Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
криоэлектронной микроскопии, где очень тонкий (примерно, 100 нм) быстро замороженный слой влажного образца помещают на микроскопическую решетку. С помощью специального приспособления гидратированный образец удерживают при — 160°С в вакууме микроскопа. Таким способом можно наблюдать материал практически непосредственно: без фиксации, окраски и сушки. Гомогенность витрифицированного водного слоя и использование недофокусированного фазового контраста позволяют получать удивительно четкие изображения таких неокрашенных образцов (рис. 4-26). Вне зависимости от использованных методов отдельные белковые молекулы дают в электронном микроскопе слабые и плохо различимые изображения. Попытки извлечь информацию за счет удлинения времени наблюдения или повышения интенсивности освещающего луча тщетны, поскольку при этом имеет место разрушение наблюдаемого объекта. Для анализа деталей молекулярной структуры необходимо объединять информацию о многих молекулах, чтобы избежать случайных ошибок, Рис. 4-26. Вирус леса Семлики в тонком слое неокрашенной вирифицированной воды (криоэлектронная микроскопия при — 160°С.) С помощью электронной обработки микрофотографий можно получить трехмерное изображение с высоким разрешением. (С любезного разрешения Jacques Duboshet; см. также S.D. Fuller, Cell, 48, 923-934, 1987.) 190 исходящих от индивидуальных изображений. Такой подход приемлем для изучения вирусов или белковых филаментов, отдельные субчастицы которых представлены в виде регулярно повторяющихся элементов; он пригоден также для изучения любых веществ, которые могут быть расположены в двумерной кристаллической решетке, где значительное число молекул сохраняют одинаковую ориентацию или разделены одинаковыми промежутками. Используя электронные микрофотографии структур, ориентированных подобным образом, можно применить методы обработки изображения и высчитать среднее изображение отдельных молекул, выявив детали, приглушенные случайным «шумом» исходного снимка. Реконструкции изображения по этому методу позволяют получить детальную структуру оболочки вируса с разрешением в 3,5 нм, а детали формы индивидуальных макромолекул можно исследовать с разрешением 0,5 нм (5 А). Но даже наиболее изощренные методы электронной микроскопии не дают возможность полностью описать молекулярную структуру, поскольку атомы в молекулах разделены расстоянием около 0,1- 0,2 нм. Для изучения молекулярной структуры макромолекул на атомарном уровне необходимы иные методы - методы. в которых вместо электронов используются рентгеновские лучи. 4.1.13. Детальная структура молекул, образующих кристаллическую решетку, может быть рассчитана на основании полученных дифракционных картин [12] Рентгеновские лучи, подобно свету, являются одной из форм электромагнитного излучения, но вследствие того, что длина волны рентгеновских лучей значительно короче, их применение позволяет разрешить значительно более мелкие детали. Однако в отличие от видимого света или потока электронов, рентгеновские лучи нельзя сфокусировать и после их прохождения через образец получить обычное изображение. Однако структуру образца можно выявить, используя метод дифракции рентгеновских лучей. Сперва рассмотрим одиночный объект (например, отдельную молекулу), расположенный на пути любого излучения, длина волны которого меньше размеров объекта. Объект будет рассеивать часть излучения. Рассеянное излучение можно рассматривать как набор перекрывающихся волн, каждая из которых отражается разными участками объекта. Если волны перекрываются, они подвергаются интерференции и возникает распределение излучения, известное как дифракционная картина. Дифракционная картина может быть зарегистрирована на фотопластинке, помещенной на некотором расстоянии от предмета, или представлена с помощью количества рассеянного излучения, отраженного объектом в разных направлениях (рис. 4-27). Форма дифракционной картины определяется структурой объекта. С другой стороны, исходя из полного описания дифракционной картины, можно теоретически рассчитать структуру данного объекта. Опыт показывает, что дифракционная картина для отдельной молекулы чересчур слаба и недостоверна, и потому ее нельзя использовать в качестве отправной точки для теоретического анализа. Предположим, что множество идентичных объектов расположено в кристаллической решетке и на них направлен пучок каких-то лучей (рис. 4-28). В этом случае общее количество рассеянного излучения значительно выше. Однако излучение, рассеянное одной молекулой, будет интерферировать с излучением, рассеянным другими молекулами. В некоторых направлениях индивидуальные