Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
В первый ряд пробирок вносят по 1 мл испытуемого образца в разведении 1:10, во второй ряд - по 1 мл в разведении 1:100, в третий ряд - по 1 мл в разведении 1:1000. В пробирки четвертого ряда вносят по 1 мл разбавителя, который используют для растворения, суспендирования или эмульгирования образца. Посевы инкубируют в течение не более 5 сут. Учет результатов Отмечают число пробирок в первом, втором и третьем рядах, в которых визуально наблюдают рост микроорганизмов. Среда в пробирках четвертого ряда (контроль разбавителя) должна оставаться стерильной. Полученное трехзначное число соответствует наиболее вероятному количеству жизнеспособных микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл лекарственного средства, приведенному в табл. 32.5. Таблица 32.5 Наиболее вероятное число микроорганизмов
Пример. В первом ряду рост микроорганизмов наблюдается в 3-х пробирках, во втором ряду - в 2-х пробирках, в третьем ряду - в 1 пробирке. Полученное число "321" по табл. 32.5 соответствует цифре "150". Следовательно, наиболее вероятное число бактерий в 1 г или 1 мл исследуемого образца - 150. Если учет результатов не может быть определен точно в связи с природой исследуемого препарата (помутнение среды, изменение ее цвета и т.п.), делают пересев на соответствующую жидкую или агаризованную среду, чтобы убедиться в наличии роста микроорганизмов. Варианты чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный и модифицированный глубинный) можно использовать при испытании различных лекарственных форм, независимо от уровня микробной загрязненности. Поверхностный агаровый метод предпочтительнее использовать при испытании нестерильных лекарственных средств с высоким уровнем микробной контаминации. Для количественного определения в ускоренные сроки бактерий и грибов, колонии которых склонны к сливному росту, используют модифицированный глубинный агаровый метод посева. Метод мембранной фильтрации используют при испытании растворов водорастворимых лекарственных средств и жиросодержащих лекарственных средств, растворимых в изопропилмиристате. Метод НВЧ используют при испытании лекарственных средств с низким уровнем микробной контаминации, а также в тех случаях, когда нельзя применить другие методы. Метод НВЧ менее чувствителен и точен по сравнению с чашечным агаровым методом или методом мембранной фильтрации. Метод используется только для определения общего числа бактерий, так как результаты, полученные для определения общего числа грибов, особенно плесневых, считаются недостоверными. 3.2.4. Повторение испытания В случае необходимости при повышенном уровне контаминации испытание повторяют, используя удвоенное количество препарата. 4. Определение отдельных видов бактерий Испытание включает использование селективных и дифференциально-диагностических питательных сред, а также сред для предварительной инкубации посевов исследуемых образцов. 4.1. Энтеробактерии и подобные им грамотрицательные микроорганизмы При выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae могут быть выделены другие подобные им виды микроорганизмов, например, бактерии рода Aeromonas и рода Pseudomonas. 4.1.1. Выделение бактерий Для восстановления жизнеспособности микроорганизмов, поврежденных во время технологического процесса, используют предварительную инкубацию образца в жидкой питательной среде. 10,0 г или 10,0 мл исследуемого образца переносят в 100 мл лактозного бульона (среда N 11), перемешивают и инкубируют в течение, как правило, двух часов, но не более пяти. После инкубации перемешивают содержимое флакона (гомогенат А) и переносят 10 мл (количество, соответствующее 1 г или 1 мл образца) в 100 мл среды обогащения (бульон Мосселя, среда N 3). Посев инкубируют в течение 18-48 ч. При появлении роста делают пересев бактериологической петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда N 4), которую инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч. При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей 10 пластырей помещают в 500 мл лактозного бульона (среда N 11), осторожно встряхивают, избегая вспенивания среды, в течение не менее 15 мин. 50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл среды обогащения (бульон Мосселя, среда N 3) и инкубируют в течение 18-24 ч. При наличии роста в жидкой среде пересевают петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда N 4), которую инкубируют при той же температуре в течение 18-24 ч для выделения энтеробактерии и других грамотрицательных микроорганизмов. Появление на плотной среде колоний грамотрицательных палочек является свидетельством того, что исследуемый образец контаминирован вышеупомянутыми бактериями. 