Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Дэвис (Ornstain, Davis) разработали более эффективные буферные системы, что позволило проводить разделение белков с высокой степенью разрешения 1966 - Мэйзел (Mayzel) для усовершенствования разделения белков в полиакриламидном геле предложил использовать додецилсульфат натрия (ДСН-SDS) 1975 - О'Фаррел (O'Farrell) разработал систему двумерного гель-электрофореза для анализа белковых смесей. Предложенный им метод представляет собой сочетание ДСН-электрофореза белков в полиакриламидном геле и изоэлектрического фокусирования 1984 - Шварц и Кантор (Schwartz, Cantor) разработали метод электрофореза в пульсирующем электрическом поле (пульс-электрофорез), используемый для разделения очень больших молекул ДНК __________________________________________________________________________________________________________________ рует сквозь блок геля и образует в нем отдельную полосу. Так осуществляется разделение во втором направлении двумерного гель-электрофореза. Неразделенными в результате остаются только те белки, которые неразличимы как по изоэлектрической точке, так и по молекулярной массе; такое сочетание встречается очень редко. Используя различные методы окрашивания белков, а в случае радиоактивно меченных белков - метод радиоавтографии (см. разд. 4.5.2), можно выявить следовые количества практически всех полипептидных цепей. За один раз методом двумерного гель-электрофореза можно разделить до 2000 отдельных полипептидных цепей; этого достаточно, чтобы выявить большинство бактериальных белков (рис. 4-52). Разрешение этого метода настолько велико, что позволяет разделить два практически идентичных белка, отличающихся одной заряженной аминокислотой. Таблица 4-9 знакомит нас с основными этапами развития методов хроматографии и электрофореза. 219 Рис. 4-53. Получение пептидной карты («фингерпринта» или «отпечатков пальцев») белков. В данном случае белок расщепляли трипсином и получили смесь мелких фрагментов полипептидов. Эту смесь фракционировали в двух направлениях: электрофорезом и распределительной хроматографией. Полученная картина пятен характеризует данный белок. 4.4.6. Избирательное расщепление белка приводит к образованию характерного набора пептидных фрагментов [29] Молекулярная масса и изоэлектрическая точка - характерные параметры белка. Однако в основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. В настоящее время в продаже имеются протеолитические ферменты и химические реактивы, расщепляющие белки по определенным аминокислотным остаткам (табл. 4-10). Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп; химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больших пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда «фингерпринтами» (отпечатками пальцев) белка (рис. 4-53). Таблица 4-10. Некоторые реактивы, используемые для расщепления пептидных связей в белках Аминокислота 1 Аминокислота 2 Фермент Трипсин Лизин или аргинин Любая Химотрипсин Фенилаланин, триптофан или тирозин » V8-Протеаза Глутаминовая кислота » Химический реактив Бромистый циан Метионин » 2-Нитро-5-тиоцианобензоат Любая Цистеин Указана специфичность в отношении аминокислот с каждой стороны от расщепляемой связи. После расщепления высвобождается карбоксильная группа по аминокислоте 1; эта аминокислота расположена слева от пептидной связи при нормальном написании (см. схему 2-5). Этот метод был разработан в 1956 г. для сравнения нормального гемоглобина с мутантной формой того же белка, обнаруживаемой в крови больных серповидноклеточной анемией. Оказалось, что мутантный белок отличается от нормального по одной-единственной аминокислоте. Так впервые было доказано, что мутация может привести к замене в белке только одной аминокислоты. 4.4.7. С помощью автоматических приборов можно анализировать короткие аминокислотные последовательности [30] Осуществив расщепление белка на мелкие фрагменты, приступают к следующему этапу - определяют последовательность аминокислот в каждом из выделенных пептидных фрагментов. Для этого проводят серию химических реакций, которые впервые были предложены в 1967 году. Сперва пептид обрабатывают каким-либо реактивом, взаимодействующим только со свободной аминогруппой на его N-конце. Далее этот реактив активируют, воздействуя на него слабой кислотой. Теперь он специфически расщепляет пептидную связь, соединяющую 220 N-концевую аминокислоту с пептидной цепью; высвобождающуяся при этом аминокислоту идентифицируют методом хроматографии. Оставшийся пептид укорачивается в результате на одну аминокислоту. Его также подвергают реакциям, проводимым в той же последовательности, - и так, пока в пептиде не будет определена каждая