Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Ростовые свойства - это способность питательной среды обеспечивать эффективный и типичный рост соответствующих микроорганизмов. Селективные свойства - это способность питательной среды частично или полностью подавлять рост сопутствующих микроорганизмов (ассоциантов) при обеспечении роста тест-штаммов. Тест-микроорганизмы, штаммы-ассоцианты и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред представлены в табл. 32.7. Приготовление рабочей взвеси микроорганизмов Культуры бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида. Готовят стандартные взвеси каждого тест-штамма, соответствующие 10 Единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85. Для культур Bacillus subtilis, Bacillus cereus и 7 Candida albicans - это концентрация 10 КОЕ/мл, для Escherichia coli, 9 Salmonella abony, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus - 10 КОЕ/мл. Стандартные взвеси методом последующих десятикратных разведений 2 3 доводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 10 и 10 КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации рабочих взвесей бактерий и 3 C.albicans, высевают поверхностным методом из концентрации 10 КОЕ/мл по 0,1 мл на чашку с соответствующей агаризованной средой. Для смыва конидий A.niger с агара Сабуро используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий в 1 мл взвеси определяют с помощью камеры Горяева или посевом подходящего разведения на агар Сабуро. Для посева готовят рабочую взвесь A.niger с концентрацией конидий 3 0,5 x 10 в 1 мл, которую высевают поверхностным методом по 0,1 мл на чашки с агаром Сабуро. Приготовленные рабочие взвеси монокультур используют для определения ростовых и селективных свойств питательных сред. Для определения селективных свойств дополнительно готовят посевную дозу, состоящую из равных количеств рабочих взвесей тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта, при этом количество КОЕ штамма-ассоцианта должно быть на 2 порядка выше. Определение ростовых свойств агаризованных сред Испытуемую и стандартную агаризованные среды разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 мл, подсушивая агар после застывания. По 0,1 мл 3 рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 10 КОЕ/мл засевают поверхностным методом на чашки с испытуемой и стандартной средами в тройной повторности. На агаризованных средах после инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по формуле: N К = ----, N o где: N - среднее арифметическое число колоний на чашке с испытуемой средой; N - среднее арифметическое число колоний на чашке со стандартной o средой. Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. Определение ростовых свойств жидких сред Жидкие испытуемые и стандартные питательные среды разливают в стерильные пробирки размером 15x150 мм по 10 мл. По 1,0 мл рабочей взвеси 2 тест-микроорганизма с концентрацией 10 КОЕ/мл засевают в 3 пробирки с каждой средой. Рост микроорганизмов определяют визуально по помутнению и/или изменению цвета среды после периода инкубации. Из пробирок, в которых 3 наблюдается рост, после предварительного разведения до 10 КОЕ/мл делают пересев по 0,1 мл на соответствующую стандартную агаризованную среду. После инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по указанной выше формуле. Испытуемая жидкая среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой. Определение селективных свойств Для оценки селективных свойств питательных сред испытуемую и стандартную среды заражают взвесью тест-микроорганизмов (монокультура) и параллельно смесью тест-штамма и штамма-ассоцианта в определенной пропорции. В случае нескольких штаммов-ассоциантов каждый из них смешивают с тест-микроорганизмом отдельно. Посев на агаризованные среды осуществляют поверхностным методом. В 3 чашки с каждой средой (испытуемой и стандартной) вносят по 0,1 мл рабочей 3 взвеси монокультуры, содержащей около 10 КОЕ/мл. Параллельно в 3 чашки с каждой средой вносят по 0,1 мл посевной дозы, содержащей взвеси тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта. На всех засеянных чашках после оптимального срока инкубации при соответствующей температуре отмечают рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма-ассоцианта. Для посева на жидкие питательные среды (стандартную и испытуемую) аналогично используют монокультуру тест-микроорганизма и посевную дозу тест-микроорганизма со штаммом-ассоциантом. В 3 пробирки каждой среды вносят по 1 мл рабочей взвеси монокультуры тест-микроорганизма. Параллельно в 3 пробирки вносят по 1 мл посевной дозы тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта. Для качественной оценки селективных свойств среды через 24 ч инкубации делают пересев из каждой пробирки, в которой наблюдают рост, бактериологической петлей на чашки с соответствующей агаризованной средой. После инкубации на чашках должен наблюдаться рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма-ассоцианта. Для характеристики питательных сред учитывают коэффициент прорастания и селективные свойства, а также морфологию выросших колоний. Таблица 32.7 Тест-микроорганизмы и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред ┌────────────────────────┬──────────────┬──────────────────────────────────┬───────────────────────┐ │ Питательные среды │ Назначение │ Тест-микроорганизмы │ Время и температура │ │ │ │ │ инкубации │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Соево-казеиновый агар │Аэробные │Bacillus subtilis ATCC 6633 или │72 ч │ │- Среда N 1 для │бактерии │Bacillus cereus ATCC 10702; │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │выращивания бактерий │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │ │ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Сабуро агар с глюкозой│Дрожжи, │Candida albicahs NCTC 885-653 или │5 сут. │ │и антибиотиками │плесени │Candida albicans ATCC 10231; │(22,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 2 для │ │Aspergillus niger ATCC 9642 │ │ │выращивания грибов │ │ │ │ │ │ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ │ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Бульон Мосселя │Обогащение │Escherichia coli ATCC 25922; │24-48 ч │ │- Мак-Конки бульон │энтеробактерий│Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 3 для │ │ │ │ │обогащения │ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │энтеробактерий │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ │ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Мак-Конки агар │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24-48 ч │ │- Мосселя агар │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 4 для │ │ │ │ │выделения энтеробактерий│ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ │ │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Дезоксихолат-цитратный│Сальмонеллы │Salmonella abony IHE 103/39 │24-48 ч │ │агар │ │ │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Ксилоза-лизин- │ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │дезоксихолат агар │ │Escherichia coli ATCC 