4.1.2. Количественное определение Для посева используют три пробирки с 9 мл бульона Мосселя или среды N 3 в каждой. Гомогенат А в количестве 1 мл (соответствует 0,1 г образца) вносят в первую пробирку, тщательно перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,01 г образца) во вторую пробирку, снова перемешивают и переносят 1 мл (соответствует 0,001 г образца) в третью пробирку, меняя пипетку после каждого шага (рис. 32.1). Посевы инкубируют в течение 24-48 ч. Рис. 32.1. Схема количественного определения энтеробактерий ┌───────────────────┐ ┌─────────────┐ ┌────────────┐ │ 1 мл │ │ 1 мл │ │ 1 мл │ │ \/ │ \/ │ \/ │ ┌──────┐ ┌──────┐ ┌──────┐ ┌─────────┐ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ └──────┘ └──────┘ └──────┘ └─────────┘ ср. N 3 ср. N 3 ср. N 3 Гомогенат А 0,1 г 0,01 г 0,001 г В случае роста, для подтверждения наличия энтеробактерий делают пересев петлей на плотную среду (агар Мосселя, среда N 4) и инкубируют чашки Петри в течение 18-24 ч. Появление на плотной среде колоний грамотрицательных палочек является положительным тестом, отсутствие роста этих колоний - отрицательным тестом. Наиболее вероятное количество энтеробактерий и других грамотрицательных микроорганизмов в 1 г или 1 мл образца определяют по табл. 32.6. Таблица 32.6 Определение количества энтеробактерий и других грамотрицательных бактерий в образце ┌─────────────────────────────────────────────────────┬───────────────────┐ │ Соответствующее количество испытуемого образца │Наиболее вероятное │ ├───────────────┬──────────────────┬──────────────────┤количество бактерий│ │ 0,1 г │ 0,01 г │ 0,001 г │ в 1 г образца │ ├───────────────┼──────────────────┼──────────────────┤ │ │ 1 мл │1 мл гомогената 1 │1 мл гомогената 1 │ │ │ гомогената 1 │в разведении 1:10 │в разведении 1:100│ │ ├───────────────┼──────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤ │ + │ + │ + │ 3 │ │ │ │ │Более 10 │ ├───────────────┼──────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤ │ + │ + │ - │ 2 3 │ │ │ │ │От 10 до 10 │ ├───────────────┼──────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤ │ + │ - │ - │ 1 2 │ │ │ │ │От 10 до 10 │ ├───────────────┼──────────────────┼──────────────────┼───────────────────┤ │ - │ - │ - │ 1 │ │ │ │ │Менее 10 │ └───────────────┴──────────────────┴──────────────────┴───────────────────┘ Обозначения: (+) - положительный тест (-) - отрицательный тест 4.2. Выявление Escherichia coli Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон, среда N 8), перемешивают и инкубируют в течение 18-48 ч. 1 мл содержимого флакона переносят в 10 мл бульона Мак-Конки или среды N 3. Посевы инкубируют в течение 18-24 ч. При наличии роста, в случае равномерного помутнения среды в пробирках, делают пересев петлей на плотные среды - агар Мак-Конки или среду N 4. Посевы инкубируют в течение 18-48 ч (агар Мак-Конки) или 18-24 ч (среда N 4). На агаре Мак-Конки E.coli образует красные неслизистые колонии, на среде N 4 - малиновые колонии с металлическим блеском, окруженные малиновыми зонами, неслизистые. Подозрительные на принадлежность к E.coli колонии на плотных средах микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек отдельные колонии отсевают на скошенный в пробирках соево-казеиновый агар (среду N 1) и инкубируют в течение 18-24 ч. Для подтверждения используют биохимические тесты. Из пробирок с чистой культурой делают пересевы на агар Симмонса (среда N 14) и соево-казеиновый бульон (среда N 15), а также проводят тест на наличие фермента цитохромоксидазы. Через 18-24 ч инкубации отмечают бактериальный рост или его отсутствие на агаре Симмонса (среда N 14). Утилизацию цитрата устанавливают по смещению pH-среды в щелочную сторону (изменению цвета среды из зеленого в синий). Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности соево-казеинового бульона (среды N 15) при добавлении реактива Ковача. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом цитохромоксидаза, не утилизирующие цитрат натрия и образующие индол, считают, что лекарственное средство контаминировано E.coli. 4.2.1. Количественное определение E.coli Количественное определение E.coli проводят таким же образом, как количественное определение других энтеробактерий (раздел 4.1.2.), делая пересев из гомогената А в пробирки с бульоном Мак-Конки или средой N 3. В случае равномерного помутнения среды в пробирках для подтверждения наличия E.coli из каждой пробирки делают пересев петлей на плотную среду (агар Мак-Конки, среда N 4). Посевы инкубируют в течение 18-48 ч (агар Мак-Конки) или 18-24 ч (среда N 4). Появление на средах характерных для E.coli колоний грамотрицательных палочек (раздел 4.2.) является положительным тестом, отсутствие роста этих колоний - отрицательным тестом. Наиболее вероятное количество клеток E.coli в 1 г или в 1 мл образца определяют по табл. 32.6. 