27
, 1-24, 1962.
Harrison S. C.
Virus structure: high resolution perspectives. Adv. Virus Res
., 28
, 175-240, 1983.
30.
Fraenkel-Conrat H., Williams R. C.
Reconstruction of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid components. Pro.
Natl. Acad. Sci. USA,
41. 690-698, 1955.
Harrison S. C.
Multiple modes of subunit association in the structures of simple spherical viruses. Trends Biochem. Sci
., 9,
345-
351, 1984.
Hendrix R. W.
Tail lenght determination in double-stranded DNA bacteriophage. Curr. Top. Microbiol. Immunol.,
136
, 21-29, 1988.
Hogle J. M., Chow M., Filman D. J.
The structure of polio virus. Sci. Am.,
25(3),
42-49. 1987.
Namba K., Caspar D.L.D., Stubbs G.J.
Computer graphics representation of levels of organization in tobacco mosaic virus structure. Science,
227
, 773-776, 1985.
Nomura M.
Assembly of bacterial ribisimes. Science,
179,
864-873, 1973.
31.
Mathews C.K., Kutter E.M., Mosig G., Berget P.B.
Bacteriophage T4, Chapters 1 and 4. Washington, DC, American Society of Microbiologists,
1983.
Steiner D. F., Kemmler W, Tager H. S., Peterson J. D.
Proteolytic processing in the biosynthesis of insulin and other proteins. Fed. Proc
., 33
,
2105-2115, 1974.
32.
Fersht A.
Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed. New York, W. H. Freeman, 1985.
33.
Chothia C.
Principles that determine the structure of proteins. Annu. Rev. Biochem.,
53
, 537-572, 1984.
34.
Fersht A. R., Leatherbarrow R. J., Wells T. N. C.
Binding energy and catalysis. Trends Biochem. Sci.,
11
, 321-325, 1986.
Lerner R.A., Tramontano A.
Catalytic antibodies. Sci. Am.,
258(3),
58-70, 1988.
Wolfenden R.
Analog approaches to the structure of the transition state in enzyme reactions. Accounts Chem. Res.,
5
, 10-18, 1972.
35
. Wood W. В., Wilson J. H., Benbow R.M., Hood L.E.
Biochemistry, A Problems Approach, 2nd ed. Menlo Park, CA, Benjymin-Cummings,
1981. (Chapters 9 and 15 and associated problems.)
36.
Barnes S. J., Weitzman P. D. J.
Organization of citric acid cycle enzymes into a multienzyme cluster. FEBS Lett.,
201
, 267-270, 1986.
Reed L. J., Cox D. J.
Multienzyme complexes. In: The Enzymes, 3rd ed.
171
(P.D. Boyer ed.), Vol. 1, pp. 213-240. New York, Academic Press, 1970.
37.
Adam G., Delbruck M.
Reduction of dimensionality in biological diffusion processes. InB Structural Chemistry and Molecular Biology (A.
Rich, N. Davidson eds.), pp. 198-215. San Francisco, Freeman, 1968.
Berg O. G., van Hippel P. H.
Diffusion-controlled macromolecular interactions. Anna Rev. Biophys. Biophys. Biochem.,
14,
131-160, 1985.
38.
Cantor C.R., Schimmel P.R.
Biophysical Chemistry. Part III: The Behavior of Biological Macromolecules. Chapters 15 and 17. New York, W.
H. Freeman, 1980.
Dickerson R. E., Geis I.
Hemoglobin: Structure, Function, Evolution and Pathology. Menlo Park, CA. Benjamin-Cummings, 1983.
Edelstein S. J.
Introductory Biochemistry. San Francisco, Holden-Day, 1973. (Chapter 10 on protein aggregates and allosteric interactions.)
Monod J., Changeux J.-P., Jacob F.
Allosteric proteins and cellular control systems. J. Моl. Biol.,
6,
306-329, 1963.
39.
Koshland D.E., Jr.
Control of enzyme activity and metabolic pathways. Trends Biochem. Sci.,
9,
155-159, 1984. Newsholme E. A., Start C.
Regulation in Metabolism. New York, Wiley, 1973.
40.
Koch K.-W., Stryer L.
Highly cooperative feedback control of retinal rod guanylate cyclase by calcium ions. Nature, 334, 64-65, 1988.
Nishizuka Y.
