Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в частной фармакопейной статье: в эксикаторе под вакуумом над фосфора(V) оксидом, в вакуумном шкафу при 60 град. C или в термостате при 100-105 град. C). Раствор стандартного образца. Стандартный образец белка растворяют в том же растворителе и в той же концентрации, что и в испытуемом растворе. Испытуемый раствор. Растворяют или разводят лекарственное средство в воде, 0,9% растворе натрия хлорида или буферном растворе до концентрации, указанной в частной фармакопейной статье. 3. Методы определения белка по содержанию азота 1. Метод Къельдаля - титриметрический (А - микрометод, Б - обратное титрование). 2. Метод с реактивом Несслера (колориметрический). В качестве стандартного образца, содержащего азот, используют аммония сульфат. Для многокомпонентных препаратов, содержащих другие вещества, в состав которых входит азот, перед определением белка необходимо предварительно проводить пробоподготовку: осаждение трихлоруксусной или фосфорновольфрамовой кислотой. 4. Метод определения белка по аминокислотному составу. 1. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Результаты достоверны в области линейной зависимости оптической плотности раствора от концентрации белка. Метод А. Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина) в молекуле белка поглощать ультрафиолетовый свет при длине волны около 280 нм. При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам; в этом случае в раствор препарата добавляют неионный детергент, указанный в частной фармакопейной статье, или предварительно концентрируют испытуемый раствор, избегая денатурации белка. Готовят испытуемый раствор с содержанием белка 0,2-2 мг/мл. Методика. Выдерживают при комнатной температуре испытуемый раствор, раствор стандартного образца и раствор сравнения в течение 10 мин. Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения. Рассеяние света. Точность определения содержания белка в УФ-области уменьшается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250-300 нм). Рассеяние светового луча приводит к увеличению поглощения испытуемого раствора, поэтому дополнительно вычисляют оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм, обусловленную рассеянием света. С этой целью проводят определение оптической плотности испытуемого раствора при длинах волн 320, 325, 330, 335, 340 и 350 нм. Строят график зависимости логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую до lg 280 нм и определяют lg оптической плотности. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света, которое вычитают из оптической плотности раствора, полученной при 280 нм, для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе. Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле: C = C x A/A , ст. ст. где: C - концентрация белка в растворе стандартного образца, в мг/мл; ст. A и A - значения оптической плотности испытуемого раствора и ст. раствора стандартного образца при длине волны 280 нм соответственно, после вычитания оптической плотности за счет рассеяния света. Мутные растворы для уменьшения светового рассеяния перед определением содержания белка фильтруют через фильтры из поливинилиденфторида или указанные в частной фармакопейной статье с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующие белок, или центрифугируют. Метод Б. Метод измерения оптической плотности растворов при двух длинах волн используют как для растворов чистых белков, так и для их смесей, в области концентраций 0,0015-0,0450 мг/мл, если не указано иначе в частной фармакопейной статье. Готовят серию разведений (не менее трех) образца лекарственного средства с равными интервалами и измеряют оптическую плотность полученных растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм. Концентрацию белка (C ) в каждом i растворе в мг/мл вычисляют по формуле: C = (A215 - A225) x P x 0,144, i i где: A215 и A225 - оптическая плотность разведенного раствора при 215 нм и 225 нм соответственно; P - разведение; i 0,144 - эмпирически вычисленный коэффициент для белков при измерении оптической плотности растворов при длинах волн 215 нм и 225 нм. Рассчитывают среднее значение. 2. КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 1. Метод с биуретовым реактивом Метод основан на образовании в щелочной среде окрашенного комплекса ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка. Методика. К 1 мл испытуемого раствора, приготовленного растворением испытуемого вещества в 0,9% растворе натрия хлорида, с содержанием белка от 2 до 8 мг прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм (или указанной в частной фармакопейной статье, в пределах 540-650 нм). Биуретовую реакцию нельзя проводить в присутствии солей аммония из-за образования медно-аммиачных комплексов, а также с растворами, в которых появляется мутность или образуется осадок. Для устранения влияния посторонних веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объема 50% раствора трихлоруксусной кислоты, удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме 0,5 М раствора натрия гидроксида. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора. Метод может использоваться в различных вариантах: с построением калибровочной кривой или с использованием стандартного образца. Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес. 2. Метод Лоури Метод основан на биуретовой реакции белков с солями меди(II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (или реактива Фолина) в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка (главным образом тирозина, а также триптофана и фенилаланина и в меньшей степени цистеина). Развитие окраски достигает максимума через 20-30 мин. при комнатной температуре, в дальнейшем идет уменьшение ее интенсивности. Степень окрашивания зависит от природы белка. Определению мешают некоторые соли, тиоловые соединения, углеводы, липиды, неионные детергенты, органические растворители, комплексоны и другие соединения. Для уменьшения влияния веществ, мешающих определению, проводят дополнительное разведение раствора или осаждение белков трихлоруксусной кислотой. Метод А (без предварительного осаждения белка). К 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,020-0,100 мг белка; к 1 мл каждого раствора стандартного образца белка и к 1 мл используемого для приготовления испытуемого раствора растворителя, помещенным в отдельные пробирки, прибавляют по 5 мл реактива B. Содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку прибавляют 0,5 мл фосфорномолибденово-вольфрамового реактива, разбавленного перед употреблением водой в 2 раза, быстро и тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Примечания 1. Приготовление реактива А. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 г натрия карбоната, растворяют в 0,1 М растворе натрия гидроксида и доводят объем до метки этим же раствором. Срок годности раствора - 1 мес. 2. Приготовление реактива Б. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,5 г меди сульфата и растворяют в 1% растворе: калия-натрия тартрата, или натрия тартрата, или натрия цитрата (должно быть указано в частной фармакопейной статье). Срок годности раствора - 2 мес. 3. Приготовление реактива В. Перед анализом смешивают 50 мл реактива А и 1 мл реактива Б. Метод Б (с предварительным осаждением белка). Метод рекомендован для лекарственных средств, содержащих компоненты, влияющие на результаты анализа (фенол, ароматические аминокислоты, трис-буфер, цистеин, дитиотреитол, аскорбиновая кислота, этилендиаминтетраацетат; тритон X-100, твин-20, соли, сахара и др.). Методика. В центрифужную пробирку помещают 1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,10-0,30 мг белка, прибавляют 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают. Пробу оставляют на 18-20 ч при температуре 4-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием в течение 30 мин. при температуре около 5 град. C и скорости вращения 2000 об/мин., промывают 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, центрифугируют в тех же условиях. Осторожно сливают надосадочную жидкость, оставшийся осадок растворяют в 0,2 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой до 1 мл. К 0,5 мл полученного раствора, содержащего 0,050-0,150 мг белка, прибавляют 0,5 мл воды, перемешивают, вносят 5 мл реактива В и далее поступают, как описано выше в методе А. В качестве раствора сравнения используют пробу, содержащую 0,1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, 0,9 мл воды, 5 мл реактива В и 0,5 мл разбавленного в 2 раза фосфорномолибденово-вольфрамового реактива. Примечание. Приготовление 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). 150 г ТХУ растворяют в 100 мл воды. 1 мл полученного раствора титруют 1 М раствором натрия гидроксида с индикатором фенолфталеин и рассчитывают концентрацию трихлоруксусной кислоты в полученном растворе (приблизительно 80% раствор трихлоруксусной кислоты). 1 мл 1 М раствора натрия гидроксида соответствует 0,1634 г трихлоруксусной кислоты. Срок годности полученного раствора - 1 год. Раствор разводят водой до концентрации 20%. Срок годности 20% раствора трихлоруксусной кислоты - 1 мес. Метод В (с натрия додецилсульфатом). Определение проводят, как описано в методе А, но вместо 5 мл реактива В к растворам прибавляют по 1 мл щелочного реагента меди. Примечание. Приготовление щелочного реагента меди. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют в воде 0,2 г меди сульфата и 0,4 г натрия тартрата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 1 объем полученного раствора смешивают с 2 объемами 5% раствора натрия додецилсульфата и 1 объемом 3,2% раствора натрия гидроксида. Срок годности - 2 недели при комнатной температуре. 3. Метод Бредфорда Метод основан на измерении светопоглощения продукта взаимодействия красителя кислотного синего 90 с белком при длине волны 595 нм. Связывание красителя происходит в анионной форме преимущественно с остатками аргинина и в меньшей степени с остатками лизина, гистидина, триптофана и фенилаланина белка. Методика. 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,04-0,05 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорда, тщательно перемешивают и через 10 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 595 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм против раствора сравнения, содержащего растворитель и реактив Бредфорда. Окраска стабильна в течение 1 часа. Для соблюдения линейной зависимости оптической плотности определяемого белка от его концентрации конечная концентрация белка в растворе красителя должна быть 0,008-0,010 мг/мл. В частных фармакопейных статьях допускается изменение объемов испытуемого раствора и реактива Бредфорда с соблюдением данного условия. Содержание белка в растворе рассчитывают по калибровочному графику, построенному в пределах от 0,01 до 0,10 мг стандартного образца белка в 0,1 мл раствора. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе. Примечание. Приготовление реактива Бредфорда. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 0,05 г кислотного синего 90, растворяют в 25 мл спирта 96%, прибавляют 50 мл фосфорной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают. Реактив хранят при комнатной температуре во флаконе темного стекла. Срок годности - 2 недели. Перед использованием реактив фильтруют. Допускается использование коммерческого реактива Бредфорда. 