контролируемого объекта с поверхности 10×10 см увлажненным 10 мл воды тампоном марлевым или ватным.	ГОСТ 30712-2001 ГОСТ 31747-2012 ГОСТ 10444.15-94	Смывная вода должна быть прозрачной и бесцветной, при микроскопировании допускается наличие 1-2 мертвых клеток дрожжей или спор плесневых грибов не в каждом поле зрения.

4. Описание методов, необходимых для осуществления запланированной схемы микробиологического контроля

Основным методом микробиологического анализа является микроскопирование. Микроскопическое исследование позволяет определить количество микроорганизмов в 1 мл жидкости при подсчете в счетной камере, состав микрофлоры и ее физиологическое состояние.

1. 
   Определение общего количества клеток микроорганизмов. Для определения концентрации (числа клеток) микроорганизмов в 1 мл жидкости производят подсчет их под микроскопом в счетной камере (Тома- Цейса, Горяева, Бюркера или Предтеченского). В каждом препарате счетной камеры, например, Тома-Цейса, подсчитывают клетки в 5-ти больших квадратах — по углам и в центре сетки. Густые суспензии следует разбавлять водой с таким расчетом, чтобы количество клеток в одном большом квадрате было не более 30. Для того чтобы результат подсчета был достоверен, необходимо сосчитать не менее 600 микроорганизмов.
   

Для микроскопирования готовят препарат “раздавленная капля”. На предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и накрывают покровным стеклом.

2. 
   При микроскопировании с предварительным центрифугированием 10 см³ исследуемого материала центрифугируют при частоте вращения 3,0-103 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают и готовят препарат. При микроскопировании лучше пользоваться объективом 40х и окуляром 10х или 15х.
   
3. 
   Отбор пробы винограда. При контроле на обсемененность микроорганизмами винограда ручной уборки для анализа отбирают с разных мест транспортной единицы 50 ягод, помещают их в широкогорлую колбу на 500 см³ со 100 см³ стерильной водопроводной воды, тщательно взбалтывают в течение 3—5 минут. Для микроскопирования готовят препарат смывной воды.
   
4. 
   Отбор пробы виноматериала, вина. От однородной партии виноматериала отбирается средняя проба, а в случае необходимости — из каждой отдельной емкости, в соответствии с предусмотренными правилами приемки и отбора проб.Если виноматериал длительное время находился в состоянии покоя, пробы отбирают из нескольких слоев, в том числе и из осадка. Для этого пользуются резиновыми шлангами с зажимами и со стеклянной трубкой или пробоотборниками, которые после каждого отбора пробы промывают чистой водой, а затем — исследуемым виноматериалом. 
   

Пробу для количественной характеристики микрофлоры отбирают после тщательного перемешивания всей исследуемой жидкости. Если это невозможно, отбирают по 2-3 пробы из различных слоев жидкости. Эти пробы затем смешивают вместе, после чего берут материал для анализа.

Для качественной характеристики состава микрофлоры берут отдельные пробы из разных слоев жидкости, не смешивая их: с поверхности, из середины и со дна, так как пленчатые дрожжи и уксуснокислые бактерии развиваются в поверхностных слоях жидкости, а молочнокислые бактерии - в толще вина или на дне.

Микробиологический анализ проб проводят как можно быстрее после отбора, не позднее, чем через 2 ч при условии хранения образцов при температуре 6°С, при определении количественного состава микрофлоры — не позднее, чем через 30 мин.

5. 
   При исследовании чистоты тары, шлангов и инвентаря берется проба из последней промывной воды. Кроме того, делают соскобы с внутренней поверхности тары стерильным скальпелем или смывы стерильными ватными тампонами.Отобранные стерильными пипетками, скальпелями, пинцетами или тампонами пробы необходимо сразу помещать в стерильные пробирки или колбы, закрытые ватными пробками.
   
6. 
   Метод прижизненного окрашивания предназначается для дифференциации живых и мертвых клеток дрожжей при микроскопировании. На предметном стекле смешивают каплю исследуемой жидкости с каплей раствора красителя метиленовая синь. Мертвые клетки окрашиваются в цвет красителя.
   
