Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
4.6.7. Реакция гибридизации нуклеиновых кислот - чувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов [43] Если водный раствор ДНК нагреть до 100°С и сильно защелочить (рН 13), то комплементарные пары оснований, удерживающие две цепи двойной спирали вместе, разрушатся и ДНК быстро диссоциирует на две 238 цепи. Этот процесс, называемый денатурацией ДНК, ранее считала необратимым. Однако в 1961 году было обнаружено, что если комплементарные цепи ДНК выдержать при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали (процесс, получивший название ренатурации или гибридизации). Подобные процессы гибридизации могут происходить между двумя любыми одинарными цепями нуклеиновых кислот (ДНК—ДНК, РНК—РНК, ДНК—РНК; при условии, что они содержат комплементарные последовательности нуклеотидов. Скорость формирования двойной спирали лимитируется вероятностью столкновения двух комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот, что в свою очередь определяется их концентрацией в растворе. Скорость гибридизации может быть использована для определения концентрации любых последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие последовательности нуклеиновых кислот. Для этого теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к той последовательности, которую нужно обнаружить. Этот фрагмент ДНК можно получить клонированием, а если последовательность короткая, ее можно синтезировать химическими методами. В любом случае фрагмент ДНК интенсивно метят 32 Р (см. рис. 4-65) с тем, чтобы можно было следить за включением этой молекулы в состав дуплексов в процессе реакции гибридизации, Одноцепочечная молекула ДНК, используемая здесь в качестве индикатора, называется ДНК- зонд; она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов. Реакция гибридизации с использованием ДНК-зондов настолько чувствительна и избирательна, что с ее помощью можно идентифицировать последовательности, присутствующие в концентрации 1 молекула на клетку (рис. 4-70). Это позволяет определить, какое количество копий последовательности ДНК, комплементарной ДНК-зонду, присутствует в геноме клетки. Этот же метод весьма эффективен для поиска неидентичных, но родственных генов; например, после клонирования интересующих исследователя генов мыши или курицы, их последовательности могут быть использованы для поиска соответствующих генов в геноме человека. ДНК-зонды применяют и в реакциях гибридизации с РНК до выявления экспрессии данного гена в клетках. В этом случае ДНК-зонд, содержащий часть последовательности гена, пытаются гибридизовать с РНК, выделенной из анализируемой клетки. Если гибридизация происходит, проводят количественное определение экспрессии. Более усовершенствованные методики предполагают обработку ДНК-зонда специфическими нуклеазами для обнаружения участков, гибридизующих с клеточной РНК. Таким образом можно определить начальные и концевые участки транскриптов РНК (рис. 4-71); этот же метод может быть полезен для выяснения точных границ участков, вырезаемых из транскриптов РНК в процессе сплайсинга РНК. В процессе развития эмбриона происходит включение и выключение больших групп генов и этот процесс скоординирован. Гибридизация ДНК-зонда с клеточными РНК позволяет ответить на вопрос, работает или молчит определенный ген; более того, при изменении уровня экспрессии гена можно узнать, зависит ли это изменение от контроля, Рис. 4-70. Измерение количества копий определенного гена в образце ДНК с помощью гибридизации ДНК. Одноцепочечный радиоактивный фрагмент ДНК, используемый в таких экспериментах, называют ДНК-зондом. Хромосомная ДНК в данном случае не содержит радиоактивных атомов. 239 Рис. 4-71. Использование гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка клонированного фрагмента ДНК, который транскрибируется в мРНК. Данный метод предполагает обработку нуклеазой, расщепляющей цепи ДНК, не спаренные с комплементарной цепью РНК. Этот метод позволяет точно выявлять начало и конец молекулы РНК. Аналогичные процедуры эффективны и для определения расположения нитронов (некодирующих последовательностей эукариотических генов). действующего на уровне транскрипции ДНК, сплайсинга РНК или же трансляции зрелых молекул мРНК в белок. Методы гибридизации в современной клеточной биологии используются настолько широко, что даже трудно представить, как можно было бы без них изучать структуру генов и их экспрессию. 