Protein kinases in signal transduction. Trends Biochem. Sci.,
9
, 163-166, 1984.
41.
Kantrowitz E.R., Lipscomb W.N.
Escherichia coli aspartate transcarbamoylase: the relation between structure and fanction Science,
241,
669-
674, 1988.
Schachman H.K.
Can a simple model account for the allosteric transition of aspartate transcarbamoylase? J. Biol. Chem.,
263
, 18583-18586,
1988.
Sprang S., Goldsmith E., Fretterick R.
Structure of the nucleotide activation switch in glycogen phosphorylase a. Science
, 237
, 1012-1019,
1987.
42.
Hill T.L.
Biochemical cycles and free energy transduction. Trends Biochem. Sci., 2, 204-207, 1977.
Hill T.L. A.
proposed common allosteric mechanism for active transport, muscle contraction, and ribosomal translocation. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA,
64,
267-274, 1969.
Johnson K.A.
Pathway of the microtubule-dynein ATPase and the structure of dynein: a comparison with actomyosin. Annu. Rev. Biophys.
Biophys. Chem.,
14,
161-188, 1985.
43.
Hokin L.E.
The molecular machine for driving the coupled transports of Na
+
and K
+
is an (Na
+
+ Reactivated ATPase. Trends Biochem. Sci.,
1
,
233-237, 1976.
Kyte J.
Molecular considerations relevant to the mechanism of active transport. Nature,
292
, 201-204, 1981.
Tanford C.
Mechanism of free energy coupling in active transport. Annu. Rev. Biochem.,
53
, 379-409, 1983.
44.
Nicholls D. G.
Bioenergetics: An Introduction to the Chemiosmotic Theory. New York, Academic Press, 1982.
45.
Alberts В. М.
Protein machines mediate the basic genetic processes. Trends Genet.,
1
, 26-30, 1985.
1724. Как изучают клетки? Клетки очень малы по размеру и сложно устроены: трудно рассмотреть их структуру, трудно определить молекулярный состав и еще труднее установить, как функционируют их отдельные элементы. Для изучения клеток разработано множество экспериментальных методов, возможности которых определяют уровень наших знаний в этой области, Успехи в изучении биологии клетки, включая наиболее удивительные достижения последних лет, как правило, связаны с применением новых методических подходов. Поэтому для понимания клеточной биологии необходимо иметь некоторое представление о соответствующих экспериментальных методах. В этой главе мы вкратце рассмотрим современные методы, используемые для изучения клеток. Мы начнем знакомиться с теми из них, которые позволяют изучать клетку как единое целое, и затем обратима к анализу составляющих клетку макромолекул. Отправной точкой станет микроскопия, поскольку клеточная биология началась со световой микроскопии, и этот метод до сих пор остается весьма эффективным инструментом исследования, наряду с более современным устройствами для получения изображения, основанными на электронных пучках или иных формах излучения. От пассивного наблюдения мы постепенно перейдем к методам, предполагающим активное вмешательство: рассмотрим, как клетки различных типов могут быть отделены от ткани и при этом сохранять способность расти, узнаем, как клетки можно разрушить, а клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы выделить в чистом виде. И наконец, мы изложим суть технологии рекомбинантных ДНК, благодаря которой стало возможным выделять, секвенировать и манипулировать генами и, следовательно, изучать механизмы их действия в клетке. 4.1. Микроскопия [1] Диаметр типичной клетки животных составляет 10-20 мкм, что в пять раз меньше мельчайшей видимой частицы. Только с появлением совершенных световых микроскопов в начале XIX века удалось установить тот факт, что все ткани животных и растений состоят из отдельных клеток. Это открытие, обобщенное в форме клеточной теории Шлейденом и Шванном в 1838 году, знаменует собой начало клеточной биологии. Будучи чрезвычайно малыми по размерам, животные клетки к тому же бесцветны и прозрачны; следовательно, открытие их основных структур стало возможным благодаря разработке набора красителей в конце XIX столетия. Именно красители обеспечили достаточный контраст для наблюдения субклеточных структур. Сходная ситуация наблюдалась в начале 40-х годов нашего столетия, когда изобретение мощного электронного микроскопа потребовало новых методов сохра- 173Рис. 4-1. Размеры клеток и клеточных компонентов, а также рабочие диапазоны светового и электронного микроскопа, изображенные в логарифмической шкале. В микроскопии принято пользоваться следующими единицами длины: мкм (микрометр) 10 -6 м, нм (нанометр) - 10 -9 м, 0 A(ангстрем) - 