Для слабых сигналов цикл возбуждение - считывание с накоплением сигнала повторяется многократно, чем достигается необходимое для анализа отношение сигнал/шум. Для количественных измерений цикл возбуждение - считывание повторяется через интервал времени, превышающим время релаксации T1 в несколько раз. Для измерения времени T1 следует использовать программу в пакете стандартных программ, прилагаемых к ЯМР-спектрометрам.
Наряду с одномерными в аналитических целях используются двумерные корреляционные спектры, получаемые методиками COSY (для ядер одного вида), HETCOR (для разных ядер) и др. В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов (перенос когерентности), называемых кросс-пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер.
Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросс-пиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах.
Для быстрого получения спектров гетероядер (13C, 15N и др.) применяются методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах 1H спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия.
Методика DOSY позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения. Методика основана на различии в скоростях диффузии различных молекул.
Области применения. Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для установления подлинности и количественных определений.
1. Установление подлинности вещества. В спектрах ЯМР практически исключается совпадение даже нескольких сигналов от разных веществ. При заявлении спектра на подлинность желательно ограничиваться по возможности меньшим количеством сигналов. При описании спектров необходимо приводить значения химических сдвигов и мультиплетность сигналов, заявленных на подлинность. Следует указывать рабочую частоту спектрометра, т.к. от нее зависит вид спектра. По этой же причине не использовать формулировку "...такой же вид, как и на приведенном (в НД) спектре".
Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) эффективна двумерная ЯМР-спектроскопия. При описании двумерных спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков.
2. Определение количества посторонних примесей. При получении спектров ЯМР, как правило, легко достигается значение отношения сигнал/шум более 100, что позволяет использовать этот метод для определения в субстанции примеси в количествах, измеряемых процентами и долями процента.
3. Определение количества остаточных растворителей. Все растворители, содержащие атомы водорода и углерода, дают характерные сигналы в спектрах 1H и 13C ЯМР. Чувствительность метода ЯМР к сигналам растворителя весьма высокая.
4. Количественное определение относительного или абсолютного содержания лекарственного вещества (примеси). Содержание вещества (X%) определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов анализируемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов анализируемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу.
К испытуемому образцу добавляют вещество-стандарт, проводят измерение площадей сигналов анализируемого вещества и вещества-стандарта. Вычисляют процентное содержание анализируемого вещества в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество (X%) по формуле:
X% = 100 x (S' /S' ) x (M x m /M x m ) x (100/(100 - W)),
масс a ст a ст ст a
где:
S' - приведенное значение интегральной интенсивности сигнала,
равное измеренной интегральной интенсивности, деленной на количество
протонов в структурном фрагменте (для CH2 - измеренная площадь,
деленная на 2, для CH3 - деленная на 3 и т.д.);
M - молекулярная масса анализируемого вещества;
a
M - молекулярная масса стандарта;
ст
m - навеска испытуемого образца;
a
m - навеска вещества-стандарта;
ст
W - содержание влаги, в процентах.
В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12).
При использовании в качестве стандартов веществ, молекулярная масса которых имеет небольшую величину, интервал времени между повторяющимися циклами импульсных последовательностей должен превосходить в несколько раз время релаксации T1 веществ-стандартов.
Мольная (X ) и весовая (X ) доля компонента i в смеси n веществ
моль масс
определяется по формулам:
S' M x S'
i X i i
X = ------------ i, масс = -----------------
i, моль j = n j = n S'
SUM S' SUM M x j
j = 1 j j = 1 j
X (%) = X x 100 и X (%) = X x 100.
i, моль моль i, масс масс
13. ОСМОЛЯРНОСТЬ (ОФС 42-0047-07)
Осмолярность характеризует создаваемое растворами осмотическое давление и является одной из важнейших характеристик инфузионных растворов. Растворы, равные по осмолярности 0,9% раствору натрия хлорида, называют изотоническими. Для изотонических растворов теоретически рассчитанные значения осмолярности находятся в пределах 239-376 мОсм/л.
На этикетках растворов для инфузий должно быть указано теоретическое значение их осмолярности. В случае, когда теоретическая осмолярность не может быть рассчитана, указывают среднее значение экспериментально определенной осмолярности для данного лекарственного средства. Полученные данные носят информационный характер и не являются показателем качества лекарственного средства.
Осмолярность - это характеристика растворов, выражающая их осмотическое давление через суммарную концентрацию кинетически активных частиц в единице объема раствора.
Кинетически активные частицы - это молекулы, ионы или ионные комплексы одного или нескольких растворенных веществ, свободно распределенные во всем объеме растворителя и обладающие способностью к хаотическому перемещению внутри раствора.
Теоретическая осмолярность может быть рассчитана по формуле:
m
C = ----- x n x 1000, (1)
осм. M
где:
C - осмолярность раствора, миллиосмоль на литр (мОсм/л);
осм.
m - содержание вещества в растворе, г/л;
M - молярная масса вещества;
n - суммарное число ионов, образующихся из одной молекулы растворенного
вещества в результате диссоциации (n = 1 для недиссоциирующих веществ;
n = 2, 3 для веществ, образующих при растворении соответствующее
количество ионов).