рассеянные лучи будут усиливаться, образуя на дифракционной картине яркое пятно. Полная 191 Рис. 4-27. Рассеивание излучения одиночным объектом, размеры которою соизмеримы с длиной волны излучения. Излучение, падающее на объект, рассеивается в разных направлениях и с разной интенсивностью. Интенсивность излучения, рассеиваемого в данном направлении, зависит от интерференции излучения, рассеиваемого различными участками объекта. О результирующей интенсивности рассеивания во всех возможных направлениях можно судить по числу окрашенных лучей на диаграмме. Рис. 4-28. Рассеивание излучения кристаллом. Если многие идентичные объекты расположены в виде кристаллической решетки, излучение, рассеиваемое каждым объектом, интерферирует с излучением, рассеиваемым другими объектами. Отдельные отраженные лучи рассеиваются только в определенных направлениях (в зависимости от пространственного расположения объекта в решетке), образуя яркие пятна. Интенсивность данного яркого пятна зависит от интенсивности, с которой каждый объект в решетке мог бы рассеивать излучение в данном направлении, если бы его исследовали в отдельности, как это показано на рис. 4-27. Рис. 4-29 . Часть рентгенограммы кристалла белка. Именно этот кристалл был использован для определения расположения атомов в молекуле протеолитического фермента трипсина. (С любезного разрешения Robert Stroud.) 192 Рис. 4-30. Кристаллы фермента гликоген-фосфорилазы при наблюдении в световой микроскоп. (С любезного разрешения Robert Fletterick.) дифракционная картина кристаллической решетки будет состоять из множества ярких пятен различной интенсивности (рис. 4-29). Относительная интенсивность различных пятен в дифракционной картине зависит от способности различных объектов в решетке рассеивать излучение. В действительности интенсивность данного пятна пропорциональна интенсивности излучения, которое будет отражаться в данном направлении от характерного одиночного объекта. Таким образом, положение пятен в дифракционной картине зависит от расположения объекта в системе, а их интенсивность дает информацию о внутренней структуре типичного объекта. Более того, такая информация является точной и достаточной, поскольку она была получена путем объединения вкладов множества равноценных источников. На самом деле, пользуясь довольно полным описанием дифракционной картины такой решетки, можно зачастую вычислить структуру отдельных объектов, образующих кристаллическую решетку. 4.1.14. Дифракция рентгеновских лучей дает возможность выявить трехмерную организацию атомов в молекулах [13] Если для анализа молекулярной структуры предполагается использовать дифракционные картины, то излучение, претерпевающее дифракцию, должно иметь длину волны более короткую, чем расстояние между атомами в молекуле. Длина волны рентгеновских лучей около 0,1 нм (что соответствует диаметру атома водорода), и поэтому данный тип излучения идеально подходит для анализа расположения индивидуальных атомов в молекулах. Такую задачу нельзя решить даже на самых современных электронных микроскопах. Существенным преимуществом рентгеновских лучей является высокая (выше, чем у электронов) проникающая способность. Это делает пригодными для анализа более толстые образцы. И наконец, поскольку в данном случае использование вакуума не предусмотрено, можно изучать толстые водосодержащие образцы. Вследствие этого исключаются артефакты, возникающие в процессе приготовления образца. Для достижения высокого разрешения необходимо иметь кристаллы с высокой степенью упорядоченности (рис. 4-30). По мере прохождения через образец рентгеновские лучи рассеиваются электронами атомов, составляющими образец. Поэтому большие атомы с большим количеством электронов рассеивают рентгеновские лучи более эффективно, чем небольшие атомы, так что атомы С, N, О, Р регистрируются гораздо более надежно, чем атомы Н; известно, что очень тяжелые атомы тоже рассеивают рентгеновские лучи очень эффективно. Процесс преобразования рентгенограммы в трехмерную структуру атомов, уложенных в молекулу, весьма сложен. Расшифровка рентгенограмм, образованных крупными и неупорядоченными молекулами белков, до 1960 года была невозможна (табл. 4-3). Эта процедура требует локализации и оценки интенсивности сотен тысяч пятен, равно как и фаз волн каждого пятна. В последние годы рентгеноструктурный анализ все более автоматизируется. Рассеянные рентгеновские лучи измеряются изощренными электронными детекторами, что существенно ускоряет процесс накопления данных, а мощные компьютеры выполняют множество необходимых вычислений. В настоящее время наиболее длительным этапом в подобном исследовании является этап получения подходящих кристаллов исследуемых макромолекул; зачастую на подбор оптимальных условий кристаллизации уходят годы. Но, несмотря на эти трудности, рентгеноструктурный анализ нашел широкое применение, поскольку до настоящего времени остается единственным 193 Таблица 4-3. Основные вехи в развитии метода рентгеноструктурного анализа и его применение в исследовании биологических молекул 1864 - Хоппе-Зейлер (Hoppe-Seyler) получил в кристаллическом виде гемоглобин и предложил для него название. 