4.6.8. Методы Нозерн- и Саузерн-блоттинга позволяют гибридизовать молекулы нуклеиновых кислот, предварительно фракционированные с помощью электрофореза [44] Для выявления молекул нуклеиновых кислот, последовательность которых комплементарна всему зонду или его участку, ДНК-зонды часто используются в сочетании с гель-электрофорезом. Множество различных молекул РНК и ДНК, содержащихся в смеси, фракционируют электрофорезом согласно размеру и после этого проводят реакцию гибридизации; если проба метит молекулы одного или нескольких размеров, можно быть уверенным, что гибридизация достаточно специфична. В некоторых случаях очень ценной является информация даже о размере гибридизуемых молекул ДНК. Это будет проиллюстрировано следующим примером. Допустим, что перед исследователем стоит задача определить природу дефекта у мутантной мыши, синтезирующей аномально низкое количество альбумина (белка, который в норме секретируется в кровь клетками печени в значительных количествах). Для этого прежде всего необходимо взять образцы ткани печени у дефектных и нормальных мышей (последние служат в качестве контролей) и обработать клетки сильным детергентом для инактивации клеточных нуклеаз, которые в противном случае могут разрушить нуклеиновые кислоты. Затем отделяют РНК и ДНК от всех других компонентов клетки: присутствующие белки при этом полностью денатурируются, их удаляют последовательной экстракцией фенолом - мощным органическим растворителем. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе. Чтобы их отделить от низкомолекулярных клеточных соединений, проводят осаждение спиртом. После этого ДНК отделяют от РНК, пользуясь их различной растворимостью в спиртах и обрабатывают высокоспецифическими ферментами (соответственно РНКазой или ДНКазой), чтобы освободиться от нежелательных примесей нуклеиновых кислот. Для анализа РНК, кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и получают набор полос. Для того чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера: при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая 240 Рис. 4-72 . Методы «Нозерн»- и «Саузерн»-блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона («блоттинг»). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, так что радиоактивно меченными оказываются лишь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе, полученном с листа нитроцеллюлозы, эти фрагменты выявляются в виде полос. cкорость миграции молекул интересующего нас образца и молекул РНК известного размера (стандарты РНК), можно определить размеры каждой молекулы, связывающей зонд. При этом может оказаться, что клетки печени дефектных мышей синтезируют РНК альбумина в нормальных количествах и размер этих молекул соответствует норме. Если бы это было не так, выявлялось бы уменьшенное количество молекул РНК нормального альбумина. Возможен также вариант, когда молекулы РНК из дефектных клеток печени окажутся укороченными и вследствие этого будут перемещаться в геле быстрее, чем в норме. В этом последнем случае блот, содержащий дефектные молекулы РНК, можно подвергнуть повторной гибридизации с более чувствительными ДНК-зондами для выявления утраченных участков. Для анализа структуры гена альбумина дефектных мышей был использован метод Саузерн-блоттинга. В данном случае вместо РНК анализируется ДНК. Изолированную ДНК сначала обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, затем полученные фрагменты разделяют по размеру гель-электрофорезом и выявляют комплементарные ДНК-зонду альбумина с помощью переноса и гибридизации, как это описано для РНК (см. рис. 4-72). Повторяя эту процедуру с различными рестрицирующими нуклеазами, можно получить детальную рестрикционную карту генома в участке альбуминового гена (см. разд. 4.6.2). Анализируя эту карту, можно ответить на вопрос, несет ли альбуминовый ген у дефектных животных перестройки, например, делеции или инсерции коротких фрагментов ДНК. 4.6.9. Искусственные ДНК-зонды позволяют проводить дородовую диагностику наследственных болезней [45] Пока микробиологи разрабатывали методы клонирования ДНК, химики-органики усовершенствовали