Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
Августи-Точчо и Сато (Augusti-Tocco, Sato) адаптировали к условиям культуры клеток опухолевые клетки мыши (нейробластомы) и выделили клоны, которые реагировали на раздражение электрическим током и разрастались в нервные волокна. Одновременно получено большое количество других дифференцированных клеточных линий, включая линии скелетных мышц и печени 1975 - Келер и Мильштейн (Kehler, Milstein) получили первые клеточные линии гибридом, секретирующих моноклональные антитела 1976 - Сато (Sato) и сотрудники опубликовали первую серию статей, в которых было показано, что для роста в бессывороточной среде разным клеточным линиям необходимы различные смеси гормонов и факторов роста у этой клетки разрушаются, все хромосомы объединяются в одно большое ядро (рис. 4-40). Хотя такие гибридные клетки можно клонировать и получить гибридную клеточную линию, первичные гибридные клетки оказываются нестабильными и теряют хромосомы. По неизвестным причинам гибридные клетки «мышь - человек» в основном 208 Рис. 4-41. Препаративная ультрацентрифуга. Исследуемый образец находится в пробирках, помещенных в расположенные по кругу цилиндрические гнезда в металлическом роторе. При быстром вращении ротора развивается значительная центробежная сила, под воздействием которой частицы исследуемого образца осаждаются. В условиях вакуума трение снижается; в результате ротор не нагревается и вмонтированная в ротор система поддерживает температуру образца при 4°С. теряют хромосомы человека. В результате образуется множество гибридных линий «мышь - человек», каждая из которых содержит одну или несколько хромосом человека. Это явление оказалось полезным для картирования и локализации генов в геноме человека. Например, инсулин человека синтезируют только те гибридные клетки, которые содержат хромосому 11 человека, следовательно, ген, кодирующий инсулин, находится именно на этой хромосоме. Некоторые важные этапы развития метода культуры тканей перечислены в табл. 4-6. Заключение Клетки эмбриональных тканей и тканей новорожденных используются в качестве исходного материала для выделения специфических типов клеток, которые можно исследовать биохимически либо использовать для создания клеточных культур. Многие клетки растений и животных выживают и часто способны пролиферировать в культуральной чашке при наличии питательной среды соответствующего состава. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, в том числе в одном или нескольких белковых факторах роста. Большинство клеток животных погибает после конечного числа делений, но иногда в культуре клеток спонтанно возникают редкие варианты, способные поддерживаться бесконечно долго в виде клеточных линий. Клеточные линии можно использовать для получения клонов, которые происходят из одиночной клетки-предшественника. Так, можно выделить мутантные клетки, дефектные по одному белку. Можно осуществить слияние различных типов клеток с образованием гетерокарионов (клеток с двумя ядрами), из которых в конечном счете образуются гибридные клетки (ядра клеток которых слились воедино). Гибридные клетки можно использовать для изучения взаимодействия компонентов двух различных клеток. Кроме того, этот метод позволяет ответить на вопрос, в каких конкретно хромосомах находятся те или иные гены. 4.4. Фракционирование клеточного содержимого [23] Биохимический анализ часто сопряжен с разрушением тонкой структуры клеток. Однако в настоящее время разработаны методы мягкого фракционирования клеточного содержимого, целью которых является сохранение функции различных клеточных компонентов. Подобно тому как ткань можно разделить на составляющие клетки различных типов, клетки можно разделить на ее функциональные органеллы и макромолекулы. В этом разделе мы сосредоточим внимание на методах, позволяющих проводить очистку органелл и белков. Родственные методы мечения макромолекул радиоизотопами и антителами, равно как и чрезвычайно эффективные методы анализа ДНК и функции генов, обсуждаются в последующих разделах. 