Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Тест-дозу испытуемого лекарственного средства, объем вводимого раствора и, если необходимо, скорость введения указывают в частной фармакопейной статье. Проведение испытания Испытание лекарственного средства проводят на группе из трех кроликов с исходной температурой 38,5-39,5 град. C. Перед опытом, с интервалом не менее 30 мин., у каждого кролика дважды измеряют температуру тела. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2 град. C. В противном случае кролика исключают из испытания. За исходную температуру принимают величину последнего результата измерения. Раствор испытуемого лекарственного средства вводят животным сразу после второго измерения температуры. Измерения температуры после внутривенного введения испытуемого лекарственного средства проводят с интервалом не более 30 мин. на протяжении трех часов. При других путях парентерального введения - на протяжении пяти часов. Учет результатов Испытание лекарственного средства можно проводить поэтапно. На каждом этапе используют трех кроликов. Максимальное число этапов не должно превышать четырех. По окончании каждого из этапов испытания определяют максимальное изменение температуры (дельта t) тела у кролика по сравнению с исходным значением. Изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нуль и не учитывают. Для трех кроликов определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур (SUM дельта t). Значения SUM дельта t, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, а результаты сравнивают с уровнями, указанными в табл. 26.1. - После первого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 1,2 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры ни у одного из кроликов не превышает 0,5 град. C (колонка 4). - Если результат, полученный на первом этапе, превышает 1,2 град. C (колонка 5) или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры более 0,5 град. C - хотя бы у одного из трех кроликов (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания. - После второго этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 2,8 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у одного из шести кроликов (колонка 4). - Если результат, полученный на втором этапе испытания, больше 2,8 град. C, но меньше 4,3 град. C (колонка 5), или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у одного животного (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания. - После третьего этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 4,5 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у двух из девяти кроликов (колонка 4). - Если результат, полученный на третьем этапе испытания, больше 4,5 град. C, но меньше 6,0 град. C (колонка 5), или зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у двух животных (колонка 6), то необходимо перейти к проведению следующего этапа испытания. - После четвертого этапа испытания лекарственное средство признают апирогенным, если полученный результат меньше или равен 6,6 град. C (колонка 3), а индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C отмечено не более, чем у трех из двенадцати кроликов (колонка 4). - Лекарственное средство признают пирогенным, если результат на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в колонке 7. - Лекарственное средство признают пирогенным и в том случае, если в результате четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5 град. C более, чем у трех кроликов из двенадцати. Таблица 26.1 Оценка результатов испытания
-------------------------------- <*> При индивидуальном повышении температуры свыше 0,5 град. C более чем у трех кроликов из двенадцати, лекарственное средство признают пирогенным. 27. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭНДОТОКСИНЫ (ОФС 42-0062-07) Настоящая статья описывает метод определения бактериальных эндотоксинов в лекарственных препаратах, предназначенных для парентерального применения, и субстанциях, используемых для их изготовления. Определение содержания бактериальных эндотоксинов проводят с помощью реактива, представляющего собой лизат клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив). В результате реакции с эндотоксином происходит помутнение реакционной смеси и увеличение ее вязкости вплоть до формирования плотного геля, образование которого служит индикатором наличия в пробе бактериальных эндотоксинов. Проводимый таким образом анализ называется гель-тромб тест. Этот метод может быть использован для определения соответствия содержания бактериальных эндотоксинов предельному содержанию бактериальных эндотоксинов, указанному в частной фармакопейной статье ("Метод А. Качественный анализ"), и для определения содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве ("Метод В. Количественный анализ"). Качественный анализ является основным методом проведения анализа на соответствие показателю "Бактериальные эндотоксины". Этот же метод является арбитражным. Допускается использование других методов и/или модификаций ЛАЛ-теста, если они указаны в частной фармакопейной статье и валидированы для данного лекарственного средства. Посуда и ее подготовка Стеклянная и пластиковая посуда, используемая в ЛАЛ-тесте, не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должна оказывать влияния на ход реакции. Рекомендуемым режимов депирогенизации является нагревание при температуре 250 град. C не менее 30 мин. в соответствии с валидированной процедурой. Стандарты эндотоксина Содержание бактериальных эндотоксинов выражается в единицах эндотоксина (ЕЭ) Международного стандарта эндотоксина. При проведении анализа может использоваться Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ) активность которого установлена по Международному стандарту эндотоксина. Контрольный стандарт эндотоксина должен быть предназначен для проведения анализа с данной партией ЛАЛ-реактива (ТАЛ-реактива) <*>. Растворение и хранение КСЭ осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя. -------------------------------- <*> Контрольный стандарт эндотоксина и ЛАЛ-реактив или ТАЛ-реактив должны быть зарегистрированы в Минздравсоцразвития РФ. ЛАЛ-реактив Необходимо использовать ЛАЛ-реактив, предназначенный для проведения фармакопейного анализа с помощью гель-тромб теста. В случае проведения анализа методом, отличным от основного, необходимо использовать реактив, предназначенный для данного метода. Чувствительность реактива (лямбда) выражена в единицах эндотоксина [ЕЭ/мл] и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом. ЛАЛ-реактив представляет собой лиофилизированный препарат. Растворение и хранение реактива осуществляют согласно инструкции фирмы-производителя. Вода для ЛАЛ-теста Для приготовления растворов реактивов и разведений испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте. Максимально допустимое разведение испытуемого лекарственного средства Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства. Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле: Предельное содержание Концентрация бактериальных эндотоксинов x испытуемого раствора МДР = -----------------------------------------------------, лямбда где: предельное содержание бактериальных эндотоксинов - допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в частной фармакопейной статье; концентрация испытуемого раствора - концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов; лямбда - чувствительность ЛАЛ-реактива [ЕЭ/мл]. Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу: K Предельное содержание бактериальных эндотоксинов = ----, M где: M - максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного ч (в мг, мл, ЕД на 1 кг массы тела). Дозу, выраженную на 1 кв. м, пересчитывают с учетом того, что поверхность человека со средней массой тела 70 кг составляет 1,8 кв. м; K - пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 ч для испытуемого лекарственного препарата, если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального. При интратекальном пути введения лекарственного препарата K составляет 0,2 ЕЭ/кг. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых парентерально (внутривенно), предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывается, как 175/V, где V - максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V. Для субстанций рассчитывают предельное содержание бактериальных эндотоксинов, используя величину М, выбранную для лекарственной формы. Подготовка испытуемого образца Каждый отобранный образец испытывается индивидуально. Для растворения и/или разведения испытуемого лекарственного средства используют воду для ЛАЛ-теста, если не указано иного в частной фармакопейной статье. Испытуемый раствор должен иметь pH в пределах, указанных производителем ЛАЛ-реактива, обычно 6,0-8,0. В случае необходимости pH доводят растворами кислоты, основания или с помощью буферного раствора. Используемые растворы не должны содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте, и не должны оказывать влияния на ход реакции. Процедура анализа В круглодонные пробирки диаметром 10 мм вносят равные объемы ЛАЛ-реактива и испытуемого раствора (по 0,1 мл). Реакционные смеси аккуратно перемешивают и инкубируют при температуре 37 +/- 1 град. C в течение 60 +/- 2 мин. Во время инкубирования следует избегать вибрации и ударов. По истечении указанного срока визуально регистрируют результаты как положительные или отрицательные. Положительная реакция (+) характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при аккуратном однократном переворачивании пробирки на 180 град. C Отрицательная реакция (-) характеризуется отсутствием такого геля. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ АНАЛИЗЫ Для подтверждения достоверности и точности результатов определения бактериальных эндотоксинов, проводимых с помощью ЛАЛ-реактива, необходимо подтвердить чувствительность реактива, указанную на этикетке, а также убедиться в том, что испытуемое лекарственное средство не содержит факторов, мешающих проведению реакции. Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива Анализ проводят для каждой новой серии используемого ЛАЛ-реактива, а также при изменении условий эксперимента, используемых материалов и реактивов, способных повлиять на результаты теста. Процедура. Для проведения анализа готовят растворы C и D по схеме, приведенной в табл. 27.1. Таблица 27.1
Растворы C - серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (проверка чувствительности ЛАЛ-реактива). Раствор D - Вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа. Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если: - для раствора D (отрицательный контроль) во всех повторностях получены отрицательные результаты; - для раствора C с концентрацией 0,25 лямбда получены отрицательные результаты. Конечной точкой реакции для каждой из повторностей растворов C является положительный результат, полученный для раствора c наименьшей концентрацией КСЭ. По этим результатам рассчитывается среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива по следующей формуле: Среднее геометрическое значение SUM e концентраций КСЭ в конечной точке = antilog (------), реакции f где SUM e - сумма логарифмов концентраций КСЭ в конечной точке реакции в каждой из повторностей, f - число повторностей. Заявленная чувствительность ЛАЛ-реактива считается подтвержденной и используется в дальнейших расчетах в том случае, если полученное в эксперименте значение чувствительности ЛАЛ-реактива не менее 0,5 лямбда и не более 2 лямбда. Мешающие факторы Испытуемое лекарственное средство может содержать мешающие факторы, усиливающие и/или ингибирующие реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами. Обнаружить эти явления можно, сравнив способность используемого ЛАЛ-реактива реагировать с раствором КСЭ в воде для ЛАЛ-теста и в растворе испытуемого лекарственного средства в стандартных условиях проведения эксперимента. Испытанию может быть подвергнуто лекарственное средство в любом разведении, не превышающем значения МДР. Используемые в данном анализе пробы испытуемого лекарственного средства (или его разведения) не должны содержать бактериальных эндотоксинов в определяемых в тесте количествах. Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.2. Раствор A - испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении (контроль отсутствия бактериальных эндотоксинов). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||