Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Рис. 4-74. Локализация гена на политенной хромосоме Drosophila с помощью гибридизации in situ с клонированным ДНК-зондом, меченным биотином. ДНК этой гигантской хромосомы частично денатурирована для гибридизации с ней зонда. После гибридизации и отмывки зонда, хромосомы обрабатывают ферментативным комплексом, в составе которого пероксидаза хрена конъюгирована со стрептавидином (см. рис. 4-58, Б). Чтобы выявить участок связывания зонда, препарат обрабатывают перекисью водорода и окрашивают; при этом пероксидаза обнаруживается в виде темной полосы на препарате (стрелка). (С любезного разрешения Tod Leverty, Gerald Rubin.) Рис. 4-75. Радиоавтограф среза очень раннего эмбриона Drosophila, подвергнутого гибридизации in situ с использованием радиоактивного ДНК- зонда, который комплементарен гену, принимающему участие в формировании сегментов ftz. Зонд гибридизуется с РНК эмбриона, и расположение зерен серебра после проявления указывает на то, что РНК, синтезируемая геном ftz, локализована в регулярных полосах, тянущихся поперек всего эмбриона. Ширина полос соответствует трем-четырем клеткам. На этих стадиях развития (клеточная бластодерма) эмбрион состоит примерно из 6000 клеток. (Из Е. Hafen, A. Kuroiwa, W. J. Gehring. Cell, 37; 833-841, 1984.) 244 4.6.13. Функция генов наиболее ярко проявляется в организме мутантов [49] Предположим, что кому-то удалось клонировать ген, кодирующий вновь открытый белок. Как установить внутриклеточную функцию данного белка? Задача эта весьма непроста, поскольку ни трехмерная структура белка, ни полная нуклеотидная последовательность гена этого белка не позволяют судить о его функции. Кроме того, многие белки, например, структурные белки и белки сложных мультиферментных комплексов, будучи отделены от других компонентов сложной функциональной единицы, в состав которой они входят, не проявляют своей обычной активности. Один из подходов, которые мы уже рассматривали (см. разд. 4.5.6) состоит в том, чтобы инактивировать определенный белок с помощью специфических антител и пронаблюдать за тем, какие клетки затронуты вследствие этого. В некоторых случаях такой способ позволяет достаточно надежно определить функцию белка, однако в отношении внутриклеточных белков он не очень эффективен, поскольку микроинъецированные антитела подвергаются разведению в процессе пролиферации клеток либо разрушаются в результате внутриклеточной деградации. Более удачное решение этой проблемы возможно с помощью генетических подходов. Мутанты, у которых отсутствует один из белков или, что более удобно, синтезируется его температурочувствительная форма (инактивируемая при небольшом повышении или понижении температуры), чрезвычайно полезны, когда перед исследователем стоит вопрос о функции белка. С их помощью идентифицированы функции ферментов, участвующих в основных метаболических путях бактерий. Благодаря этому подходу были открыты многие генопродукты, отвечающие за упорядоченное развитие эмбрионов Drosophila. Как правило, этот метод используется для изучения организмов с коротким циклом репродукции, таких, как бактерии, дрожжи, круглые черви и плодовые мушки. Воздействуя на их организм веществами, вызывающими изменения в ДНК (мутагенами), можно быстро получить большое количество мутантов и выбрать среди них тех, которые несут определенный интересующий экспериментатора дефект. Например, из популяции бактерий, подвергнутых воздействию мутагенов, были выбраны клетки, которые прекращают синтез ДНК при изменении температуры окружающей среды от 30 ° до 42 °С. Среди них было выявлено значительное число температурочувствительных мутантов, мутации в которых затрагивали бактериальные белки, участвующие в процессе репликации ДНК. Эти мутанты позже были использованы для идентификации и определения белков, необходимых для репликации ДНК. Цикл репродукции у человека очень продолжителен. К тому же никто не станет подвергать людей целенаправленному воздействию мутагенов. Более того, следует иметь в виду, что человеческий плод, имеющий серьезные дефекты жизненно важных процессов, например репликации ДНК, погибнет задолго до рождения. Однако многие мутации могут практически не оказывать влияния на жизнеспособность - например, тканеспецифические дефекты лизосом либо рецепторов клеточной поверхности, спонтанно возникающие в человеческой популяции. Анализ фенотипа этих больных, равно как и исследование их клеток в культуре, дают возможность уникального исследования важных клеточных функций. Хотя такие мутации крайне редки, тем не менее они эффективно выявляются, поскольку их носители обращаются за медицинской помощью. 