4.4.1. С помощью ультрацентрифугирования можно разделять органеллы и макромолекулы [24] Существует несколько способов разрушения клеток: их можно подвергнуть осмотическому шоку, ультразвуковой вибрации, продавить через маленькое отверстие или измельчить. При этом мембраны клеток (в том числе плазматическая мембрана и мембрана эндоплазматического ретикулума) распадаются на фрагменты, которые сразу же замыкаются, образуя мельчайшие пузырьки. При осторожном применении методов разрушения некоторые органеллы сохраняются в интактном состоянии (ядра, митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и перокси- 209 Рис. 4-42. Схематически показано фракционирование субклеточных компонентов из экстрактов клеток путем повторного центрифугирования при постепенно возрастающих скоростях. В общем случае чем меньше по размерам субклеточный компонент, тем более высокая центробежная сила требуется для его осаждения. Обычно на различных этапах центрифугирования требуются следующие условия: низкая скорость - 1000 g - 10 мин, средняя скорость - 20 000 g - 20 мин, высокая скорость - 80000 g - 1 ч, очень высокая скорость - 150000 g - 3 ч. сомы). Таким образом, суспензия клеток превращается в растворимый экстракт, содержащий довольно грубую суспензию связанных с мембранами частиц, обладающих характерными размерами, зарядом и плотностью. Было показано, что при правильном выборе среды для гомогенизации (а это требует тщательного анализа методом проб и ошибок в отношении каждой из органелл) частицы экстракта сохраняют большую часть биохимических свойств, присущих интактным органеллам в клетке. После того как в начале 40-х годов начали широко использовать препаративную центрифугу, разделение различных компонентов гомогената стало вполне реальным. Экстракты разрушенных клеток фракционируют, подвергая их высокоскоростному центрифугированию (рис. 4- 41). Такая обработка делит клеточные компоненты по их размеру: более крупные частицы при центрифугировании движутся быстрее. Крупные компоненты экстракта, в том числе ядра или неразрушенные клетки, быстро оседают (седиментируют) при относительно низких скоростях и образуют осадок на дне центрифужной пробирки. При более высокой скорости выпадают в осадок митохондрии, а при еще более высоких скоростях и длительных периодах центрифугирования осаждаются мелкие замкнутые пузырьки (микросомы), а затем рибосомы (рис. 4-42). Все эти фракции загрязнены, но если процедуру ресуспендирования осадка и центрифугирования повторить несколько раз, то многие примеси исчезнут. Центрифугирование является, как правило, первым этапом фракционирования, с его помощью разделяются только значительно отличающиеся по размеру компоненты. Чтобы достигнуть более высокой степени разделения фракций, необходимо гомогенат наслоить тонким слоем поверх солевого раствора. При центрифугировании различные фракции седиментируют с различной скоростью и образуют отдельные полосы, которые можно выделить (рис. 4-43). Во избежание перемешивания осажденных компонентов солевой раствор должен содержать инертный и хорошо растворимый материал (например, сахарозу), плотность которого постепенно увеличивается сверху вниз, формируя градиент плотности. При седиментации сквозь такие градиенты сахарозы различные компоненты клетки собираются в отдельные полосы, которые можно выделить (см. рис. 4-43). Скорость седиментации каждого из компонентов определяется его размерами и формой и обычно выражается с помощью коэффициента седиментации, обозначаемого S (см. табл. 4-7). Ротор в современных центрифугах вращается со скоростью до 80000 об/мин, так что на разделяемые частицы действуют силы, превосходящие силу тяготения более чем в 500000 раз. Под действием столь больших сил даже сравнительно небольшие макромолекулы, такие, как тРНК или простейшие ферменты, разделяются и распределяются в строгом соответствии со своими размерами. Измерение коэффициента седиментации макромолекулярных комплексов обычно используют для определения их общей массы и количества входящих в их состав субъединиц. Ультрацентрифуга разделяет клеточные компоненты не только по массе, но и по плавучей плотности. В этом случае образец седиментирует в крутом градиенте, образованном высококонцентрированным раствором сахарозы или хлористого цезия. Компоненты клеток опускаются по градиенту до тех пор, пока не достигнут участка, плотность раствора в котором равна собственной плотности компонентов. Дальнейшей седиментации компонентов не происходит и они «застревают» на этом уровне. Таким образом в центрифужной пробирке возникает набор различных полос, причем полосы прилежащие к дну пробирки, содержат 210 Рис. 4-43. Образец субклеточных компонентов наносят поверх разведенного субклеточного раствора сахарозы и осаждают при различных скоростях в зависимости от размера. В пробирке устанавливается непрерывный градиент плотности сахарозы, концентрация которого возрастает в направлении дна пробирки (обычно используют концентрацию сахарозы в пределах 5-20%). Градиент концентрации сахарозы необходим для стабилизации раствора и седиментирующих полос в условиях конвекции. После центрифугирования различные компоненты можно, как правило, собрать в отдельности. Для этого пластмассовую центрифужную пробирку прокалывают и собирают капли со дна, как это показано на рисунке. компоненты максимальной плавучей плотности. Данный метод настолько чувствителен, что с его помощью можно отделять немеченые макромолекулы от макромолекул, содержащих тяжелые изотопы 13 С или 15 N). Метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия был разработан в 1957 году для разделения меченой и немеченой ДНК, синтезированной бактериями в присутствии нуклеотидов, меченных 15 N. С помощью этого теперь уже классического эксперимента было показано, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем (см. разд. 3.2.3). 