Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Рис. 4-57 . Иммуноцитохимическая локализация специфических белковых молекул на электронных микрофотографиях с помощью мечения антителами, связанными с частицами коллоидного золота. Показан тонкий срез клетки, секретирующей инсулин, где молекулы инсулина помечены антиинсулиновыми антителами, связанными с мельчайшими микросферами золота (каждая в виде черной точки). Большая часть инсулина накапливается в плотном содержимом секреторных гранул; кроме того, содержимое некоторых секреторных гранул деградирует в лизосомах. (L. Orri, Diabetology, 28, 528-546,1985.) 225 Рис. 4-58. Применение антител для выявления определенных молекул с высокой чувствительностью. А. Иллюстрация метода непрямой иммуноцитохимии, высокая чувствительность которого определяется тем, что первое антитело (так называют молекулу антитела непосредственно связывающуюся с узнаваемой молекулой антигена) опознается многими молекулами антител второго типа. Эти вторые антитела предварительно связаны с маркерными молекулами, что и позволяет их регистрировать. В качестве маркерных молекул используют красители флуоресцеин и родамин (для флуоресцентной микроскопии), фермент щелочную пероксидазу (для электронной и светлопольной микроскопии), белок ферритин, содержащий железо, или микросферы коллоидного золота (для электронной микроскопии) и фермент щелочную фосфатазу (для биохимической детекции). Б. Модификация метода, представленного на А: вместо вторых антител используют взаимодействие биотина и стрептавидина, характеризуемое высоким сродством. Поскольку каждая из молекул стрептавидина может связать четыре молекулы биотина, она соединяет множество биотинилированных маркерных молекул поперечными сшивками с образованием громадной трехмерной сети. Внизу представлен особенно чувствительный метод «сандвича», где такие сети используются для интенсивного мечения каждой из молекул первых антител. В наиболее чувствительных методах усиления сигнала в качестве маркерной молекулы используется фермент. Например, щелочная фосфатаза участвует в реакции образования неорганического фосфата, и поэтому связывание фермента со вторым антителом позволяет использовать чувствительный химический тест на фосфат для выявления комплекса антитело - антиген. Поскольку такая ферментная молекула вследствие своих каталитических свойств образует многие тысячи молекул продукта реакции, метод иммунодетекции с применением связанной формы фермента (Enzyme-Linked Immunoassay - ELISA) дает возможность обнаружить минимальное количество антигена. Данный метод хорошо зарекомендовал себя в клинической медицине для диагностики различных типов инфекций. Обычно антитела извлекают из сыворотки, обогащенной антителами, которую получают путем многократного введения антигена животным (например, кролику или козе). Эта антисыворотка содержит гетерогенную смесь антител, каждый тип которых был образован определенными клетками, синтезирующими антитела (В-лимфоцитами). Различные антитела опознают различные части молекулы антигена, а также примеси в препарате антигена. Иногда специфичность антисыворотки к различным антигенам можно повысить, удалив молекулы нежелательных антител, которые связываются другими молекулами. Например, антисыворотку, полученную к белку X, можно пропустить через аффинную колонку с антигенами Y и Z и удалить таким образом все загрязняющие анти-Y и анти-Z антитела. Однако даже в этом случае сыворотка гетерогенна, что ограничивает ее применение. 226 4.5.4. Клеточные линии гибридом служат источником моноклональных антител [34] Проблему гетерогенности антисыворотки удалось преодолеть в 1976 г. после разработки нового метода, который произвел революцию в исследовании внутриклеточных процессов с помощью антител. Этот метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только один определенный тип антител, что обеспечивает получение однородных антител в большом количестве. Время жизни В-лимфоцитов в культуре обычно весьма ограничено. Поэтому от иммунизированных мышей получают В-лимфоциты, секретирующие отдельные виды антител, и осуществляют их слияние с «бессмертными» клетками из опухоли В-лимфоцитарного происхождения. В результате образуется гетерогенная смесь гибридных клеток, из которых отбирают гибриды, способные размножаться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти так называемые гибридомы клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является постоянным источником моноклональных антител одного типа (рис. 4-59). Рис. 4-59 . Схема получения гибридных клеток, или «гибридом», синтезирующих гомогенные моноклональные антитела против определенного антигена (X). Использованная для роста клеток селективная среда содержит ингибитор (аминоптерин), блокирующий нормальные пути биосинтеза нуклеотидов. Поэтому для синтеза нуклеиновых кислот клеткам приходится использовать обходной путь (шунт) биосинтеза. Но именно этот шунт нарушен у мутантных клеток, использованных для слияния с нормальными В-лимфоцитами. Поскольку ни одна из взятых для опыта клеточных линий в этой среде размножаться не может, в ней выживают только гибридные клетки. 227 Моноклональные антитела продуцируются В-лимфоцитами одного клона, т.е. клетками, ведущими свое начало от одной-единственной клетки. Поэтому все молекулы антител данного вида обладают одинаковой специфичностью связывания антигенов. Один такой участок может опознавать, например, определенную конформацию отдельной группы из 5-6 аминокислот боковой цепи белковой молекулы и такое же количество остатков Сахаров в полисахариде. Благодаря своей строгой специфичности моноклональные антитела имеют значительное преимущество по сравнению с обычной антисывороткой, которая, как правило, содержит антитела, опознающие множество различных участков-антигенов даже в сравнительно небольшой макромолекуле. Основное преимущество метода гибридом определяется возможностью получения моноклональных антител против неочищенных молекул, содержащихся в сложной смеси в качестве минорного компонента. Это преимущество обеспечивается реальностью выбора индивидуальных гибридом, образующих антитела определенного вида, из сложной смеси различных гибридных клеток, продуцирующих множество разных антител. Таким образом в принципе можно получить моноклональные антитела против любого белка, содержащегося в клетке. Каждый тип антител можно затем использовать в качестве специфического зонда как для локализации белков с помощью цитологических методов, так и для очистки белков. Получив белки в чистом виде, мы можем исследовать их структуру и функцию. К настоящему времени выделено не более 5% из 1000 или более различных белков, которые, судя по имеющимся данным, содержатся в типичной клетке млекопитающих. Использование моноклональных антител и технологии клонирования генов (см. ниже) снимает многие сложности в идентификации и определении новых белков и генов. Проблемой для исследователей остается определение их функций. 4.5.5. Антитела и другие макромолекулы можно инъецировать в живые клетки [35] Молекулы антител можно использовать для определения функции тех молекул, с которыми они связываются. Например, у новорожденных крыс, получивших антитела к белковому фактору, который стимулирует рост нейронов, не развиваются нервные клетки определенного типа, нуждающиеся для выживания в данном факторе роста. Подобным образом антитела, реагирующие с молекулами на поверхности некоторых типов клеток, можно использовать для уничтожения этих клеток; специфически удаляя клетки определенного типа из смешанной клеточной популяции, можно определить важность клеток этого типа для осуществления различных биологических функций. Поскольку плазматическая мембрана клеток непроницаема для крупных молекул, белки, расположенные внутри живых клеток, не могут взаимодействовать с антителами, добавляемыми извне. Если такие белки необходимо связать, в цитоплазму клеток эукариот можно ввести антитела и другие молекулы, инъецируя их тонкой стеклянной пипеткой через плазматическую мембрану. Прокалываемая плазматическая мембрана имеет способность «самозапаиваться» спустя некоторое время после инъекции. С помощью этого метода было установлено, что при введении в оплодотворенное яйцо морского ежа антител к миозину, его деление останавливается, хотя деление ядер происходит нормально. Отсюда следует, что миозин выполняет ключевую роль в процессах сокращения, обеспечивающих деление цитоплазмы при митозе, но не принимает участия в работе митотического веретена. Моноклональные антитела 228 обладают высокой специфичностью, их нетрудно получить в концентрированной форме, и поэтому они особенно удобны для проведения таких исследований. Заключение В клетке можно пометить любые молекулы: для этого в них вводят один или несколько радиоактивных атомов. Нестабильные