25922 │ │ │- Агар с бриллиантовым │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ │зеленым │ │Bacillus cereus ATCC 10702 │ │ │- Висмут-сульфитный агар│ │ │ │ │- Среда N 5 для │ │ │ │ │идентификации сальмонелл│ │ │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Бульон с глюкозой │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │ │- Среда N 6 для │ │Salmonella abony IHE 103/39; │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │идентификации │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │ │энтеробактерий │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Нитратный бульон │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │ │- Среда N 7 для │ │Salmonella abony IHE 103/39; │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │идентификации │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │ │энтеробактерий │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Соево-казеиновый │Аэробные │Bacillus cereus ATCC 10702 или │24 ч │ │бульон │бактерии │Bacillus subtilis ATCC 6633; │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 8 для │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │ │выращивания бактерий │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P;│ │ │ │ │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │ │ │ │ │(P.aeruginosa ГИСК 453) │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Лактозный бульон │Энтеробактерии│Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │ │- Среда N 11 для │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │предварительной │ │ │ │ │инкубации энтеробактерий│ │ │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Агар для выявления │Синегнойная │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │24-48 ч │ │пиоцианина P.aeruginosa │палочка │(P.aeruginosa ГИСК 453); │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 9 для │ │Escherichia coli ATCC 25922 │ │ │идентификации │ │ │ │ │P.aeruginosa │ │ │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Цетримидный агар │Синегнойная │Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 │24-48 ч │ │- ЦПХ-агар │палочка │(P.aeruginosa ГИСК 453) │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │для выделения │ │ │ │ │P.aeruginosa │ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │ │ │Escherichia coli ATCC 25922; │ │ │ │ │Staphylococcus aureus ATCC 6538-P │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Фогель-Джонсона агар │Золотистый │Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р;│48 ч │ │- Среда N 10 для │стафилококк │Staphylococcus epidermidis АТСС │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │выделения S.aureus │ │14990 │ │ │- Берда-Паркера агар │ │ │ │ │ │ │Штаммы-ассоцианты: │ │ │ │ │Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 │ │ │ │ │(P.aeruginosa ГИСК 453); │ │ │ │ │Escherichia coli АТСС 25922 │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Селенитовый бульон │Сальмонеллы │Escherichia coli АТСС 25922; │18-24 ч │ │- Тетратионатный бульон │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 12 для │ │ │ │ │выделения сальмонелл │ │ │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Трехсахарный агар с │Сальмонеллы │Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │ │солями железа │ │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 13 для │ │ │ │ │идентификации сальмонелл│ │ │ │ ├────────────────────────┼──────────────┼──────────────────────────────────┼───────────────────────┤ │- Цитратный агар │Кишечная │Escherichia coli ATCC 25922; │24 ч │ │Симмонса │палочка │Salmonella abony IHE 103/39 │(32,5 +/- 2,5) град. C │ │- Среда N 14 для │ │ │ │ │идентификации E.coli │ │ │ │ └────────────────────────┴──────────────┴──────────────────────────────────┴───────────────────────┘ ATCC - Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection), Соединенные Штаты Америки. ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий ГИСК им. Л.А.Тарасевича, Россия. IHE - Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, Чехия. CCM - Чешская коллекция микроорганизмов. Требование к ростовым свойствам питательных сред Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. Испытуемая жидкая (полужидкая) среда считается годной к употреблению, если после инкубации рабочей взвеси и пересеве подходящего разведения на агаризованную среду коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой. Требование к селективным свойствам питательных сред Испытуемая селективная питательная среда при посеве тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта должна обеспечивать доминирующий рост тест-микроорганизма при частичном или полном угнетении роста штамма-ассоцианта. Стерильность Не менее 10% емкостей (флаконов, пробирок) от каждой партии приготовленной питательной среды контролируют на стерильность, выдерживая их при соответствующей температуре в течение 48-72 ч. При обнаружении микробного роста хотя бы в одной из емкостей, испытанию на стерильность подлежит вся приготовленная партия среды. Хранение питательных сред Сухие питательные среды необходимо хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-30 град. C герметично закрытыми. После вскрытия упаковки на флаконе необходимо написать дату и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности. Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранятся 1 месяц при комнатной температуре или 3 месяца при (5 +/- 1) град. C. Срок годности сред, разлитых в чашки, составляет 7 дней при температуре (5 +/- 1) град. C. Исключение составляют чашки со средой N 4, срок годности которых не более 3 сут. без доступа света. 33. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР (ОФС 42-0068-07) Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата. -------------------------------- <*> Далее "стандартный образец" следует читать "Государственный стандартный образец". Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия - ЕД или "мкг". Для большинства антибиотиков 1 ЕД или "мкг" соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответствующие указания даются в частных фармакопейных статьях. При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Стандартные образцы антибиотиков хранятся и используются в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке стандартного образца. Метод определения. Тест-микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания указаны в табл. 33.1. В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя - агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест-микробом. Если культура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то температура расплавленной среды, в которую вносят тест-микроб, должна быть (49 +/-1) град. C, при использовании суспензии спор - 65-70 град. C. К среде следует добавить такое количество суспензии вегетативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный рост тест-микроба и четкость зон угнетения его роста. Таблица 33.1 Характеристика культуральных свойств тест-микроба ┌──────────────────┬─────────────────────────────────────┬──────────────────────────────┬───────────────────┐ |