На практике количество частиц (n) несколько меньше теоретически рассчитанного и приближенно может быть описано формулой:
n = n x фи, (2)
o
где:
n - реальное количество частиц, образующихся при растворении
данного вещества;
n - теоретически рассчитанное количество частиц (п = 1, 2, 3...);
o
фи - молярный осмотический коэффициент, учитывающий взаимодействие
Между частицами в растворе и зависящий только от количества
растворенного вещества.
Коэффициент фи определяется экспериментально. Для многокомпонентных растворов его определение крайне затруднительно.
Осмолярность растворов, состоящих из нескольких компонентов, может быть определена как сумма осмолярностей всех компонентов.
Существующие инструментальные методы позволяют определить не осмолярность, а осмоляльность - концентрацию кинетически активных частиц на килограмм растворителя (мОсм/кг).
В отечественной практике принято выражать концентрацию инфузионных растворов как массо-объемную (в г/л), поэтому удобным представляется контролировать содержание кинетически активных частиц в миллиосмолях на литр (осмолярность), а не на килограмм (осмоляльность) раствора.
Различиями между значениями осмолярности и осмоляльности растворов с осмолярностью, близкой к осмолярности 0,7-1,1% раствора натрия хлорида или ниже, можно пренебречь (теоретическое значение осмотического давления 0,9% раствора натрия хлорида - 308 мОсм/л; экспериментальное значение -286 мОсм/л); для более концентрированных растворов (например, 10% раствора натрия хлорида) осмолярность может быть определена по формуле:
c(мОсм/л) = C(мОсм/кг) x ро, (3)
где ро - плотность раствора, кг/л.
Примечания
1. Расчет теоретических границ осмолярности проводится следующим образом: минимальное значение - осмолярность раствора, содержащего минимально допустимые по НД количества ингредиентов; максимальное значение - осмолярность раствора, содержащего максимально допустимые количества ингредиентов.
2. При наличии в растворе высокомолекулярного вещества за его молярную массу берется средняя молекулярная масса фракции.
3. Гидрокарбонаты при расчете осмолярности учитываются как соли одноосновной кислоты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОЛЯРНОСТИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ
(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОСМОЛЯРНОСТЬ)
Для практического определения осмолярности могут быть использованы три метода: криоскопический, мембранная и паровая осмометрия.
1 осмоль на килограмм воды понижает точку замерзания на 1,86 град. C и понижает давление пара на 0,3 мм рт. ст. при температуре 25 град. C. Измерение этих изменений лежит в основе криоскопического метода и метода паровой осмометрии.
1. Криоскопический метод
Метод основан на понижении точки замерзания растворов по сравнению с точкой замерзания чистого растворителя. Данный метод нашел самое широкое практическое применение как достаточно универсальный и точный.
1. Определение осмолярности с использованием термометра Бекмана. Определение температуры замерзания проводят на установке, изображенной на рис. 13.1. (не приводится). Установка состоит из сосуда А диаметром 30-35 мм и длиной около 200 мм, куда помещается испытуемый раствор (или растворитель); верхняя часть сосуда расширена и закрывается пробкой с двумя отверстиями для погружения термометра Б и мешалки В; сосуд А вставлен в более широкую емкость (Г) так, что не касается ее стенок или дна; термометр также не должен касаться стенок или дна сосуда А; уровень охлаждающей смеси в емкости Г должен быть не ниже уровня испытуемого раствора в сосуде А. При проведении эксперимента раствор (или растворитель) должен прикрывать основной ртутный резервуар термометра. Температура охлаждающей смеси должна быть на 3-5 град. C ниже температуры замерзания растворителя (для бидистиллированной воды: от минус 3 до минус 5 град. C); контроль минусовой температуры осуществляется минусовым термометром Д с ценой деления 0,5 град. C. Состав охладительной смеси: лед + натрия хлорид кристаллический. Установку термометра Бекмана на криометрические исследования производят путем подбора количества ртути в основном резервуаре так, чтобы при замерзании чистого растворителя (бидистиллированной воды) мениск ртути в капилляре находился у верхней части шкалы измерения. При этом возможна регистрация ожидаемого понижения температуры замерзания водного раствора.
Рис. 13.1. Устройство прибора Бекмана
Рисунок не приводится.
Методика. Для определения температуры замерзания чистого растворителя пользуются следующим приемом: дают жидкости переохладиться (охлаждают без перемешивания), и когда термометр показывает температуру на 0,2-0,3 град. C ниже ожидаемой точки замерзания, перемешиванием вызывают выпадение кристаллов растворителя; при этом жидкость нагревается до точки замерзания. Максимальную температуру (средний результат трех измерений, отличающихся не более чем на 0,01 град. C), которую показывает термометр после начала выпадения кристаллов, регистрируют как температуру замерзания растворителя (T1).
В высушенный сосуд А наливают достаточное количество испытуемого водного раствора; определение точки замерзания проводят, как описано выше для чистого растворителя; средний результат трех опытов регистрируют как температуру замерзания испытуемого раствора лекарственного вещества (T2).