радиоактивные атомы распадаются, испуская излучение, что позволяет прослеживать судьбу исследуемых молекул. Применение радиоизотопов в клеточной биологии ограничено двумя видами экспериментов: анализ метаболических путей по методу вытеснения метки и локализацией меченых молекул в клетке с помощью радиоавтографии. Антитела представляют собой очень удобный и чувствительный инструмент для локализации специфических биологических макромолекул. В организме позвоночных животных продуцируются миллионы различных антител, в каждом из которых имеются участки связывания, опознающие специфические группы молекул. Метод гибридом позволяет получать моноклональные антитела с одинаковой специфичностью практически в неограниченных количествах. В принципе можно получать моноклональные антитела против любых макромолекул в клетке и затем использовать эти антитела для локализации или очистки определенных макромолекул, а в некоторых случаях и для анализа внутриклеточных свойств этих молекул. 4.6. Технология рекомбинантных ДНК [36] Основная проблема молекулярной биологии на сегодняшний день состоит в том, чтобы разобраться в тонких механизмах клеточных процессов. Мы обсудили несколько чувствительных методов очистки, анализа белков и слежения за ними в клетках. Этот последний раздел посвящен методам изучения структуры и функции клеточных ДНК. Классический подход подразумевает использование генетических методов, позволяющих судить о функции генов, анализируя фенотипы мутантных организмов и их потомства. Этот подход по-прежнему эффективен, но в последнее время он дополнен набором методов, которые в сумме известны как «технология рекомбинантных ДНК». Эти методы существенно расширили возможности генетических исследований, поскольку с их помощью удается проводить как прямой контроль, так и детальный химический анализ генетического материала. Используя методологию рекомбинантных ДНК, удается даже минорные клеточные белки получать в больших количествах и, следовательно, проводить тонкие биохимические исследования структуры и функции белка. 4.6.1. Технология рекомбинантных ДНК революционизировала клеточную биологию [37] Еще не так давно, всего лишь в начале 70-х годов биохимики считали, что ДНК является наиболее сложным для исследования компонентом клетки. Чрезвычайно длинную, химически монотонную последовательность нуклеотидов в наследственном материале тогда можно было исследовать лишь с помощью косвенных методов - либо определяя структуру белка или РНК, либо с помощью генетического анализа. В настоящее время ситуация крайне изменилась. Если ранее анализ ДНК представлялся исследователям структуры биологических молекул крайне трудной задачей, то теперь, когда были разработаны новые методы анализа первичной структуры ДНК, такой анализ не составляет особого 229 труда. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать их практически в неограниченном количестве и определять последовательность нуклеотидов по нескольку сот нуклеотидов в день. С помощью этих же методов можно по желанию экспериментатора изменить выделенный ген и ввести его вновь в геном культивируемых клеток или эмбрион животного (что несколько более сложно), где этот измененный ген начинает функционировать. Технология рекомбинантных ДНК оказала существенное воздействие на всю клеточную биологию, позволяя исследователям решать задачи, которые раньше казались неразрешимыми, например определять функции многих вновь открытых белков и их индивидуальных доменов, расшифровывать сложные механизмы регуляции экспрессии генов у эукариот. С помощью методов генной инженерии удалось в большом количестве получить многие белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и развитии. Применение этих методов должно принести успех в крупномасштабном промышленном производстве белковых гормонов и искусственных вакцин, на получение которых ранее затрачивали очень много сил и средств. Технология рекомбинантных ДНК включает в себя набор методов - как новых, так и заимствованных из других дисциплин, например из генетики микроорганизмов (табл. 4-12). Наиболее важные среди них это: 1) специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, что существенно ускоряет выделение и манипуляции с различными генами; 2) быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им; 3) гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большой точностью и чувствительностью на