7. 
   Метод прямого счета клеток микроорганизмов в поле зрения микроскопа. Подсчитывают количество микроорганизмов в 10 полях зрения микроскопа препарата “раздавленная капля”, передвигая препарат по диагонали. Затем вычисляют среднее количество клеток в одном поле зрения. При необходимости определения количества клеток в 1 см³ расчет производят по формуле, используемой при подсчете в счетной камере.
   Этим методом пользуются при определении группового количественного и качественного состава микроорганизмов. Подсчитывают в каждом поле зрения отдельно количество винных дрожжей, диких дрожжей, бактерий, спор плесневых грибов, и на основании полученных данных подсчитывают общее количество микроорганизмов в одном поле зрения и процентное соотношение каждой группы.
   
8. 
   Определение физиологического состояния клеток дрожжей. В цикле развития дрожжей различают семь стадий: размножение, брожение, голодание, стадию покоящихся клеток, спорообразование, отмирания и автолиз.
   

Размножение характеризуется усиленным почкованием клеток. Почка — дочерняя клетка, достигнув определенных размеров, отделяется от материнской. При благоприятных условиях полное развитие клетки заканчивается приблизительно за час. Эта стадия характеризуется наличием большого количества почкующихся клеток с однородной плазмой и тонкой оболочкой.

В период активного размножения количество мелких клеток возрастает при лимите в питательной среде стимуляторов роста, питательных веществ и уменьшается при повышении температуры. Это дает информацию о возможных нарушениях технологического процесса.

Брожение. В этой стадии дрожжи в преобладающем большинстве находятся в виде отдельных клеток, имеют зернистую плазму, мелкие вакуоли, большой запас питательных веществ (гликогена, жира). При окрашивании раствором йода в йодистом калии клетки приобретают красно-бурый цвет — реакция на гликоген.

Голодание. После сбраживания сахаров дрожжи оседают на дно, жизнедеятельность продолжается за счет запасного гликогена. Клетки становятся мельче, протоплазма приобретает зернистость, оболочка утолщается. Окрашиваются йодом в желтый цвет.

Отмирание клеток наступает при длительном хранении дрожжевого осадка в вине при недостатке или отсутствии кислорода воздуха. Оно характеризуется отставанием плазмы от своеобразного зеленого цвета утолщенной оболочки. Отмершие клетки кажутся сильно деформированными и окрашиваются метиленовой синью в синий цвет.

Разложение. В процессе распада у отмерших клеток вначале набухает оболочка, плазма приобретает крупнозернистое строение. Оболочка разрывается, содержимое клетки переходит в вино, образуя тончайшую трудноустранимую муть.

Автолиз — это разложение компонентов клетки под действием своих же гидролитических ферментов. Происходит распад белков, углеводов, нуклеотидов, липидов и других веществ клетки и выход их составных частей в среду. Необходимым условием автолиза является отмирание клеток при сохранении активности внутриклеточных ферментов.

9. 
   Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП). Метод определения БГКП основан на обнаружении образования газа и кислоты при высеве определенного количества продукта (или смыва с его поверхности) в жидкие питательные среды, содержащие лактозу (среда Кесслера) с последующим подтверждением принадлежности выросших микроорганизмов к группе кишечных палочек по морфологическим и культуральным признакам.
   
10. 
    Определение бактерий группы кишечной палочки (БГКП) методом смывов. Стерильные ватные тампоны на стеклянных, металлических или деревянных палочках, вмонтированных в пробирки с ватными пробками, заготав­ливают заранее в лаборатории.В день взятия смывов в каж­дую пробирку с тампоном наливают (в условиях бокса над горелкой) по 5 мл стерильного 0,1% водного раствора пептона таким образом, чтобы ватный тампон не касался жид­кости.Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажня­ют средой.Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с по­верхности 100 см², для ограничения поверхностей использу­ют шаблон (трафарет), сделанный из проволоки. Трафарет имеет площадь 25 см², чтобы взять смывы с площади в 100 см2 его накладывают 4 раза в разных местах поверхнос­ти контролируемого объекта.
    

.