4.4.2. Детали сложных внутриклеточных процессов на молекулярном уровне можно расшифровать в бесклеточных системах [25] Изучение органелл или других крупных субклеточных компонентов, выделенных с помощью ультрацентрифугирования, чрезвычайно важно для понимания их функций в клетке. Благодаря получению очищенных фракций митохондрий и хлоропластов удалось установить ключевую роль этих органел в процессе превращения энергии. Разделение замкнутых пузырьков, образованных фрагментами гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, позволило использовать эти пузырьки в качестве функциональных моделей интактных органелл. Фракционированные клеточные экстракты, называемые также бесклеточными системами, широко используются для изучения внутриклеточных процессов. Только работая с бесклеточными экстрактами можно установить молекулярный механизм биологических процессов, поскольку лишь в этом случае исследуемый механизм может быть изучен в чистом виде - без помех, создаваемых происходящими в клетке побочными реакциями. Использование бесклеточных систем принесло первый триумфальный успех при изучении механизмов биосинтеза белка. Отправной точкой в данном случае послужил неочищенный клеточный экстракт, способный транслировать молекулы РНК в белок. После многократного фракционирования этого экстракта были получены рибосомы, РНК и различные ферменты, составляющие в совокупности аппарат биосинтеза белка. После получения отдельных компонентов в чистом виде их можно было добавлять в систему и исключать из нее и таким образом уточнять роль каждого компонента в процессе биосинтеза белка. Эта же «система трансляции in vitro» оказалась полезной для расшифровки генетического кода - с использованием в качестве матричной РНК (мРНК) искусственных полинуклеотидов известного состава. В настоящее время различные системы трансляции in vitro применяют и для определения механизмов распределения белков по различным внутриклеточным компартментам (см. разд. 8.6.6.), а также для идентификации белков, кодируемых очищенными препаратами мРНК (очистка мРНК является важным этапом в процедуре клонирования генов (см. разд. 5.6.7). В табл. 4-8 приведены некоторые даты из истории разработки методов фракционирования клеточных экстрактов. Многое из того, что мы знаем о молекулярной биологии клетки открыто при изучении бесклеточных систем. Именно так удалось выяснить механизмы репликации ДНК, транскрипции ДНК, сплайсинга РНК, мышечного сокращения и транспорта частиц по микротрубочкам. Анализ в бесклеточных системах подразумевает полное разделение всех составляющих ее индивидуальных макромолекулярных компонентов и, в частности всех белков, входящих в систему. Методы разделения белков рассматриваются в последующих разделах. 211 Таблица 4-7 . Некоторые типичные коэффициенты седиментации Частица или молекула Коэффициент седиментации, S Лизосома 9400 Вирус табачной мозаики 198 Рибосома 80 Молекула рибосомной РНК 28 Молекула тРНК 4 Молекула гемоглобина 4,5 Коэффициенты седиментации измеряются в секундах и задаются уравнением (dx/dt)/ω 2 • х, где х — расстояние от центра вращения в см, (dx/dt) - скорость осаждения (седиментация) (см/с), ω - угловая скорость вращения ротора центрифуги в радианах в секунду (рад/с). Поскольку такие коэффициенты измеряются очень малыми числами, они обычно выражаются в единицах Сведберга (S), где 1S равен 1 х 10 -13 с. 4.4.3. Для фракционирования белков можно использовать хроматографию [26] В настоящее время хроматография является одним из методов, наиболее широко используемых для фракционирования белков. Первоначально этот метод был разработан для фракционирования низкомолекулярных соединений - Сахаров и аминокислот. Наибольшее распространение получила распределительная хроматография - метод, нашедший широкое применение для разделения небольших молекул. В общей форме этот метод состоит в следующем. Каплю образца наносят на специальную бумагу (хроматография на бумаге) или пластинку стекла или пластмассы, покрытую тонким слоем инертного сорбента, например, целлюлозы