аминокислота. Циклический характер этих реакций дает возможность автоматизировать весь процесс. В настоящее время выпускаются приборы (аминокислотные секвенаторы), производящие автоматическое определение последовательности аминокислот в пептидных фрагментах. На последнем этапе анализа последовательности аминокислот, полученные для пептидных фрагментов, располагают в том же порядке, как они были расположены в интактной цепи. Для этого сравнивают последовательности наборов перекрывающихся фрагментов, полученных при расщеплении одного и того же белка различными протеолитическими ферментами. Усовершенствование техники секвенирования белка значительно повысило его скорость и чувствительность, позволяя анализировать минимальные количества образца. Например, в настоящее время последовательность из нескольких десятков аминокислот можно выяснить, имея в распоряжении всего несколько микрограммов белка - количество, извлекаемое из одной полосы ДСН-полиакриламидного геля. Это оказалось крайне важно для изучения многих минорных белков клетки, например, рецепторов стероидных или полипептидных гормонов. В настоящее время достаточно определить в белке 20 аминокислот, чтобы сконструировать ДНК-зонд, используемый для клонирования соответствующего гена (см. разд. 5.6.5). После выделения гена оставшаяся невыясненной часть аминокислотной последовательности белка может быть реконструирована по нуклеотидной последовательности согласно генетическому коду. Это можно считать значительным достижением, поскольку даже с полной автоматизацией определение полной первичной последовательности белка остается крайне сложной задачей. Так, например, если белок состоит из 100 аминокислот, их последовательность, если очень напряженно трудиться, можно установить за месяц. Но с удлинением цепи аминокислот сложности нарастают очень быстро, что не позволяет превратить процесс определения аминокислотной последовательности в рутинную методику. Учитывая то обстоятельство, что секвенирование ДНК - процедура более легкая и занимает меньше времени (см. ниже), в настоящее время последовательность аминокислот в большинстве белков, как правило, определяют по нуклеотидной последовательности соответствующих генов. Заключение Клеточные популяции можно анализировать биохимически, разрушая клетки и анализируя их содержимое с помощью ультрацентрифугирования. Дальнейшее фракционирование позволяет создать функциональные бесклеточные системы; такие системы необходимы для определения молекулярных деталей сложных клеточных процессов. Например, с помощью этого метода в недавнее время были исследованы синтез белка, репликация ДНК, сплайсинг РНК и различные типы внутриклеточного транспорта. Мажорные белки растворимых клеточных экстрактов можно очищать с помощью колоночной хроматографии; в зависимости от типа матрикса в колонках биологически активные белки можно разделять по их молекулярной массе, гидрофобности, характерному заряду либо сродству с иными молекулами. В ходе очистки, как правило, образец пропускают через несколько колонок - обогащенные фракции, полученные 221 Таблица 4-11. Использование некоторых радиоактивных изотопов в биологических исследованиях Изотоп Период полураспада 1) 32 Р 14 сут 131 I 8,1 сут 35 S 87 сут 14 С 5570 лет 45 Са 164 сут 3 Н 12,3 года 1) Изотопы расположены в порядке уменьшения энергии испускаемых ими электронов. 131 I испускает также γ-лучи. Период полураспада - время, в течение которого распадается 50% атомов данного изотопа. с одной колонки, наносят на следующую. После очистки белка до гомогенного состояния проводят тщательное определение его биологической активности. Можно определить также небольшой фрагмент аминокислотной последовательности белка и клонировать его ген; оставшуюся часть аминокислотной последовательности реконструируют по последовательности нуклеотидов в гене. Даже если количество белка очень невелико, его молекулярную массу и субъединичный состав можно определить, используя ДСН- электрофорез в ПААГ. В случае двумерного электрофореза белки разделяют на отдельные фракции изоэлектрическим фокусированием в одном направлении, после чего следует ДСН-электрофорез во втором направлении. Этот метод может быть использован для разделения тех белков, которые в норме считаются нерастворимыми. 4.5. Изучение клеточных макромолекул с помощью антител и радиоактивных изотопов Для изучения клеточных макромолекул можно использовать практически все свойства молекул - физические, химические и биологические. При биологическом исследовании молекулы внутри клеток выявляют обычно по оптическим свойствам (в чистом виде или в комплексе с красителями), а также по биохимической активности. Здесь мы рассмотрим два метода определения молекул внутри клеток: один из них включает использование радиоактивных изотопов, а другой - использование антител. Оба метода весьма эффективны для выявления определенных молекул в сложных смесях. Потенциально эти методы очень чувствительны и при оптимальных условиях дают возможность обнаруживать в образце молекулы, общее количество которых меньше 1000. 