Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Срок годности раствора - 1 мес., хранение при комнатной температуре. Допускается использование других реактивов и эталонных растворов для спектрального анализа, аттестованных компетентным уполномоченным органом. Эталонные, а также приготовленные на их основе растворы сравнения хранят в посуде, позволяющей сохранять концентрацию этих растворов неизменной (например, в посуде из кварца, тефлона, чистого полиэтилена и т.п.). Чашки и тигли для озоления проб должны быть изготовлены из кварца. 12.4. ФЛУОРИМЕТРИЯ (ОФС 42-0045-07) Флуориметрия (или флуоресцентная спектрофотометрия) основана на измерении флуоресценции - интенсивности флуоресцентного света, излучаемого испытуемым образцом в возбужденном состоянии, которое было достигнуто поглощением лучевой энергии в результате воздействия ультрафиолетового, видимого или других видов электромагнитного излучения. Флуоресценция органических соединений охватывает спектральную область от 250 до 800 нм, т.е. области: УФ (частично), видимую и начало ближнего ИК. Энергия молекул, поглотивших лучевую энергию и находящихся в возбужденном состоянии, может высвобождаться в виде тепла или излучения при той же или большей длине волны по сравнению с поглощаемым излучением. Поэтому свет, излучаемый флуоресцентным раствором, имеет максимум интенсивности, смещенный в более длинноволновую область по сравнению с возбуждающим излучением, обычно на 20-30 нм. Поскольку поглощение и испускание излучения осуществляется благодаря переходу электронов между различными уровнями энергии или молекулярными орбитами, между поглощением и испусканием света имеется задержка во времени. Этот интервал (продолжительность возбужденного состояния) -9 -8 составляет от 10 до 10 с для большей части флуоресцирующих растворов. Короткое время жизни флуоресценции отличает этот тип люминесценции от фосфоресценции, которая представляет собой долгоживущее свечение, имеющее -3 время жизни от 10 с до нескольких мин. Флуориметрия является более чувствительным методом анализа, чем абсорбционная спектрофотометрия, и позволяет определять флуоресцирующие вещества в растворах с концентрацией, которая составляет примерно от 1/10 до 1/100 от концентрации, используемой в абсорбционной спектрофотометрии. Интенсивность флуоресценции обозначается символом I и представляет собой эмпирическое выражение флуоресцентной активности в условных единицах, пропорциональных отклику детектора. Флуоресцентный спектр испускания представляет собой графическое изображение спектрального распределения излучения, испускаемого активированным веществом, в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны - абсцисса. Флуоресцентный спектр возбуждения представляет собой графическое изображение спектра активации в координатах: интенсивность испускаемого излучения - ордината, длина волны активирующего излучения - абсцисса. Приборы. Для проведения флуориметрического анализа используют приборы двух типов: фильтрационный флуориметр и спектрофлуориметр. Фильтрационный флуориметр состоит из источника излучения, первичного фильтра, камеры для образца, вторичного фильтра и системы детектирования флуоресценции. У большей части таких приборов детектор помещен под углом 90 град. к возбуждающему лучу. Геометрия прямого угла позволяет возбуждающему излучению пройти через испытуемый образец, не "загрязняя" произведенный сигнал, передаваемый на детектор флуоресценции. Однако детектор все-таки получает возбуждающее излучение, искаженное в результате рассеивающих свойств самих растворов, а также из-за присутствия в растворе пыли или других твердых частиц. Для устранения этого остаточного рассеяния используются фильтры. Первичный фильтр отбирает коротковолновое излучение, способное к возбуждению испытуемых образцов, вторичный фильтр пропускает флуоресценцию в длинноволновой области, но блокирует рассеянное возбуждение. Большинство флуориметров в качестве детекторов используют фотоумножители разных типов. Каждый тип детектора имеет специальные характеристики (спектральная область максимальной чувствительности, усиление, электрические шумы). Фототок усиливается и регистрируется измерительным прибором или самописцем. Спектрофлуориметры отличаются от фильтрационных флуориметров тем, что вместо фильтров используются монохроматоры типа призмы или решетки. Для аналитических целей эти приборы более предпочтительны. В спектрофлуориметрах монохроматоры снабжены щелями. Узкая щель дает высокое разрешение и спектральную чистоту, широкая щель обеспечивает высокую чувствительность. Выбор размера щели определяется разделением между длинами волн возбуждения и испускания и необходимой чувствительностью. Кюветы, используемые для измерения флуоресценции, представляют собой кюветы цилиндрической формы или прямоугольные кюветы, отполированные со всех четырех вертикальных сторон. Обычно объем испытуемых образцов составляет 2-3 мл, но к некоторым приборам прилагаются кюветы вместимостью от 100 до 300 мкл или капиллярные держатели для еще меньшего объема. Измерение флуоресценции. Практически флуоресценцию определяют в -5 растворах с концентрацией от 10 М и менее, когда между интенсивностью флуоресценции и концентрацией вещества наблюдается прямолинейная зависимость. При более высоких концентрациях значительная часть поступающего света абсорбируется образцом вблизи поверхности кюветы, и интенсивность света, достигающего центра, уменьшается. При этом образец действует как "внутренний фильтр", в результате чего линейность нарушается. Все замеры интенсивности флуоресценции должны быть скорректированы с растворителем. Интенсивность флуоресценции в значительной степени зависит