245 4.6.14. Клетки и организмы, содержащие измененные гены, можно исправить [50] Получить мутантов, у которых нарушена репликация ДНК или, например, развитие глаза, в принципе довольно просто. Однако, чтобы связать этот дефект с изменением конкретного белка, могут понадобиться годы. Технология рекомбинантных ДНК дала в руки исследователей совершенно иной подход: анализ начинается с белка и завершается созданием мутантной клетки или целого организма. Поскольку такой подход по сравнению с традиционным направлением генетического анализа от гена к белку представляется обратным, его обычно называют обратной генетикой. Обратная генетика начинается с выделения из клетки нужного белка. Используя методы, описанные в гл. 5, ген этого белка клонируют и определяют его нуклеотидную последовательность; затем эту последовательность меняют биохимическими методами, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Затем такой ген вводят в клетку, где он может встроиться в хромосому в процессе гомологической рекомбинации и превратиться таким образом в постоянный элемент генома. Если встроенный ген экспрессируется, то несущая его клетка и все ее потомки будут синтезировать измененный белок. В том случае, когда измененный in vitro ген вводят в оплодотворенную яйцеклетку, получается многоклеточный мутантный организм. Некоторые из таких трансгенных организмов передадут этот ген своим потомкам в качестве постоянного элемента клеток зародышевой линии (рис. 4-76). Такая генетическая трансформация в настоящее время становится обычной процедурой для плодовых мушек или млекопитающих. В принципе на сегодняшний день совершенно реальна и трансформация человека, но такие эксперименты не выполняют из страха перед возможными генетическими нарушениями, которые нельзя исключить у лиц, ставших объектом таких исследований. 4.6.15. С помощью искусственных генов, кодирующих антисмысловые РНК, можно создавать специфические доминантные мутации [51] При введении мутантных генов в клетки бактерий или дрожжей, которые, как правило, гаплоидны, такие гены будут достаточно часто рекомбинировать с нормальными гомологами. В результате можно отобрать клетки, в которых мутантный ген заменил единственную копию нормального гена (рис. 4-77, А), например клетки, синтезирующие определенный белок в мутантной форме. Функции нормального белка можно определить, как правило, по фенотипу мутантных клеток. Что же касается высших эукариот, таких, как млекопитающие или плодовые мушки, пока еще не созданы методы, позволяющие легко заменять Рис. 4-76. Сравнение нормальной личинки Drosophila и двух мутантных личинок, содержащих дефектные гены ftz. Одна из дефектных ( ftz - ) личинок была трансформирована после инъекции в яйцеклетку, из которой она была получена клонированной ДНК, содержащей нормальную последовательность гена ftz. Эта дополнительная последовательность ДНК встроилась в одну из хромосом мухи и затем нормально наследовалась и экспрессировалась. Ген ftz необходим для нормального развития и его добавление к дефектному геному, как следует из опыта, восстанавливает сегменты личинки, отсутствующие у организмов ftz - . Методы получения трансгенных животных обсуждаются далее (см. рис. 5-88). (С любезного разрешения Walfet Gehring.) Рис. 4-77. Ген с измененной нуклеотидной последовательностью может быть введен в хромосому организма-хозяина. У бактерий и дрожжей можно отобрать мутанты, у которых (А) в результате генетической рекомбинации измененный ген занял место нормального. В этом случае в клетках сохраняются только мутантные гены. У высших эукариот вместо замены происходит добавление гена (Б). Трансформированные клетки или организмы у них содержат помимо нормальных мутантные