4.5.1. Методы выявления радиоактивных атомов отличаются высокой чувствительностью [31] Большинство известных природных элементов представляют собой смесь изотопов, различающихся массой атомного ядра, но имеющих, тем не менее, одинаковый набор электронов, а, следовательно, одинаковые химические свойства. Ядра радиоактивных изотопов, или радиоизотопов, нестабильны и подвергаются спонтанному распаду, образуя различные атомы. При распаде ядра испускаются заряженные частицы (например, электроны) или излучение (например, гамма-лучи). Вследствие своей нестабильности в природе радиоизотопы встречаются редко, но в ядерных реакторах, где стабильные атомы подвергаются бомбардировке частицами высокой энергии, их образуется чрезвычайно много (табл. 4-11). В настоящее время многие биологические молекулы стали доступны в форме, содержащей радиоактивные атомы. Для регистрации излучения, испускаемого радиоактивными изотопами, используют различные подходы. Электроны (β-частицы) можно определять по ионизации газа, которую они вызывают в счетчике Гейгера, или в сцинтилляционном счетчике по маленьким вспышкам света в сцинтилляционной жидкости. С помощью этих методов в биологическом образце можно выявить содержание определенного радиоактивного изотопа. Наличие радиоактивных изотопов в образце регистрируют и методом радиоавтографии (по их действию на зерна серебра в фотоэмульсии). Данный метод характеризуется очень высокой чувствительностью, и в благоприятных условиях с его помощью можно зарегистрировать практически каждый распад, т. е. может быть учтен практически каждый радиоактивный атом. 222 4.5.2. Радиоактивные изотопы используют для изучения перемещения молекул в клетках и в целом организме [32] Один из первых примеров использования феномена радиоактивности в биологических исследованиях - изучение превращения углерода в процессе фотосинтеза. Одноклеточные зеленые водоросли поместили в атмосферу, содержащую радиоактивно меченный СО 2 ( 14 СО 2 ), и облучали в разные промежутки времени солнечным светом. Затем радиоактивное содержимое водорослей фракционировали с помощью хроматографии на бумаге. Небольшие молекулы, содержащие атомы 14 С, происходящие из молекул СО 2 , выявляли на хроматограмме, помещая поверх высушенной бумажной хроматограммы лист фотопленки. Таким образом было идентифицировано большинство основных компонентов, образующихся в процессе фотосинтеза Сахаров из СО 2 Радиоактивные молекулы можно использовать для исследования практически всех внутриклеточных процессов. Для этого обычно в ходе эксперимента в культуральную среду добавляют предшественник в радиоактивной форме: при этом радиоактивные молекулы смешиваются с присутствующими в клетках нерадиоактивными. Клетка использует оба типа молекул, поскольку они отличаются только массой атомного ядра. Изменение локализации радиоактивных молекул в клетке или их химические превращения можно проследить во времени. Чувствительность таких экспериментов во многих случаях повышают, используя метод вытеснения метки (pulse-chase). При использовании этого метода радиоактивные вещества добавляют на очень короткое время (импульсная метка), затем их удаляют и замещают нерадиоактивными молекулами. Образцы отбирают через различные промежутки времени и в каждой такой точке определяют химическую природу и локализацию химических веществ (рис. 4-54). Значение метода радиоактивного мечения трудно переоценить. Именно этот метод дает возможность дискриминировать химически идентичные молекулы, история которых различна - например, те молекулы, которые отличаются временем синтеза. С помощью радиоактивных методов удалось определить, что почти все молекулы живой клетки постоянно разрушаются и замещаются другими молекулами. Такие медленные обменные процессы могли бы остаться незамеченными, если бы не радиоактивные изотопы. В настоящее время промышленность производит в радиоактивной форме практически все распространенные низкомолекулярные вещества. Независимо от степени сложности биологических молекул почти каждую из них можно пометить радиоактивной меткой. Часто получают радиоактивные молекулы, в структуру которых радиоактивные атомы введены в определенных положениях. Это делают для того, чтобы получить возможность следить за независимыми превращениями, претерпеваемыми различными частями одной молекулы в ходе биологических реакций (рис. 4-55). Рис. 4-54. Схема, иллюстрирующая суть типичного эксперимента с вытеснением импульсной метки. Буквами А, Б, и В помечены резервуары, которые соответствуют различным компартментам клетки (выявляемым с помощью радиоавтографии или в опытах, включающих фракционирование клетки) или различным химическим соединениям (выявляемым хроматографически или с помощью каких-либо иных химических методов). 