1895 - Рентген (Roentgen) наблюдал образование новой формы проникающей радиации при попадании катодных лучей (потока электронов) на металлическую мишень. Это излучение было названо Рентгеном Х-лучами (в русской научной литературе «рентгеновские лучи») 1912 - фон Лауэ (Von Laue) получил первую рентгенограмму, пропуская рентгеновские лучи через кристалл сульфида цинка 1912 - В. Л. Брэгг и В. Х. Брэгг (W. L. Bragg, W. Н. Bragg) обнаружили простую взаимосвязь между характером дифракционной картины и расположением атомов в кристалле 1926 - Самнер (Sumner) получил кристаллы уреазы из экстрактов канавалии мечевидной й показал, что эти белки обладают каталитической активностью 1931 - Полинг__(Pauling)_опубликовал_свою_работу_«Природа_химических_связей»,_в_которой_уточнил_правила_ковалентного_связывания_1934_-_Бернал_и_Кроуфут'>Полинг (Pauling) опубликовал свою работу «Природа химических связей», в которой уточнил правила ковалентного связывания 1934 - Бернал и Кроуфут (Bernall, Crowfoot) представили первую подробную рентгенограмму белка, полученную для кристаллов фермента пепсина 1935 - Паттерсон (Patterson) разработал аналитический метод определения расстояния между атомами по данным рентгеноструктурного анализа 1941 - Эстбюри (Astbury) получил первую рентгенограмму ДНК 1951 - Полинг и Кори (Pauling, Corey) обосновали существование двух основных типов укладки цепи L-аминокислот (в виде α-спирали и складчатого β-слоя), которые были позже обнаружены во многих белках 1953 - Уотсон и Крик (Watson, Crick) предложили модель двойной спирали ДНК на основе рентгенограмм, полученных Франклин и Уилкинсом (Franklin, Wilkins) 1954 - Перутц (Perutz) и сотрудники разработали метод тяжелых атомов для решения проблемы фазы в кристаллографии белка 1960 - Кендрью (Kendrew) впервые подробно описал структуру белка (миоглобина кашалота) с разрешением 0,2 нм, а Перутц (Perutz) - структуру более крупного белка - гемоглобина, но в этом случае разрешение было несколько хуже 1966 - Филлипс (Phillips) впервые подробно описал структуру белка лизоцима 1976 - Ким, Рич, Клуг (Kim, Rich, Clugh) и сотрудники, использовав данные рентгеноструктурного анализа, подробно описали структуру тРНК 1977-78 - Холмс и Клуг (Holmes, Clugh) определили структуру вируса табачной мозаики (ВТМ), а Гаррисон и Россман (Harrison, Rossman)- структуру двух сферических вирусов методом определения детального расположения атомов в большинстве молекул. Имея хорошие кристаллы, можно рассчитать структуру белка с разрешением 0,3 нм и выявить не только основные закономерности расположения полипептидной цепи, но и некоторые более мелкие детали. Затратив значительные усилия, можно получить кристаллы высокого качества, что в свою очередь позволяет достичь разрешения 0,15 нм и определить расположение почти всех неводородных атомов в молекуле белка. Именно таким образом к настоящему времени были установлены структуры более сотни белков и нескольких малых молекул РНК и ДНК. Заключение Для наблюдения клеток существует множество методов световой микроскопии. Окрашенные и фиксированные клетки можно наблюдать с помощью обычной оптики. Использование флуоресцентного микроскопа 194 и меченых антител позволяет локализовать в клетках специфические молекулы. Клетки в естественном живом состоянии анализируют под фазово-контрастной, интерференционной или темнопольной оптикой. Светомикроскопические исследования живых клеток подкрепляются обработкой изображений с помощью электроники, что существенно усиливает чувствительности и увеличивает разрешение. Определение подробной структуры мембран и органелл в клетках возможно только при высоком разрешении, которое дает просвечивающий электронный микроскоп. Просвечивающий электронный микроскоп также используют для определения формы индивидуальных макромолекул, оттененных тяжелыми металлами или негативным контрастированием. Однако точное расположение каждого атома в молекуле можно определить только после образования молекулами крупных кристаллов. В этом случае с помощью рентгеноструктурного анализа может быть рассчитана полная трехмерная структура молекулы. 