методы синтеза коротких фрагментов 241 ДНК. В настоящее время это делают с помощью приборов, способных автоматически синтезировать любые последовательности из 80 нуклеотидов в течение ночи. Умение получать молекулы ДНК заданной последовательности дает возможность перестраивать гены, что является важным аспектом генной инженерии (гл. 5). Существенной областью применения ДНК-олигонуклеотидов является дородовая (пренатальная) диагностика наследственных заболеваний. Более 500 наследственных болезней человека связаны с нарушением какого-то одного гена. В большинстве случаев эти мутации рецессивны. Это означает, что болезнь развивается, если человек получает дефектные копии гена сразу от обоих родителей. Одна из задач современной медицины состоит в том, чтобы выявлять такие аномальные эмбрионы до рождения, информировать об этом мать и дать ей возможность прекратить беременность. Например, для серповидноклеточной анемии известна точная нуклеотидная замена в мутантном гене (последовательность GAG заменена на GTG в цепи ДНК, кодирующей β-цепь гемоглобина). В данном случае синтезируют два олигонуклеотида. Один из них соответствует последовательности нормального гена в участке предполагаемых мутаций, другой несет замену, обусловливающую болезнь. В условиях когда эти последовательности достаточно коротки (примерно 20 нуклеотидов) и при температуре гибридизации, при которой стабильность сохраняют лишь точно совпадающие цепи, можно использовать радиоактивные зонды. Тест состоит в том, что из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости (ее получают в ходе процедуры, называемой амниоцентезом), выделяют ДНК и используют ее для Саузерн-блоттигна с радиоактивными ДНК-зондами. Дефектный эмбрион легко опознается, поскольку его ДНК будет гибридизоваться только с олигонуклеотидом, комплементарным мутантной последовательности ДНК. К сожалению, для большинства наследственных болезней дефект на уровне ДНК еще не расшифрован, однако круг заболеваний, для которых применяется дородовая диагностика, постоянно расширяется. Это стало возможно благодаря использованию феномена полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. В данном случае с помощью гибридизации выявляют наличие или отсутствие определенных сайтов рестрикции, тесно сцепленных с дефектными генами. 4.6.10. Гибридизация позволяет выявлять и отдаленно родственные гены [46] Возникновение новых генов в ходе эволюции связано с дивергенцией и дупликацией старых генов, а также объединением участков генов в новых комбинациях. По этой причине большинство генов имеют в геноме семейства родственные последовательности, часть которых, по- видимому, обладает и близкой функцией. Выделение ДНК-клона, соответствующего первому из членов такого генного семейства, - процедура весьма трудоемкая (разд. 5.6.5). Однако выделение остальных генов этого семейства упрощается, поскольку первый ген может быть использован в качестве зонда. Поскольку в родственных генах маловероятно присутствие идентичных последовательностей, гибридизацию с ДНК-зондами обычно выполняют в менее строгих условиях. Благодаря этому даже неполное соответствие последовательности зонда позволяет сформировать стабильную двойную спираль (рис. 4-73). Хотя использование нестрогой гибридизации сопровождается повышением вероятности получения фальшивых сигналов от случайных участков гомологии коротких последовательностей в неродственных участках ДНК, такая гибридизация представляет собой одно из наиболее удачных применений технологии рекомбинантных ДНК. Например, этот 242 Рис. 4-73 . Сравнение нескольких модификаций метода гибридизации, отличающихся различной жесткостью условий. В реакции слева (жесткие условия) температура раствора поддерживается лишь на несколько градусов ниже температуры денатурации полностью комплементарной спирали ДНК (ее температуры плавления). В этих условиях спирали, совпадающие не полностью и формирующиеся при пониженной жесткости (см. справа), оказываются нестабильными. Справа - указаны условия гибридизации, используемые для поиска родственных генов, не полностью идентичных гену А. подход привел к выделению всего семейства ДНК-связывающих белков, которые функционируют в качестве ключевых регуляторов экспрессии генов в ходе раннего эмбрионального развития Drosophila (см. разд. 16.5.19). Этот же подход был использован для идентификации родственных этому семейству генов из других организмов, включая человека. 