или силикагеля (хроматография в тонком слое или тонкослойная хроматография). Затем такую пластинку одним концом помещают в смесь растворителей (например, воды и спирта). По мере движения растворителей по пластинке, они подхватывают те молекулы образца, которые растворяются в них. Растворители выбирают таким образом, чтобы они связывались сорбентом по-разному. В результате молекулы образца, более растворимые в связанном растворителе, движутся медленнее, а другие, более растворимые в слабо сорбированном растворителе, движутся быстрее. Через несколько часов пластинку сушат, окрашивают и определяют положение различных молекул (рис. 4-44). Белки чаще всего разделяют методом хроматографии на колонках (колоночная хроматография). В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как разные белки Таблица 4-8. Основные вехи в развитии метода ультрацентрифугирования и приготовления бесклеточных экстрактов ____________________________________________________________________________________________________________________ 1897 - Бюхнер (Buchner) показал, что бесклеточные экстракты дрожжей способны расщеплять сахара с образованием двуокиси углерода и этилового спирта. Так были заложены основы энзимологии 1926 - Сведберг (Svedberg) изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина, которая оказалась равной 68000 дальтон 1935 - Пикелс и Бимс (Pickels, Beams) несколько усовершенствовали конструкцию центрифуги, что позволило использовать ее для проведения препаративных исследований 1938 - Беренс (Behrens) использовал дифференциальное центрифугирование для разделения ядер и цитоплазмы клеток печени. Этот метод был усовершенствован в 40-х и начале 50-х годов Клодом, Браше, Хогебумом (Claude, Brachet, Hageboom) и другими исследователями, что позволило использовать его для разделения органелл клетки 1949 - Сент-Дьердьи (Sent-Geogyi) показал, что изолированные миофибриллы из клеток скелетных мышц сокращаются при добавлении АТР. В 1955 г. аналогичную бесклеточную систему использовал Хофман-Берлинг (Hofmann-Berling) для изучения движения жгутика 1951 - Бракк (Brakke) использовал центрифугирование в градиенте плотности сахарозы для очистки вирусов растений 1954 - де Дюв (de Duve) выделил методом центрифугирования лизосомы, а несколько позже пероксисомы 1954 - Замечник (Samechnik) получил первую бесклеточную систему синтеза белка. За этим открытием последовало десятилетие интенсивных исследований, завершившихся расшифровкой генетического кода 1957 - Мезелсон, Сталь и Виноград (Meselson, Stahl, Vinograd) для разделения нуклеиновых кислот разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия ____________________________________________________________________________________________________________________ 212 Рис. 4-44 . Разделение низкомолекулярных соединений методом хроматографии на бумаге. Образец наносят на старт и высушивают, а затем, используя капиллярный эффект, пропускают сквозь бумагу смесь двух растворителей. Разные компоненты образца движутся по бумаге с различной скоростью, которая зависит от относительной растворимости исследуемых компонентов в растворителе, адсорбируемым бумагой сильнее. Введение этого метода произвело революцию в биохимическом анализе в 40-х годах нашего столетия. достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями (рис. 4-45). В настоящее время разработано и применяется множество матриксов различных типов, используя которые можно делить белки согласно их заряду (ионообменная хроматография), гидрофобности (гидрофобная хроматография), размеру (хроматография гель-фильтрацией) или способности связываться различными химическими группами (аффинная хроматография). В продаже имеется значительный выбор матриксов различных типов (рис. 4-46). Ионообменные колонки набиты маленькими шариками, заряженными положительно или отрицательно. При использовании таких колонок фракционирование белков происходит в соответствии с расположением зарядов на поверхности белковых молекул. Гидрофобные колонки наполнены шариками, из которых выступают гидрофобные цепи; в таких колонках задерживаются белки с обнаженными гидрофобными участками. Колонки, предназначенные для гель-фильтрации, заполнены крошечными пористыми шариками; при использовании таких колонок происходит разделение белков по размерам. Молекулы небольшого размера по мере прохождения через колонку проникают внутрь шариков, а более крупные молекулы остаются в промежутках между шариками. В результате они быстрее проходят через колонку и выходят из нее первыми. Гель-фильтрация обычно используется и для разделения молекул, и для определения их размеров. |