223 Рис. 4-55. Три радиоактивные формы АТР, имеющиеся в продаже. Радиоактивные атомы выделены цветом. Приведены обозначения, с помощью которых указывается расположение и тип радиоактивных атомов. Одна из наиболее важных областей применения радиоактивных изотопов в биологии клетки - это определение локализации радиоактивных соединений в срезах клеток или живых тканей методом радиоавтографии. При использовании этого метода живые клетки подвергают кратковременному (импульсному) мечению с последующей инкубацией в течение различных промежутков времени в нерадиоактивной среде. Затем клетки фиксируют и обрабатывают для проведения световой или электронной микроскопии. Каждый приготовленный препарат покрывают тонким слоем фотоэмульсии и оставляют на несколько дней в темноте - время, в течение которого происходит распад радиоактивного изотопа. Затем фотоэмульсию проявляют. Местоположение радиоактивных молекул в каждой клетке можно определить по расположению темных зерен серебра. Если инкубировать клетки с радиоактивным предшественником ДНК ( 3 Н-тимидином), то можно увидеть, что ДНК синтезируется в ядре и там же остается. И наоборот, мечение клеток радиоактивным предшественником РНК ( 3 Н-уридином) показывает, что РНК исходно синтезируется в ядре и затем быстро накапливается в цитоплазме клеток. 4.5.3. Для выявления и выделения специфических молекул можно использовать антитела [33] Антителами называют белки, продуцируемые позвоночными животными для защиты от инфекции (см. гл. 18). Количество различных форм 224 Рис. 4-56. А. На электронной микрофотографии периферического участка эпителиальной клетки в культуре можно различить расположение микротрубочек и других филаментов. Б. С помощью метода непрямой иммуноцитохимии тот же участок окрашен флуоресцирующими антителами к тубулину, который является мономером микротрубочек (см. рис. 4-58). Стрелками указаны отдельные микротрубочки, хорошо различимые на обеих микрофотографиях (Osborn M., Webster R., Weber К., J. Cell Biol., 77, R27-R34, 1978, воспроизводится с разрешения Rockefeller University Press.) антител достигает миллиона; этим антитела и отличаются от прочих белков. Каждая форма антител обладает определенными участками связывания, которые предназначены для специфического узнавания молекул, стимулировавших синтез антител. Эти молекулы называют антигенами. Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для исследования биологии клетки. После окрашивания антител флуоресцирующими красителями их можно использовать для определения внутриклеточной локализации специфических макромолекул с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 4-56). Мечение электроноплотными микрочастицами, например, микросферами коллоидного золота, позволяет использовать антитела для локализации клеточных антигенов при помощи электронной микроскопии (рис. 4-57). Антитела могут выступать в роли биохимических звеньев для выявления и определения количества молекул в клеточных экстрактах и идентификации специфических белков после их разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При связывании антител с инертным матриксом получают аффинные колонки, пригодные для выделения и очистки специфических молекул из грубых клеточных экстрактов. Чувствительность антител, используемых в качестве зонда для выявления специфических макромолекул в клетках и тканях, часто увеличивают с помощью метода усиления сигнала. Например, такую маркерную молекулу как флуоресцирующий краситель можно прямо связывать с антителами и использовать для непосредственного определения антигена (первые антитела). Еще большего усиления сигнала можно добиться, применяя немеченые первые антитела и затем выявляя их с помощью меченых вторых антител, связывающихся с первыми антителами (рис. 4-58, А). Еще одна система усиления сигнала основана на исключительно высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). При ковалентном связывании первых антител с биотипом можно прямо пометить стрептавидин маркером и использовать его вместо вторых антител. Стрептавидин также можно применять для связывания отдельных молекул антител, меченных биотином, с разветвленной сетью молекул, меченных биотином (рис. 4-58, Б). Такие сети получают вследствие модификации метода (рис. 4-58, А) за счет применения третьего слоя антител. |