4.6.11. Для локализации специфических последовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках используют гибридизацию in situ [47] Все макромолекулы клетки, и в том числе нуклеиновые кислоты, занимают в тканях и клетках строго определенное положение. Экстрагирование этих молекул из тканей или клеток путем гомогенизации приводит к потере той части информации, которая относится к расположению нуклеиновых кислот в клетках. Поэтому были разработаны методы для локализации специфических последовательностей нуклеиновых кислот in situ - в изолированных хромосомах, в определенных типах клеток, где ДНК- и РНК-зонды используются примерно так же, как меченые антитела. Этот метод называют гибридизацией in situ. Его применяют для анализа ДНК в хромосомах и РНК в клетках. Высокорадиоактивные зонды нуклеиновых кислот гибридизуют с хромосомами после кратковременного воздействия высоким рН с целью разделения пар оснований ДНК. Участки хромосом, связывающие радиоактивные зонды в процессе гибридизации, выявляются радиоавтографией. Пространственное разрешение этого метода может быт повышено при использовании не радиоактивно меченных, а химически меченных зондов ДНК. Как правило, при синтезе зондов используют нуклеотиды, содержащие боковую цепь биотина, и гибридизовавшиеся пробы выявляются при окраске стрептавидином (молекулы которого расположены в виде сети) или с помощью иных маркерных молекул (рис. 4-74). Были также разработаны методы гибридизации in situ, позволяющие судить о распределении специфических молекул РНК в клетках внутри тканей, В этом случае ткани не подвергают воздействию высоких значений рН, так что хромосомная ДНК остается в двухцепочечном состоянии и не может связывать зонд. Однако если ткань подвергнуть слабой фиксации, 243 РНК, содержащаяся в ней, при инкубации ткани с комплементарным ДНК-зондом обеспечивает возможность гибридизации. Таким способом удалось наблюдать, как реализуется дифференциальная активность генов Drosophila (рис. 4-75). Этот подход позволил существенно продвинуться в изучении молекулярных механизмов дифференцировки различных клеток эмбриона. 4.6.12. Методы рекомбинантных ДНК дают возможность изучать даже минорные белки клеток [48] До недавнего времени изучение клеточных белков было ограничено лишь мажорными фракциями, т.е. белками, содержащимися в клетках в относительно большом числе. С помощью обычных методов хроматографии и электрофореза из нескольких сот граммов клеточной массы можно получить примерно 0,1 г (100 мг) одного из мажорных белков, составляющих 1% или более от всего количества клеточных белков. Этой массы белка вполне достаточно для изучения его аминокислотной последовательности, детального анализа биологической или ферментативной (если таковая имеется) активности и получения антител, которые могут быть использованы для локализации белков в клетках. Более того, когда удается вырастить подходящие кристаллы, то с помощью рентгеноструктурного анализа можно установить трехмерную структуру молекулы. Именно таким образом была определена структура и функция многих распространенных белков, в том числе гемоглобина, трипсина, иммуноглобулина и лизоцима. Эукариотическая клетка содержит тысячи различных белков, но значительное большинство этих белков, и в том числе наиболее интересные, присутствуют в небольшом количестве. Некоторые из них иногда чрезвычайно трудно, если не невозможно, получить в чистом виде в количестве, превышающем несколько микрограмм. Разработка методов рекомбинантных ДНК сделала доступными любые клеточные белки (включая минорные белки) в больших количествах. Для этого клонируют ген нужного белка и затем встраивают его в специальную плазмиду, именуемую клонирующим вектором. Этот вектор сконструирован таким образом, что будучи введенным в бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих соответствующего типа, он обеспечивает крупномасштабный синтез этого белка. Таким образом, если раньше для детальных структурных или функциональных исследований были доступны лишь немногие белки, в настоящее время практически все белки клетки могут быть предметом подобных исследований. |