10 -10 м. Таблица 4-1. Основные вехи в истории световой микроскопии 1611 - Кеплер (Kepler) предложил принцип создания сложного светового микроскопа 1655 - Гук (Hook) использовал сложный микроскоп для описания небольших пор в срезах пробки, названных им «клетками» 1674 - Левенгук (Leeuwenhoek) сообщил об открытии им одноклеточных. Спустя 9 лет он впервые увидел бактерии 1833 - Браун (Brown) опубликовал свои микроскопические наблюдения над орхидеями, в которых он четко описал ядро клетки 1838 - Шлейден и Шванн (Schleiden, Schwann) предложили клеточную теорию, согласно которой структурной и функциональной единицей строения растений и животных является клетка, содержащая ядро 1857 - Колликер (Kolliker) описал митохондрии в мышечных клетках 1876 - Аббе (Abbe) проанализировал влияние дифракции на формирование изображения и показал возможность усовершенствования конструкции микроскопа 1879 - Флемминг (Flemming) с большой точностью описал поведение хромосом во время митоза у животных клеток 1881 - Ретциус (Retzius) наиболее подробно описал многие ткани животных. В течение следующих 20 лет он, Кахал (Cajal) и другие гистологи разработали методы окрашивания тканей и заложили основы микроскопической анатомии 1882 - Кох (Koch) для окрашивания микроорганизмов использовал анилиновые красители и идентифицировал бактерии, вызывающие туберкулез и холеру. В течение последующих 20 лет другие бактериологи, в том числе Клебс и Пастер (Klebs, Pasteur), выявили и описали возбудителей многих болезней, изучая окрашенные препараты под микроскопом 1886 - Цейсе (Zeiss), используя идею Аббе (Abbe), изготовил серию линз. Благодаря этому усовершенствованию, микроскописты смогли различать структуры, размеры которых были соизмеримы с теоретическим пределом разрешения для видимого света 1898 - Гольджи (Golgi), окрашивая клетки азотнокислым серебром, впервые наблюдал и описал аппарат Гольджи 1924 - Лакассань (Lacassagne) и его сотрудники разработали первые методы радиоавтографии для выявления радиоактивного полония в биологических образцах 1930 - Лебедев разработал и создал первый интерференционный микроскоп. В 1932 г. Зернике (Zernicke) изобрел фазово-контрастный микроскоп. Эти два изобретения позволили наблюдать неокрашенные живые клетки и изучать их строение 1941 - Кунс (Coons) для выявления клеточных антигенов использовал антитела, связанные с флуоресцирующими красителями 1952 - Номарский (Nomarski) разработал и запатентовал систему дифференциального интерференционного контраста для светового микроскопа, которая до сих пор носит его имя 174Рис. 4-2. Интерференция световых волн. Если две световые волны совпадают по фазе, амплитуда результирующей волны возрастает и, следовательно, яркость увеличивается. Если две световые волны не совпадают по фазе, они гасят друг друга и образуют волну, амплитуда которой (а следовательно, и яркость) уменьшается. Рис. 4-3. Эффект интерференции, который можно наблюдать при большом увеличении по краям твердого объекта, расположенного между источником света и наблюдателем. нения и окраски клеток. И только после того, как они были разработаны, начала проявляться вся сложность клеточной структуры, В основе микроскопии как методологии до сих пор лежат способы приготовления образца и возможности самого микроскопа. На рис. 4-1 сравниваются степени разрешения в современном световом и электронном микроскопах. Основные этапы развития современной микроскопии перечислены в табл. 4-1. 4.1.1. С помощью светового микроскопа можно различить объекты, отстоящие друг от друга на 0,2 мкм [2] В общем случае излучение данной длины волны может быть использовано для изучения только таких структур, минимальные размеры которых еще сопоставимы с длиной волны самого излучения. Этот фундаментальный принцип ограничивает возможности любого микроскопа. Предел разрешения светового микроскопа задается длиной световой волны, которая для видимого света лежит в пределах от 0,4 мкм (фиолетовый) до 0,7 мкм (темно-красный). Из этого следует, что самыми маленькими объектами, которые еще можно наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (их ширина 0,5 мкм). Более мелкие элементы клетки искажаются эффектами, вызванными волновой природой света. Чтобы понять природу этих эффектов, мы должны проследить за тем, что происходит со световыми волнами по мере их прохождения сквозь линзы микроскопа. Вследствие волновой природы света его луч не движется по идеально прямому