гены. Полагают, что у организмов, для которых характерен избыток ДНК, замены генов происходят достаточно редко, поскольку для этого необходимо, чтобы мутантный ген «нашел» среди множества других последовательностей свой нормальный гомолог и спарился с ним. 246 Рис. 4-78. Использование стратегии антисмысловых РНК для получения доминантных мутаций. Были сконструированы мутантные гены, синтезирующие РНК, последовательность которых комплементарна РНК, синтезируемым нормальными генами. РНК этих двух типов способны объединяться в двухцепочечные молекулы. Если синтезируется значительный избыток антисмысловых РНК, они могут гибридизоваться и таким образом инактивировать большую часть нормальных РНК, синтезируемых геном X. Полагают, что таким образом в перспективе удастся инактивировать любой ген. В настоящее время эта методика применима лишь по отношению к некоторым генам. нормальный ген клонированным мутантным геном. Генетическая трансформация таких организмов приводит обычно к инсерции клонированного гена в случайные участки генома и при этом клетка или организм содержат мутантный ген наряду с его нормальной копией (рис. 4-77, Б). Было бы крайне полезно создание специфических доминантных мутаций в клетках высших эукариот путем введения мутантных генов, которые бы элиминировали активность их нормальных аналогов в клетке. Для этого используют весьма хитроумный и многообещающий подход, основанный на специфичности реакций гибридизации двух комплементарных цепей ДНК. Известно, что в норме только одна из двух цепей ДНК в данном участке транскрибируется в РНК и это всегда одна и та же цепь для данного гена. Если же клонированный ген был сконструирован таким образом, что транскрибируется только противоположно направленная цепь ДНК, появляется антисмысловая РНК с последовательностью, комплементарной нормальным гранскриптам РНК. В том случае, когда такая антисмысловая РНК синтезируется в достаточно больших количествах, она будет с большой частотой гибридизоваться со «смысловой» РНК, синтезируемой нормальными генами, и ингибировать синтез соответствующего белка (рис. 4-78). И если этот белок является жизненно важным для клетки или организма, описанные здесь доминантные мутанты погибнут и исследовать функции белка будет невозможно. Чтобы этого не произошло, можно сконструировать гены, синтезирующие антисмысловую РНК по команде, например, в ответ на изменение температуры или в присутствии определенной сигнальной молекулы. Клетки или организмы, содержащие такие индуцибельные антисмысловые гены, будут лишены специфического белка в определенное время, и в этом случае можно проследить за возникающим эффектом. Конечно, этот метод технически до конца еще не проработан, однако уже сейчас ясно, что он весьма перспективен для определения функции белков высших организмов. Заключение Технология рекомбинантных ДНК произвела революцию в исследовании клетки. В настоящее время с помощью рестрицирующих нуклеаз можно вырезать любой участок клеточной ДНК и вставить его в самореплици- 247 рующийся генетический элемент (плазмиду или вирус) для получения «клона геномной ДНК». С другой стороны, для получения «клона к ДНК» можно использовать ДНК-копию любой молекулы РНК. Таким образом, можно получить неограниченное количество высокоочищенной ДНК, определить ее нуклеотидную последовательность (скорость этой операции составляет сотни нуклеотидов в день), а также аминокислотную последовательность кодируемого ею белка. Методы генной инженерии позволяют синтезировать мутантные гены и вводить их в хромосомы клеток, где они в последующем превращаются в постоянный элемент генома. И если для переноса генов в качестве реципиента использовать оплодотворенное яйцо, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его своим потомкам. Для клеточной биологии исключительно важно, что описанные методы дают возможность изменять клетки строго направленным образом, что в свою очередь позволяет оценить влияние на клетку изменения структуры определенного белка. Применение технологии рекомбинантных ДНК открывает широкие перспективы. С помощью этих методов клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих могут быть преобразованы