от длины волны возбуждающего света, величины pH испытуемого раствора, температуры, характера растворителей и присутствия в растворе посторонних частиц. Твердые частицы, влияющие на флуоресценцию (могут поглощать некоторую долю возбуждающей энергии, дезактивировать возбужденные молекулы или завышать измеряемую величину из-за многократных отражений в кювете с образцом), удаляют центрифугированием или фильтрованием. В последнем случае следует учесть, что некоторые сорта фильтровальной бумаги содержат флуоресцирующие примеси. Для некоторых веществ эффективность флуоресценции может снизиться на 1-2% при повышении температуры на градус. В таких случаях следует использовать термостатированные кюветы с контролируемой температурой. В рутинном анализе может оказаться достаточным сделать измерение быстро, чтобы не произошло нагревания образца от источника облучения. Флуоресцентные вещества чувствительны к свету. При выдержке во флуориметре они могут подвергаться фотораспаду с образованием других флуоресцирующих продуктов. Такие эффекты обнаруживаются по отклику детектора в зависимости от времени и могут быть снижены применением фильтров или экрана после источника света. Изменение растворителя может заметно повлиять на интенсивность и спектральное распределение флуоресценции. Многие соединения, флуоресцирующие в органических растворителях, фактически не флуоресцируют в воде, поэтому для того, чтобы решить, является вещество флуоресцентным или нет, надо исследовать его в различных растворителях. Для многих органических растворителей интенсивность флуоресценции возрастает при удалении растворенного кислорода, являющегося сильным гасителем флуоресценции. Кислород может быть удален пропусканием инертного газа (азот или гелий) через испытуемый образец. Применение флуориметрии в фармацевтическом анализе Идентификация. Характер спектра флуоресценции, а также цвет излучаемого света специфичны для флуоресцирующих веществ. Поэтому флуоресценция может быть применена для идентификации веществ. Количественный анализ. При количественных определениях интенсивность флуоресценции испытуемого образца сравнивают с интенсивностью флуоресценции стандартного образца флуоресцирующего вещества известной концентрации, измеренной в идентичных условиях на одном и том же приборе. Методика. Растворяют испытуемый образец в растворителе или в смеси растворителей, указанных в частной фармакопейной статье. Переносят раствор в кювету флуориметра и освещают лучом возбуждающего света с длиной волны, указанной в частной фармакопейной статье. Вначале в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемых для растворения вещества, и устанавливают прибор на "ноль". Затем вводят стандартный раствор и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы замер был больше 50. Если повторное доведение чувствительности производится при изменении ширины щели, должна быть произведена переустановка "нуля" и интенсивность флуоресценции стандартного образца должна быть измерена вновь. Последним вводят раствор испытуемого образца неизвестной концентрации и замеряют показания прибора. Рассчитывают концентрацию вещества в испытуемом растворе (C ) по формуле: x I x C x ст. C = -----------, x I ст. где: C - концентрация вещества в стандартном растворе; ст. I - интенсивность света, испускаемого испытуемым раствором; x I - интенсивность света, испускаемого стандартным раствором. ст. Если интенсивность флуоресценции не прямо пропорциональна концентрации, измерение может быть произведено с использованием калибровочной кривой. В некоторых случаях измерение может быть сделано относительно фиксированного стандарта (например, флуоресцентного стекла или раствора другого флуоресцентного вещества). В качестве стандартов могут быть использованы: раствор известной концентрации хинина в 0,05 М растворе серной кислоты или раствор флуоресцеина в 0,1 М растворе натрия гидроксида. В таких случаях концентрацию испытуемого образца следует определять с использованием предварительно полученной в тех же условиях калибровочной кривой. 12.5. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА (ОФС 42-0046-07) Вещества, ядра атомов которых имеют магнитные моменты, в постоянном магнитном поле поглощают энергию электромагнитных волн (радиочастотный диапазон) при определенном соотношении между величинами постоянного магнитного поля и частотой переменного поля (ядерный магнитный резонанс, ЯМР). Частота ню0 = омега0/2пи, при которой выполняется условие резонанса омега0 = гамма x B0 (гамма - постоянная, носит название "гиромагнитное отношение") называется резонансной частотой. Магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетным атомным весом (1H, 13C, 15N, 31P, 19F). Не имеют магнитных моментов ядра атомов с четным зарядом и четным атомным весом (12C, 16O). Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: или при непрерывном облучении образца слабым электромагнитным полем с изменяющейся частотой, в результате чего получается непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса с последующим Фурье-преобразованием отклика, представляющего собой сигнал свободной индукции, в спектр (импульсная спектроскопия). В молекулах положение энергетических уровней, переходы между которыми образуют спектр ЯМР, определяется величиной взаимодействия магнитных моментов ядер с постоянным магнитным полем B и с магнитными моментами лок других ядер через посредство электронов молекулы (спин-спиновое взаимодействие). Электроны атомов уменьшают величину внешнего магнитного поля B0 в месте нахождения ядра: B = B0 x (1 - сигма), сигма > 0, константа лок экранирования - безразмерная величина. Разница в резонансных частотах сигналов, равная разнице в константах экранирования ядер, называется химическим сдвигом сигналов (обозначается символом дельта, измеряется в миллионных долях, м.