Молекулярная биология клетки. Том 1. Молекулярная биология клетки 2Molecular Bruce Alberts, Dennis Bray,Biology
 Скачать 25.6 Mb.
|
|
быстрое замораживание. Здесь можно обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань просто режут на криостате - специальном микротоме, установленном в холодной камере. Полученные таким образом срезы позволяют избежать некоторых артефактов, и в то же время обладают определенными недостатками: отдельные структуры индивидуальных макромолекул, таких, например, как белки, при замораживании сохраняются хорошо, но структура самой клетки может оказаться поврежденной. Следующий этап после приготовления срезов (любым из методов) - их окраска. 4.1.3. Различные компоненты клетки можно окрашивать по-разному [3] В содержимом большинства клеток, состоящих, как правило, на 70% из воды, практически отсутствуют компоненты, способные помешать прохождению световых лучей. Поэтому в естественном состоянии большинство клеток даже после фиксации и приготовления срезов практически невидимы в обычном световом микроскопе. Одна из возможностей их увидеть состоит в окраске клеток красителями. В начале XIX столетия ввиду потребности в красителях для текстильной промышленности, органическая химия переживала очень плодотворный период. Оказалось, что некоторые из этих красителей также способны окрашивать биологические ткани. К удивлению исследователей, некоторые из этих красителей обладали определенным сродством к специфическим компонентам клетки - ядру или митохондриям, окрашивая их внутренние структуры и делая их доступными для изучения под микроскопом. В настоящее время известен широкий набор органических красителей. Многие из них обладают весьма колоритными названиями: малахитовый зеленый, судан черный, кумасси голубой; каждый краситель характеризуется сродством к определенным субклеточным компонентам. Например, краситель гематоксилин имеет сродство к отрицательно заряженным молекулам и поэтому выявляет распределение в клетках ДНК и кислых белков. Химическая природа специфичности многих красителей до сих пор неизвестна. Накопление опыта в клеточной химии сопровождалось отбором наиболее рациональных и избирательных методов окраски и, в частности, методов, позволяющих отличать специфические белки либо иные макромолекулы клеток. Здесь же возникла проблема чувствительности. Поскольку большинство макромолекул представлены в клетках относительно незначительным числом копий, одна или две молекулы красителя, связанные с макромолекулой, могут оставаться незамеченными. Один из путей разрешения этой проблемы состоял в увеличении числа молекул красителя, ассоциированных с отдельными клеточными молекулами. По каталитической активности в клетках удалось локализовать многие ферменты: при достаточном обеспечении соответствующим субстратом каждая молекула фермента создавала множество молекул видимого продукта реакции. Альтернативный подход к проблеме чувствительности состоит в использовании флуоресценции. В данном случае можно на темном фоне выявлять специфические красители по свету, который они и только они излучают, будучи соответствующим образом возбуждены. Далее мы переходим к объяснению этого феномена. 177 4.1.4. Специфические молекулы могут быть локализованы в клетках с помощью флуоресцентной микроскопии [4] Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой длины волны, более длинной. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа. Такой микроскоп похож на обычный световой микроскоп, но здесь свет от осветителя, излучаемый мощным источником, проходит через два набора фильтров - один для задержания света перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает на окуляр свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции (рис. 4-6). Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Например, флуоресцирующие красители могут быть связаны с молекулами антител, что сразу же превращает их в высокоспецифические и удобные красящие реагенты, селективно связывающиеся со специфическими макромолекулами на поверхности живой либо внутри фиксированной клетки (см. разд. 4.5.3). Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом (рис. 4-7). Применяя Рис. 4-6. Оптическая система современного флуоресцентного микроскопа состоит из двух избирательных фильтров и дихроического (смешивающего лучи) зеркала. Здесь указан набор фильтров, используемых для выявления свечения флуоресцеина. Для микроскопа этого типа важно наличие в объективе линз, характеризуемых высокой апертурой, так как для данного увеличения яркость изображения пропорциональна одной четвертой апертуры (см. также рис. 4-4). 178 Рис. 4-7. В флуоресцентной микроскопии обычно используют два красителя флуоресцеин и тетраметилродамин, структуры которых представлены на данном рисунке. Флуоресцеин излучает желто-зеленый свет после активации светом соответствующей длины волны. Родамин излучает красный свет. Часть молекулы, обозначенная цветом, указывает на расположение химически активной группы; в этом положении, как правило, формируется ковалентная связь между красителем и белком (или иной молекулой). В настоящее время промышленность выпускает несколько вариантов этих красителей с различными типами реакционно-активных групп, что позволяет «нацелить» этот краситель либо на SH-группы, либо на NН 2 -группы белка. для окраски флуоресцеин и родамин, можно изучать распределение различных молекул, два вида молекул будут выявляться в микроскопе после простого переключения двух наборов фильтров, каждый из которых специфичен для одного из красителей (рис. 4-8). Далее мы переходим к обсуждению новых важных методов, которые позволяют использовать флуоресцентную микроскопию для анализа изменений концентрации и расположения специфических макромолекул в живых клетках (разд. 4.1.9). 