Осмолярность раствора рассчитывают по формуле:
(T2 - T1)
C = --------- x 1000 (мОсм/кг), (4)
осм. K
где: T2 - температура замерзания чистого растворителя, градусы Цельсия;
T1 - температура замерзания испытуемого раствора, градусы Цельсия (град. C);
K - криометрическая постоянная растворителя (для воды: 1,86).
2. Определение осмолярности растворов с использованием автоматического криоскопического осмометра. Данный вариант предусматривает применение автоматических осмометров, например, МТ-2, МТ-4 (производитель НПП "Буревестник", Санкт-Петербург). Испытуемый раствор (обычно 0,2 мл) помещают в стеклянный сосуд, погруженный в ванну с контролируемой температурой. Термопару и вибратор помещают под испытуемым раствором; температуру в ванной снижают до переохлаждения раствора. Включают вибратор и вызывают кристаллизацию воды в испытуемом растворе; выделившееся тепло поднимает температуру раствора до точки замерзания. По зафиксированной точке замерзания раствора рассчитывают осмолярность. Прибор калибруют с помощью стандартных растворов натрия или калия хлорида, которые перекрывают определяемый диапазон осмолярности (табл. 13.1).
Таблица 13.1
Стандартные справочные значения понижения
температуры замерзания и эффективности осмотической
концентрации водных растворов хлоридов натрия и калия
┌───────────────────────┬───────────────────────┬─────────────────────────┐
│ Аналитическая │ Понижение температуры │ Эффективная │
│ концентрация соли │ замерзания │ (осмотическая) │
│ ро, г/кг H2O │ дельта T , K │ концентрация m , │
│ │ зам │ эф │
│ │ │ ммоль/кг H2O │
├───────────────────────┴───────────────────────┴─────────────────────────┤
│ Растворы натрия хлорида │
├───────────────────────┬───────────────────────┬─────────────────────────┤
│ 5,649 │ 0,3348 │ 180 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 6,290 │ 0,3720 │ 200 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 9,188 │ 0,5394 │ 290 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 9,511 │ 0,5580 │ 300 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 11,13 │ 0,6510 │ 350 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 12,75 │ 0,7440 │ 400 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 16,00 │ 0,930 │ 500 │
├───────────────────────┴───────────────────────┴─────────────────────────┤
│ Растворы калия хлорида │
├───────────────────────┬───────────────────────┬─────────────────────────┤
│ 7,253 │ 0,3348 │ 180 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 8,081 │ 0,3720 │ 200 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 11,83 │ 0,5394 │ 290 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 12,25 │ 0,5580 │ 300 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 14,78 │ 0,6696 │ 360 │
├───────────────────────┼───────────────────────┼─────────────────────────┤
│ 20,71 │ 0,930 │ 500 │
└───────────────────────┴───────────────────────┴─────────────────────────┘
2. Метод мембранной осмометрии
Метод основан на использовании свойств полупроницаемых мембран избирательно пропускать молекулы веществ.
Движущей силой процесса является процесс осмоса. Растворитель проникает в испытуемый раствор до установления равновесия; возникающее при этом дополнительное гидростатическое давление приближенно равно осмотическому давлению и может быть рассчитано по формуле:
Пи
= P = ро x g x дельта h, (5)
осм. гидр.
где:
пи - осмотическое давление;
осм.
P - гидростатическое давление;
гидр.
ро - плотность жидкости;
g - ускорение свободного падения;
дельта h - высота столба жидкости.
Осмолярность может быть рассчитана по формуле:
C = пи /R x T, (6)
осм. осм.
где: R - универсальная газовая постоянная (8,314 Дж/мольK);
T - абсолютная температура, Кельвин.
Примечание. Данный метод применим только для растворов
4 6
высокомолекулярных веществ (10 - 10 г/моль). При анализе растворов,
содержащих электролиты и другие низкомолекулярные вещества, будет
определяться только осмотическое давление, создаваемое высокомолекулярными
компонентами раствора.
Методика. Испытуемый раствор с помощью шприца (рис. 13.2 - не приводится) с длинной иглой вносят в специальное отверстие измерительной ячейки. Калибровку проводят с помощью устройства, находящегося в приборе. Проводят не менее трех измерений. Для получения воспроизводимых результатов необходима проба объемом не менее 1,2 мл.
Рис. 13.2. Устройство мембранного осмометра
Рисунок не приводится.
3. Метод паровой осмометрии
Метод основан на измерении разности температур термисторами (чувствительными к температуре сопротивлениями) вследствие различия между давлением пара над раствором вещества и чистым растворителем. При нанесении на оба термистора капли растворителя разность температур равна нулю. Если одну из капель заменяют каплей испытуемого раствора, то на поверхности этого термистора происходит конденсация паров растворителя, так как давление пара растворителя над этой поверхностью меньше. При этом температура капли раствора повышается за счет экзотермического процесса конденсации до тех пор, пока давление пара над каплей раствора и давление чистого растворителя в ячейке не сравняются. Наблюдаемая разница температур измеряется. Разность температур практически пропорциональна моляльной концентрации раствора.
|
Скачать 3.93 Mb.