пути, предсказываемому законами геометрической оптики. В реальной ситуации световые волны перемещаются сквозь оптическую систему по множеству слегка отличающихся путей. Оптическая дифракция обусловлена интерференцией световых волн, пути прохождения которых через оптическую систему несколько различаются. Если световые волны точно совпадают по фазе, т. е. гребень одной соответствует гребню другой, а впадина одной - впадине другой, то они взаимно усиливаются, и яркость возрастает. С другой стороны, если фазы волн не совпадают, они будут взаимно погашаться (рис. 4-2). Тень прямого края, например, освещенного светом одной длины волны, при большом увеличении будет выглядеть как набор параллельных линий, тогда как округлое пятно проявится в виде набора концентрических окружностей (рис. 4-3). По этой же причине отдельная точка выглядит в микроскопе, как яркое пятно, а два ближайших точечных объекта дают перекрывающиеся изображения, которые сливаются в одно. Повышение точности обработки линз не позволяет преодолеть это ограничение, поскольку оно задано волновой природой света. Предельное разрешение, при котором два объекта могут наблюдаться в отдельности, так называемый предел разрешения - зависит как от волновой природы света, так и от апертуры использованной системы линз (рис. 4-4). В наиболее благоприятных условиях - при фиолетовом свете (длина волны = 0,4 мкм) и апертуре 1,4 можно достигнуть теоретически возможного предела разрешения светового микроскопа около 0,2 мкм. Этот предел был достигнут конструкторами микроскопов в конце XIX столетия (однако в современных микроскопах, производимых серийно, достигается очень редко). И хотя изображение можно увеличить как угодно, например, проецируя его на экран, все же в световой микроскоп нельзя разрешить два объекта, если они разделены расстоянием менее 0,2 мкм: такие объекты будут выглядеть как один объект. Волновая природа света не всегда является помехой в изучении 175Рис. 4-4. Направление движения световых волн, проходящих сквозь прозрачный образец в микроскопе. Иллюстрирует концепцию апертуры и ее связь с ограничением разрешения. клеток, позже мы увидим как интерференция и дифракция могут быть использованы для изучения живых неокрашенных клеток. Но сначала необходимо обсудить методы получения постоянных препаратов клеток и то, как с помощью химических красителей можно улучшить возможности наблюдения клеточных структур в таких препаратах. 4.1.2. Для проведения микроскопических исследований ткани обычно фиксируют и режут [2] Для приготовления постоянного препарата, который можно окрасить и наблюдать в микроскоп, необходимо сначала обработать клетки фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизировать, убить и сохранить их. Используя химические термины можно сказать, что фиксация повышает доступность клеток красителям; макромолекулы клеток скрепляются поперечными сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Некоторые ранние методы фиксации включали обработку кислотами или органическими растворителями, например, спиртом. В современных методах, как правило, используется обработка альдегидами, например, формальдегидом или глутаральдегидом, которые формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и, таким образом, сшивают соседние молекулы. Толщина большинства образцов тканей слишком велика, чтобы можно было непосредственно изучать отдельные клетки при высоком разрешении. Поэтому после фиксации ткани обычно режут на очень тонкие «ломтики» (срезы) на микротоме: это прибор с очень острым металлическим лезвием, который действует подобно хлеборезке (рис. 4-5). Срезы толщиной от 1 до 10 мкм помещают на поверхность предметного стекла. Обычно ткани очень мягки и нежны даже после фиксации и их необходимо перед разделением на срезы заключать в поддерживающую среду. Как правило, в качестве заключающих сред используют парафин или специальную смолу. В жидком виде эти среды пропитывают и окружают фиксированную ткань; затем они затвер- 176Рис. 4-5. Приготовление среза на микротоме после заливки ткани. Срез предназначен для исследования с помощью светового микроскопа. девают при охлаждении или за счет полимеризации, образуя твердый блок, который удобно резать на микротоме. Существует серьезная опасность того, что процедуры фиксации или заключения могут повредить структуру клеток или клеточных макромолекул. Вот почему предложен другой метод приготовления срезов, уменьшающий эту опасность, - |
Скачать 25.6 Mb.