4. Метод с бицинхониновой кислотой Метод основан на восстановлении двухвалентного иона меди в одновалентный при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина, пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса CU+ с бицинхониновой кислотой (2,2'-бихинолин-4,4'-дикарбоновая кислота-БХК). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть уменьшено разбавлением испытуемого раствора или устранено отделением белка путем его осаждения, описанного в методе Лоури. Интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, поэтому белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце. Методика. К 0,1 мл испытуемого раствора, содержащего 0,025-0,05 мг белка; 0,1 мл раствора стандартного образца белка и к 0,1 мл растворителя, используемого для приготовления испытуемого раствора, прибавляют 2 мл реагента меди с БХК. Выдерживают растворы при 37 град. C в течение 30 мин., охлаждают при комнатной температуре и через 60 мин. (от конца выдержки при 37 град. C) измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Содержание белка в испытуемом растворе рассчитывают по калибровочному графику. Примечания 1. Приготовление БХК-реагента. В мерной колбе вместимостью 1 л в воде растворяют 10 г бицинхониновой кислоты (БХК) или ее динатриевой соли, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают; pH полученного раствора должен быть 11,25. При необходимости pH доводят раствором натрия гидроксида 10% или натрия гидрокарбоната 5%. 2. Приготовление реагента меди с БХК. Смешивают 1 мл 4% раствора меди сульфата и 50 мл БХК-реагента. 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО СОДЕРЖАНИЮ АЗОТА Определение белка по содержанию азота основано на том, что содержание азота в большинстве белков практически одинаково и может быть принято равным 16%. По количеству найденного азота во взятой пробе рассчитывают содержание белка в лекарственном средстве, используя коэффициент пересчета азота на белок, равный 6,25. Другие азотсодержащие вещества, присутствующие в испытуемом образце, будут оказывать влияние на результаты определения. Определение белка по содержанию азота основано на разложении испытуемого образца при проведении анализа. При нагревании азотсодержащего органического соединения с серной кислотой концентрированной азот превращается в аммония сульфат, и его можно определить количественно. 1. Метод Къельдаля А. Микрометод. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение азота в органических соединениях" (раздел 2 - микрометод Къельдаля) из точной навески препарата, содержащей 10-20 мг белка. Б. Метод Къельдаля (обратное титрование). Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение азота в органических соединениях" (раздел 3, подраздел Б - определение азота преимущественно в препаратах крови) из точного объема испытуемого раствора, содержащего 50-200 мг белка. 2. Метод с реактивом Несслера Метод основан на цветной реакции ионов аммония с реактивом Несслера. Содержание азота в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандартного образца аммония сульфата, высушенного до постоянной массы в эксикаторе над серной кислотой или кальция хлоридом. Метод А. Точную навеску лекарственного средства, содержащую около 10 мг белка, минерализуют по способу, описанному в микрометоде Къельдаля. После минерализации пробу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. 0,5-1,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл воды, 2 мл реактива Несслера, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов без испытуемого образца. Калибровочный график строят в пределах содержания азота от 0,03 до 0,07 мг в 25 мл конечного раствора. Метод Б (с использованием фосфорновольфрамовой кислоты). В центрифужную термостойкую пробирку вместимостью 10 мл вносят от 0,5 до 3 мл испытуемого раствора с содержанием белка от 0,07 до 3,0 мг, доводят при необходимости объем 0,9% раствором натрия хлорида до 3 мл, прибавляют 0,3 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты и 0,3 мл серной кислоты концентрированной, тщательно перемешивают и оставляют на 18-20 ч при температуре 2-8 град. C. Осадок отделяют центрифугированием при скорости вращения 2000 об/мин. в течение 30 мин. при температуре 4-6 град. C. Осадок промывают смесью, состоящей из 1 мл воды, 0,1 мл серной кислоты концентрированной, 0,1 мл 20% раствора фосфорновольфрамовой кислоты, затем центрифугируют в тех же условиях. К осадку прибавляют 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Пробирку закрывают стеклянным колпачком или стеклянной воронкой и минерализуют на песчаной бане. Одновременно минерализуют контрольную пробу, содержащую 0,1 мл серной кислоты концентрированной. Для ускорения минерализации используют водорода пероксид, который периодически прибавляют по 1-2 капли в предварительно охлажденную пробирку. Минерализацию продолжают до образования осадка желтого цвета (8-10 ч или указанного в частной фармакопейной статье времени), окраска которого не изменяется в течение последних 1-1,5 ч. Пробирку охлаждают, доводят объем минерализата водой до 10 мл и перемешивают. 0,5 мл полученного раствора переносят в мерную пробирку, доводят водой до объема 9,5 мл и перемешивают; прибавляют 0,5 мл реактива Несслера и вновь перемешивают. Через 15 мин. измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 400-410 нм (указанной в частной фармакопейной статье) в кювете с толщиной слоя 10 мм. |