4.2. Изучение химической среды в живых клетках Классические методы микроскопии позволяют судить о клеточной архитектуре, но не дают подробной информации о клеточной химии. Мы уже говорили о том, что для локализации в клетках специфических макромолекул можно использовать антитела. Но столь же важно знать распределение и концентрацию малых молекул. Поддержание жизни возможно только при быстрой и точной регуляции концентрации таких важнейших метаболитов, как АТР, глюкоза и неорганические ионы; содержание этих веществ в различных участках клеток и тканей может существенно варьировать. Более того, поскольку низкомолекулярные вещества, такие, как клеточный АТР, кальций и водород могут выполнять функцию внутриклеточных «мессенджеров», очень важно уметь прослеживать изменение их концентрации в ответ на внутриклеточные сигналы. В этом разделе мы будем обсуждать некоторые методы, заимствованные из химии, методы, которые позволяют определять химические условия в клетках в процессе их жизнедеятельности. 4.2.1. Для определения химических условий в популяции живых клеток можно использовать ядерный магнитный резонанс (ЯМР) [14] Ядра многих атомов характеризуются магнитным моментом: следовательно, они, подобно магнитным стрелкам, обладают внутренним магнетизмом. Магнитные характеристики этих атомов подвержены влиянию со стороны окружающих атомов. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), являющийся безвредным для живых клеток, позволяет определить химическую природу вещества. Если ядра атомов, обладающие магнитным моментом, поместить в магнитное поле, они принимают одну из возможных ориентации. Каждая из ориентации характеризуется энергией, определяемой силой поля и химическим окружением. При облучении радиоволнами набора атомов в идентичном химическом окружении, энергия этих волн будет в значительной степени абсорбироваться, если волны обладают строго определенной частотой, соответствующей разности энергетических состояний двух возможных ориентации ядер в магнитном поле. Это так называемая резонансная частота. Образец ткани содержит атомы в различных молекулах и в различном окружении и будет поглощать энергию на различных резонансных частотах. Диаграмма поглощения на резонансных частотах для данного образца составит его спектр ЯМР. Такой 195 спектр отражает структуру и относительное содержание каждого типа молекул, содержащих магнитные ядра. В химических лабораториях ЯМР широко используется как аналитическая методика для определения структуры малых молекул в растворах. Совершенствование приборного парка сделало возможным применение метода ЯМР для изучения биологических объектов. Например, сигнал ЯМР, исходящий от протонов (ядер водорода), часто используется для изучения белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул в растворе: взаимодействие частей макромолекулы влияет на спектр ЯМР, и поэтому спектр ЯМР содержит подробную информацию о молекулярной структуре и молекулярных движениях. В отличие от рентгеноскопии ЯМР не требует кристаллизации образцов. Однако для создания содержательного спектра ЯМР молекулы в растворах должны быстро «кувыркаться». Этим и объясняется существование верхнего предела (около 20 тыс. дальтон), ограничивающего размеры макромолекул, конформация которых может подвергаться эффективному анализу. Лишь некоторые атомы имеют изотопы, создающие удовлетворительный сигнал ЯМР. Для изучения макромолекул, содержащихся внутри живой клетки, обычно используют широко распространенные Рис. 4-31. Спектр ЯМР 31 Р, записанный с мышцы лягушки (А -в расслабленном состоянии, Б после 15 мин стимулируемой активности в анаэробных условиях, В после 50 мин такой активности). Пять меченых пиков на спектре представляют сигналы от ядер Р, находящихся в различных атомах: один пик соответствует фосфокреатину, α, β и γ -трем фосфатным группам АТР и PI - неорганическому фосфату. В расслабленной мышце фосфокреатин содержится в высокой концентрации (А); он выполняет функцию депо свободной энергии в скелетных мышцах, поскольку его фосфат прямо переносится на ADP для восстановления АТР, гидролизуемого в процессе мышечного сокращения. Следовательно, в уставшей мышце депо фосфокреатина снижается, а концентрация неорганического фосфата (образующегося из АТР) соответственно возрастает. Пик Рi также слегка смещается влево, отражая изменение клеточного рН за счет накопления молочной кислоты - побочного продукта анаэробного метаболизма. По расположению пика Pi, сравниваемого с таковым для известного стандарта, можно рассчитать, что в данном случае рН изменился от 7,5 (А) до 6,4 (В). (Изменено с разрешения M.J. Dowson, D. J. Gedian, D.R. Wilkie, Nature, 274, 861-866, 1978. Copyright 1978 McMillan Magazine Ltd.) |