основании их способности связывать комплементарные последовательности нуклеи- Таблица 4-12. Основные вехи в развитии технологии рекомбинантных ДНК 1869 - Мишер (Miesher) впервые выделил ДНК 1944 - Эвери (Avery) установил, что ДНК, а не белок, переносит генетическую информацию при трансформации бактерий 1953- Уотсон и Крик (Watson, Crick) предложили модель двойной спирали ДНК, основанную на результатах рентгеноструктурного анализа, проведенного Франклин и Уилкинсом (Franklin, Wilkins) 1961 - Мармур и Доти (Marmur, Doty) открыли явление ренатурации ДНК, установив точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот 1962 - Арбер (Arber) впервые получил данные о существовании ферментов рестрикции ДНК, впоследствии выделенных и использованных для определения последовательности ДНК Натансом и Смитом (Nathans, Smith) 1966 - Ниренберг, Очоа и Корана (Nirenberg, Ochoa, Khorana) расшифровали генетический код 1967 - Геллерт (Gellert) открыл ДНК- лигазу - фермент, используемый для сшивания фрагментов ДНК 1972-73 - В лабораториях Бойера, Коэна и Берга (Boyer, Cohen, Berg) и их коллег в Станфордском университете и в Калифорнийском университете в Сан-Франциско была разработана технология клонирования ДНК 1975-77 - Сэнгер и Баррел (Sanger, Barrel), а также Максам и Гилберт (Махат, Gilbert) разработали методы быстрого определения нуклеотидной последовательности 1981-82 - Пальмитер и Бринстер (Palmiter, Brinster) получили трансгенную мышь; Спрэдлинг и Рубин (Spradling, Rubin) получили трансгенные экземпляры дрозофилы 230 новых кислот; 4) клонирование ДНК: интересующий исследователя ДНК-фрагмент вводят в самореплицирующийся генетический элемент (плазмиду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации воспроизводит этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий; 5) генетическая инженерия, посредством которой последовательности ДНК изменяют с целью создания модифицированных версий генов, которые затем вновь внедряют в клетки или организмы. Для того чтобы разобраться в технологии рекомбинантных ДНК, необходимо очень хорошо понимать природные механизмы, используемые клетками для репликации и расшифровки ДНК. Мы поэтому отложим детальное обсуждение клонирования генов и генетической инженерии. В гл. 5 эти вопросы будут разобраны после знакомства читателей с основными генетическими механизмами. 4.6.2. Рестрицирующие нуклеазы расщепляют ДНК в специфических участках нуклеотидных последовательностей [38] Для защиты от молекул чужеродных ДНК, способных проникнуть в клетку и вызвать ее трансформацию, многие бактерии вырабатывают ферменты рестрицирующие нуклеазы, способные разрушить чужеродную ДНК. Каждый такой фермент опознает в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме самих бактерий замаскированы метилированием остатков А и С, но любая чужеродная молекула ДНК, попав в клетку, немедленно опознается нуклеазой, и обе цепи ее ДНК разрезаются (рис. 4-60). Из различных видов бактерий было выделено множество рестрицирующих нуклеаз. В настоящее время различными фирмами производится более 100 таких ферментов, большинство из которых опознает различные последовательности нуклеотидов. Индивидуальная рестрицирующая нуклеаза способна разрезать двойную спираль ДНК любой длины с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными фрагментами (рестриктами). Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз, позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других рестрикционных участков (рис. 4-61) Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет приближенно оценить гомологию между ними. Отсюда следует, что можно проводить сравнение различных участков ДНК (сравнивая их рестрикционные Рис. 4-60. Последовательность нуклеотидов в ДНК, узнаваемая тремя широко используемыми рестрицирующими нуклеазами (участки узнавания). Такие последовательности часто содержат шесть нуклеотидов и являются «палиндромными», т. е. последовательности нуклеотидов в них в обоих направлениях читаются одинаково. Две цепи ДНК разрезаются в участке узнавания или вблизи от него, причем во многих случаях разрез проходит через обе цепи не перпендикулярно, т. е. в одном месте, а наискосок, образуя в результате липкие концы, например Eco R1 или Hind III. Рестрицирующие нуклеазы получают из различных бактерий: HpaI - из Haemophilus parainfluenzae, Eco Rl - из Escherichia coli, Hind III - из Haemophilus influenzae. |