4.3. Выявление бактерий рода Salmonella 10,0 г или 10,0 мл исследуемого образца переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды N 8, перемешивают и инкубируют в течение 18-24 ч. При наличии роста 1 мл после перемешивания переносят в 10 мл тетратионатного бульона или среды N 12 и инкубируют в течение 16-24 ч. Делают пересев петлей минимум на 2 из 4-х плотных диагностических сред (Дезоксихолат-цитрат агар, Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар, Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой, Висмут-сульфит агар - среда N 5) и инкубируют в течение 24-48 ч. На Дезоксихолат-цитрат агаре бактерии из рода Salmonella образуют хорошо развитые бесцветные колонии. На Ксилоза-лизин-дезоксихолат агаре - хорошо развитые красные колонии с черными центрами или без них. На Агаре с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой - мелкие, блестящие, бесцветные, розовые или опалово-белые колонии, часто окруженные розовой или красной зоной. На Висмут-сульфит агаре (среда N 5) бактерии из рода Salmonella образуют, как правило, черные колонии с характерным металлическим блеском, при этом участок среды под колонией прокрашивается в черный цвет. Колонии, подозрительные на принадлежность к роду Salmonella, микроскопируют. При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек 2-3 характерные колонии (каждую отдельно) пересевают на трехсахарный агар с солями железа (среда N 13), нанося большое количество культуры петлей сначала на скошенную часть агара, а потом уколом в столбик, не касаясь дна пробирки. Через 24 ч инкубации отмечают изменение цвета из красного в желтый в столбике питательной среды. Почернение среды свидетельствует об образовании сероводорода - типичном признаке видов рода Salmonella. Параллельно ставят тест на наличие фермента "цитохромоксидаза", используя чистую культуру со скошенного соево-казеинового агара или среды N 1. Если требуется дополнительное подтверждение, можно использовать подходящие биохимические и серологические тесты. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, не обладающие ферментом "цитохромоксидаза", не ферментирующие сахарозу и лактозу и выделяющие сероводород, считают, что лекарственное средство контаминировано бактериями рода Salmonella. 4.4. Выявление Pseudomonas aeruginosa Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон, среда N 8), перемешивают и инкубируют в течение 24-48 ч. При наличии роста пересевают петлей на селективную питательную среду для выделения синегнойной палочки (цетримидный агар, цетилпиридиний хлорид (ЦПХ) агар - среда N 16). Выросшие колонии грамотрицательных палочек пересевают на среду N 9 для выявления сине-зеленого пигмента пиоцианин. Посевы инкубируют в течение 24-48 ч. Для подтверждения видовой принадлежности используют биохимический тест на наличие фермента "цитохромоксидаза" и способность выделенной культуры расти на соево-казеиновом бульоне или среде N 8 при температуре (42 +/- 1) град. C в течение 18-24 ч. При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей 10 пластырей помещают в 500 мл фосфатного буферного раствора, осторожно встряхивают в течение не менее 15 мин. 50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды N 8 и инкубируют в течение 24-48 ч. После инкубации, при наличии роста, пересевают петлей на селективные среды - цетримидный или ЦПХ-агары. Дальнейшую идентификацию проводят, как указано выше. Если в образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, образующие сине-зеленый пигмент пиоцианин, обладающие ферментом "цитохромоксидаза" и растущие при температуре (42 +/- 1) град. C, считают, что лекарственное средство контаминировано P.aeraginosa. 4.5. Выявление Staphylococcus aureus Исследуемый образец, разведенный стерильным буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл) в 100 мл жидкой питательной среды (соево-казеиновый бульон или среда N 8), перемешивают и инкубируют в течение 24-48 ч. При наличии роста пересевают петлей на селективные питательные среды: агар Фогеля-Джонсона, Берда-Паркера или среду N 10 и инкубируют в течение 24-48 ч. Черные блестящие колонии грамположительных кокков, окруженные желтыми зонами, на среде Фогеля-Джонсона, черные колонии на среде Берда-Паркера или золотисто-желтые колонии, окруженные желтыми зонами, на среде N 10 свидетельствуют о наличии S.aureus. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||