в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков или использовать их в качестве лекарственных средств. Кроме того, на технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифических ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями. Литература Общая Cantor С. R., Schimmel P. R. Biophysical Chemistry, 3 vols. New York, W. H. Freeman, 1980 (A comprehensive account of the physical principles underlying many biochemical and biophysical techniques.) Freifelder D. Physical biochemistry, 2nd ed. New York, W. H. Freeman, 1982. Van Holde K.E., Physical Biochemistry, 2nd ed. Englewood, NJ, Prentice-Hall, 1985. Цитируемая 1. Bradbury S. An Introduction to the Optical Microscope. Oxford, U. K., Oxford University Press, 1984. Fawcett D.W. A Textbook of Histology, llth ed. Philadelphia, Saunders, 1986. 2. Spencer M. Fundamentals of Light Microscopy. Cambridge, U. K., Cambridge University Press, 1982. 3. Boon M. Т., Drijver J. S. Routine Cytological Staining Methods. London, Macmillan, 1986. 4. Ploem J. S., Tanke H. J. Introduction to Fluorescence Microscopy. Royal Microscopical Society Microscopy Handbook No. 10. Oxford, U. K., Oxford Scientific Publications, 1987. Willingham M. C., Pastan I. An Atlas of Immunofluorescence in Cultured Cells. Orlando, Fl, Academic, 1985. 5. Alien R. D. New observations of cell architecture and dynamics by video-enhanced contrast optical microscopy. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 265-290, 1985. 6. Pease D. C., Porter K. R. Electron microscopy and ultramicrotomy. J. Cell Biol., 91, 287s-291s, 1981. 7. Wischnitzer S. Introduction to Electron Microscopy. 3rd ed. Elmsford, NY, Pergammon, 1981. 8. Everhart Т.Е., Hayes T.L. The scanning electron microscope. Sci. Am., 226(1), 54-69, 1972. Hayat M. A. Introduction to Biological Scanning Electron Microscopy. Baltimore, University Park Press, 1978. Kessel R.G., Kargon R.H. Tissues and Organs. New Fork, W. H. Freeman, 1979. (Атлас тканей позвоночных, исследованных с помощью сканирующего электронного микроскопа). 248 9. Sommerville J., Scheer U. eds. Electron Microscopy in Molecular Biology. A Practical Approach. Washington, D. C, IRL Press, 1987. 10. Heuser J. Quick-freeze, deep-etching preparation of samples for 3-D electron microscopy. Trends Biochem. Sci, 6 , 64-68, 1981. Pinto da Silva P., Branton D. Membrane splitting in freeze-etching. J. Cell Biol, 45 , 598-605, 1970. 11. Chiu W. Electron microscopy of frozen, hydrated specimens. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 15, 237-257, 1986. Unwin P. N. Т., Henderson R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Моl. Biol., 94 , 425-440, 1975. 12. Glusker J.P., Trueblood K.N. Crystale Structure Analysis: A Primer. Oxford, U. K., Oxford University Press, 1985. 13. Alzari P.M., Lascombe M.B., Poljak R.J. Three-dimentional structure of antibodies. Annu. Rev. Immunol., 6 , 555-580, 1980. Kendrew J.C. The three-dimentional structure of protein molecule. Sci. Am., 205(6), 96-111, 1961. Perutz M.F. The hemoglobin molecule. Sci. Am., 211(5), 64-76, 1964. 14. Cooke R.M., Cambell I.D. Protein structure determination by NMR. Bioessays, 8, 52-56, 1988. Schulman R.G. NMR spectroscopy of living cells. Sci. Am., 248(1), 86-93, 1986. Wuthrich K., Wagner G. Internal dynamics of proteins. Trends Biochem. Sci ., 9 , 152-154, 1984. 15. Amman D. Ion Selective Microelectrodes: Principles, Design and Application. Berlin, Springer-Verlag, 1986. Auerbach A., Sachs F. Patch clamp studies on single ionic channels. Annu Rev. Biophys. Bioeng., 13 , 269-302, 1984. 16. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R. Y. A new generations of Ca 2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem, 260 , 3440-3450, 1985. Tsien r. Y., Poenie M. Fluorescence ratio imaging: a new window into intracellular ionic signalling. Trends Biochem. Sci., 11 , 450, 1986. 17. Celis J.E., Graessmann A., Logter A. eds. Microinjection and Organdie Transplantation Techniques. London, Academic Press, 1986. Gomperts B. D., Fernandez J. M. Techniques for membrane permeabilization. Trends Biochem. Sci., 10 , 414-417, 1985. Ostro M.J. Liposomes Sci. Am., |