д.). Спин-спиновое взаимодействие, характеризуемое константой спин-спинового взаимодействия (обозначается символом J, измеряется в герцах), приводит к образованию мультиплетов. Значения дельта и J не зависят от величины постоянного магнитного поля. Количество компонент в мультиплетах определяется спином ядра и количеством взаимодействующих ядер. Диапазон химических сдвигов сигналов ядер водорода не превосходит 20 м.д. Диапазон химических сдвигов сигналов других ядер измеряется сотнями м.д. Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) веществ в растворах определяется временем поперечной релаксации T2, характеризующим время установления равновесия в системе спинов, а также неоднородностью магнитного поля. Определяемая этими величинами ширина сигналов ядер со спином 1/2 обычно не превосходит 1 Гц. Уширение сигналов происходит в результате обменных процессов или присутствием в молекуле ядер со спином большим 1/2. Интенсивность сигнала ЯМР в спектре определяется избытком количества ядер на нижнем энергетическом уровне. Отношение количества ядер N- и N+ соответственно на верхнем и нижнем энергетических уровнях определяется фактором Больцмана: N-/N+ = exp(-мю B0/IkT), где: k - постоянная Больцмана, n мю - магнитный момент ядра, T - абсолютная температура, I - спин ядра (при n этом (мю B0/I << kT). Очень небольшая разница в энергиях между возбужденным n и основным состоянием ядер является основной причиной сравнительно низкой чувствительности метода ЯМР. Уменьшение интенсивности сигналов также связано со сравнительно большим временем нахождения системы ядер в возбужденном состоянии и большим временем релаксации (постоянная, характеризующая время релаксации обозначается символом T1). Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. Частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода, называется рабочей частотой ЯМР спектрометра. Спектроскопия ЯМР на ядрах водорода и углерода 13C (естественное содержание 1,1%) наиболее часто используется в исследовании органических лекарственных веществ. Широкополосные импульсные ЯМР-спектрометры позволяют получать спектры практически от всех элементов периодической системы. Прибор. ЯМР-спектрометр для спектроскопии с непрерывным облучением состоит из магнита, генератора изменяющейся частоты, датчика, генератора радиочастоты и приемника, а также электронного интегратора и самопишущего потенциометра. Импульсные спектрометры, кроме того, имеют генератор импульсов и компьютер для преобразования интерферограммы отклика в спектр. Рабочая частота спектрометра не должна быть меньше 60 МГц. Если в частной фармакопейной статье не оговорено, то необходимо соблюдать следующие условия: 1) Разрешение должно быть 0,5 Гц или менее. 2) Амплитуда боковых сигналов, появляющихся при вращении образца, не должна превышать 2% от основного сигнала. 3) При количественных измерениях с использованием интегралов сигналов ни одно из пяти измерений не должно превосходить 2,5% от среднего значения. 4) Разрешение и отношение сигнал/шум следует измерять, используя соответствующие команды в пакете стандартных программ. Метод. Растворенное вещество должно быть подписано и отфильтровано; раствор должен быть прозрачным. Перед регистрацией спектра фаза сигнала должна быть отрегулирована по возможности на поглощение. Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах 1H и 13C измеряется относительно сигнала тетраметилсилана (ТМС), положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (дельта - шкала химических сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1H используется 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС), химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров 13C водных растворов в качестве эталона используют диоксан (ДО), химический сдвиг которого равен 67,4 м.д. В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию. Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов растворителей имеют следующие значения: хлороформ - 7,26; бензол - 7,16; вода - 4,7; метанол - 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид - 2,50; ацетон - 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры. Для того чтобы избежать уширения сигналов при использовании смешанных растворителей, перед получением спектров необходимо выждать время для гомогенизации смеси растворителей, которое может составлять часы. Для спектроскопии с непрерывным облучением амплитуда переменной частоты не должна быть большой, чтобы избежать насыщения сигнала. Наиболее интенсивный сигнал должен занимать почти всю ширину бланка. Кривая интеграла записывается поверх сигналов спектра. В импульсных спектрометрах устанавливают следующие параметры: ширина спектра, время регистрации сигнала, длительность радиочастотного импульса, количество точек для Фурье-преобразования (спектральное разрешение) и количество накоплений сигнала свободной индукции. Имеется ряд методик получения сигналов ЯМЕ, которые могут быть использованы при решении аналитических задач. В основе каждой из них используется определенная последовательность импульсов. Методики принято обозначать несколькими заглавными буквами латинского алфавита. Например, используемая часто методика COSY является сокращением словосочетания correlation spectroscopy. Обычные (одномерные) спектры получают воздействием на вещество одним радиочастотным импульсом, при завершении которого проводится считывание сигнала (свободная индукция) от ядер образца с последующим преобразованием сигнала свободной индукции в спектр (Фурье-преобразование). |