4.1.5. Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки[2] Возможность потери или нарушения образцов в процессе их приготовления всегда беспокоила микроскопистов. Единственный способ решить эту проблему состоит в изучении живых клеток без фиксации или замораживания. Для этой цели очень полезны микроскопы со специальными оптическими системами. При прохождении света через живую клетку фаза световой волны меняется согласно коэффициенту рефракции клетки: свет, проходящий через относительно тонкие или относительно толстые участки клетки, такие, как ядро, задерживается, и его фаза соответственно сдвигается по отношению к фазе света, проходящего через относительно тонкие Рис. 4-8. Флуоресцентная микрофотография участка поверхности ранних эмбрионов Drosophila, микротрубочки которых были помечены антителами, связанными с флуоресцеином (слева), а актиновые филаменты - антителами, меченными родамином (в центре). Кроме того, хромосомы были помечены третьим красителем, который флуоресцирует, только связавшись с ДНК (справа). На этой стадии все ядра эмбриона расположены в общей цитоплазме и не разделены клеточными стенками; они находятся в метафазе митоза. Все три микроснимка были сделаны с одного участка фиксированного эмбриона с использованием трех различных наборов фильтров в флуоресцентном микроскопе (см. также рис. 4-6). (С любезного разрешения Tim Carr). 179 Рис. 4-9. Два способа увеличения контраста в световой микроскопии. А. Окрашенные участки клетки уменьшают амплитуду проходящих световых волн определенной длины. В результате можно получить окрашенное изображение, видимое при прямом наблюдении. Б. Амплитуда световых волн, проходящих через неокрашенную живую клетку, практически не меняется; поэтому многие детали нельзя увидеть при прямом наблюдении. Здесь, однако, имеет место изменение фазы проходящего света явление, используемое в фазово-контрастном и интерференционном микроскопах для получения высококонтрастного изображения. Рис. 4-10 . Фибробласт в культуре ткани при наблюдении с помощью четырех различных типов световой микроскопии. А. Изображение получено при прямом прохождении лучей через клетку (микроскопия в светлом поле). Остальные изображения получены с помощью методов, рассматриваемых в тексте: Б - фазово-контрастная микроскопия; В -интерференционная микроскопия; Г микроскопия в темном поле. Простая замена компонентов оптики большинства современных микроскопов позволяет получать все четыре типа изображения. 180 Рис. 4-11. Изображение неокрашенных микротрубочек, наблюдаемое в интерференционном микроскопе. А. Исходное необработанное изображение; Б. Изображение, полученное после электронной обработки, существенно увеличивающей контраст и снижающей «шум». Хотя диаметр микротрубочек всего 0,025 мкм, вследствие дифракции они выглядят, как значительно более толстые филаменты. (С любезного разрешения Вruсе Sohnapp.) участки цитоплазмы. Как в фазово-контрастном, так и в интерференционном микроскопе используются эффекты интерференции, возникающие при рекомбинации двух наборов волн, которые и создают изображение клеточных структур (рис. 4-9). Оба типа световой микроскопии широко используются для наблюдения живых клеток. Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры - наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопе лучи от осветителя направляются сбоку и при этом в линзы микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Изображение одной и той же клетки, полученное четырьмя способами световой микроскопии, показано на рис. 4-10. Одним из основных преимуществ фазово-контрастной, интерференционной и темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе митоза и миграции. Клеточные движения, как правило, совершаются очень медленно и их сложно наблюдать в реальном времени. В этом случае используют покадровую (цейтраферную) микрокиносъемку или видеозапись. Последовательные кадры при этом разделены во времени, но при воспроизведении записи с нормальной скоростью картина реальных событий ускоряется. 4.1.6. Изображение можно усиливать или анализировать с помощью электронных методов [5] В последние годы видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности световой микроскопии. Благодаря их применению удалось не только преодолеть трудности, связанные с несовершенством оптической системы, но и решить проблемы, обусловленные особенностями физиологии человека. Они состоят в том, что: 1) глаз не регистрирует очень слабый свет; 2) глаз не способен фиксировать небольшие отличия в интенсивности света на ярком фоне. Первая из этих проблем была преодолена после присоединения к микроскопу сверхвысокочувствительных видеокамер (подобных тем, которые используются при ночных съемках). Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света (или тепла). Системы усиления изображения особенно важны для изучения в живых клетках флуоресцирующих молекул. Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации. Эти и подобные методы обработки изображения позволяют компенсировать оптические недостатки микроскопов и практически достичь предела разрешения. Более того, используя современные видеосистемы, контраст может быть усилен настолько, что преодолеваются ограничения глаза в детектировании небольших отклонений интенсивности света. Хотя этот процесс усиливает случайные отклонения фона в оптической системе, такой «шум» может быть устранен специальными методами. Таким образом, благодаря современным подходам мы получили возможность анализировать прозрачные объекты, ранее не отличимые от фона. Высокий контраст, достижимый с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки (рис. 4-11), диаметр 181 Рис. 4-12. Электронная микроскопия тонкого слоя золота позволяет выявить отдельные атомы в виде отдельных ярких пятен. Расстояние между соседними атомами золота около 0,2 нм. (С любезного разрешения Graham Hills.) которых менее одной десятой длины волны света (0,025 мкм). Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии (см. рис. 4-56). Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается (0,2 мкм), что не позволяет отличать отдельные микротрубочки от пучка из нескольких микротрубочек. Для решения этой задачи необходим электронный микроскоп, предел разрешения которого сдвинут далеко за пределы длины волны видимого света. 4.1.7. Электронный микроскоп позволяет анализировать тонкую структуру клетки [6] Взаимосвязь длины волны света и предела разрешения (см. рис. 4-4) сохраняется для любой формы излучения, как для световых лучей, так и для электронов. Однако в последнем случае предел разрешения существенно ниже. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронном микроскопе с напряжением 100000 В длина волны электрона равна 0,004 нм, а согласно теории, разрешение такого микроскопа составляет 0,002 нм. Однако коррекция аберрации электронных линз - задача более сложная, чем для стеклянных линз, и поэтому в реальности разрешение современных электронных микроскопов в лучшем случае 0,1 нм (1 А) (рис. 4-12). Более того, трудности приготовления образца, его повреждение излучением существенно снижают нормальное разрешение, которое для биологических объектов составляет 2 нм (20 А) (т.е. примерно в 100 раз выше, чем у светового микроскопа). Некоторые из достижений в развитии электронной микроскопии перечислены в табл. 4-2. Общая схема просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) напоминает схему светового, хотя электронный микроскоп значительно больше и как бы перевернут (рис. 4-13). Источник излучения - нить катода, испускающая электроны с вершины цилиндрической колонны высотой около двух метров. Поскольку при столкновении с молекулами воздуха электроны рассеиваются, в колонне должен быть создан вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в световом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают в вакуум колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается согласно плотности вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и образует изображение (подобно формированию изображения в световом микроскопе) на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране. 4.1.8. Для наблюдения под электронным микроскопом биологические образцы необходимо подвергнуть специальной обработке [7] Применение электронного микроскопа в биологии позволило увидеть в клетках множество удивительных структур. Но прежде, чем эти открытия были сделаны, ученым пришлось изрядно потрудиться, чтобы разработать новые методы заключения тканей, их резки и окрашивания. 182 Таблица 4-2 . Основные вехи в истории электронной микроскопии 1897 - Томсон (J. J. Thomson) сообщил о существовании отрицательно заряженных частиц, названных позже электронами 1924 - Де Бройль (de Broglie) предположил, что движущийся электрон обладает волновыми свойствами 1926 - Буш (Busch) доказал, что с помощью цилиндрических магнитных линз можно сфокусировать электронный луч. Так были заложены основы электронной оптики 1931 - Руска (Ruska) и соавторы создали первый просвечивающий электронный микроскоп 1935 - Кнолль (Knoll) показал возможность создания сканирующего электронного микроскопа; спустя три года фон Ардене (Von Ardene) cконструировал его прототип 1939 – Сименс (Siemens) создал первый просвечивающий электронный микроскоп, который нашел широкое применение. 1944 - Уильяме и Виков (Williams, Wyckoff) разработали метод оттенения металлом 1945 - Портер, Клод и Фуллам (Porter, Claude, Fullam) использовали электронный микроскоп для изучения клеток в культурах тканей после их фиксации и окраски 1948 - Пиз и Бейкер (Pease, Baker) представили убедительные доказательства, что ими получены тонкие срезы биологического материала (толщиной 0,1-0,2 мкм) 1952 - Паладе, Портер и Шестранд (Palade, Porter, Sjostrand) разработали методы фиксации и приготовления тонких срезов. Это позволило впервые увидеть многие внутриклеточные структуры. |