Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Для идентификации используют реакцию плазмокоагуляции с чистой культурой стафилококка, отсеянной на соево-казеиновый агар или среду N 1. При испытании микробиологической чистоты трансдермальных пластырей, 10 пластырей помещают в 500 мл фосфатного буферного раствора, осторожно встряхивают в течение не менее 15 мин. 50 мл смыва пропускают через стерильный мембранный фильтр из нитрата целлюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, который переносят в 100 мл соево-казеинового бульона или среды N 8 и инкубируют в течение 24-48 ч. После инкубации при наличии роста пересевают петлей на агар Фогеля-Джонсона, Берда-Паркера или среду N 10 для выделения S.aureus. Если в образце обнаружены грамположительные кокки, ферментирующие маннит (среда Фогеля-Джонсона, среда N 10), обладающие ферментом коагулаза, считают, что лекарственное средство контаминировано S.aureus. 5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов 5.1. Тест на наличие цитохромоксидазы Реактив: 1% раствор N,N-диметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида. Раствор хранят при температуре от 4 до 10 град. C во флаконах нейтрального светозащитного стекла. Раствор должен быть бесцветным. Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом. Платиновой петлей или стеклянной палочкой наносят 24-часовую чистую культуру исследуемых бактерий, выросших на соево-казеиновом агаре или среде N 1. Темно-красное окрашивание, появляющееся в течение 1 мин., свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Положительным контролем служит культура P.aeruginosa, отрицательным - культура E.coli. 5.2. Тест на наличие индола Реактив Ковача: Спирта амилового или изоамилового - 75 мл Пара-диметиламинобензальдегида - 5 г Хлористоводородной кислоты конц. - 20 мл Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной бане при 50-55 град. C), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 град. C. Реактив должен быть желтого цвета. При неправильном хранении цвет реактива становится коричневым, и реактив непригоден для использования. В пробирку с соево-казеиновым бульоном или со средой N 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача и слегка встряхивают. Через несколько минут при наличии индола наблюдают появление красного кольца на поверхности среды в пробирке. Положительным контролем является культура E.coli, отрицательным - культура S.abony. 5.3. Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции) Сухую цитратную кроличью плазму разводят согласно приложенной инструкции 0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В пробирку помещают 1 петлю суточной культуры выделенных кокков, выращенных на соево-казеиновом агаре или на среде N 1. Положительным контролем служит культура S.aureus, отрицательным - культура S.epidermidis. Необходимо поставить также контроль неконтаминированной плазмы. Пробирки инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Реакцию плазмокоагуляции отмечают через каждый час в течение 4-6 ч, слегка наклоняя пробирку, но, не встряхивая ее. При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции удлиняют время инкубации до 24 ч для получения окончательных результатов. Тест на наличие коагулазы считается положительным при коагуляции плазмы. 6. Питательные среды. Определение ростовых и селективных свойств Для испытания лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства. Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры, а сухие питательные среды - согласно инструкции по применению предприятия-изготовителя. Необходимый pH питательных сред устанавливают при температуре (25 +/- 2) град. C. Среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин. при температуре 121 град. C, если нет других указаний, при условии валидации процесса стерилизации. Определение ростовых и селективных свойств проводят для каждой серии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории. Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие микроорганизмов-контаминантов лекарственных средств. 6.1. Рекомендуемые растворы и питательные среды - Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0 Калия фосфата однозамещенного 3,6 г Натрия фосфата двузамещенного 7,2 г Натрия хлорида 4,3 г Пептона (мясного или казеинового) 1,0 г Воды очищенной 1000 мл - Полужидкий агар для хранения тест-микроорганизмов Панкреатического гидролизата казеина 8,0 г Натрия хлорида 5,0 г Агара 5,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,0 +/- 0,2 - Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest Agar) Панкреатического гидролизата казеина 15,0 г Папаинового гидролизата бобов сои 5,0 г Натрия хлорида 5,0 г Агара 15,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2 Отечественная среда для выращивания аэробных бактерий - среда N 1 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками (Sabouraud Glucose Agar with antibiotics) Пептона (мясного и казеинового) 10,0 г Глюкозы моногидрата 40,0 г Агара 15,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 5,6 +/- 0,2 Отечественная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов - среда N 2 (агар Сабуро с глюкозой и антибиотиками) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. Перед употреблением добавляют 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и 0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных растворов или добавляют альтернативно 50 мг хлорамфеникола (левомицетина) на 1 л среды перед стерилизацией. - Бульон Мосселя для обогащения энтеробактерий (Enterobacteria Enrichment Broth - Mossel) Панкреатического гидролизата желатина 10,0 г Глюкозы моногидрата 5,0 г Бычьей желчи сухой 20,0 г Калия фосфата однозамещенного 2,0 г Натрия фосфата двузамещенного 8,0 г Бриллиантового зеленого 0,015 г Воды очищенной 1000 мл pH 7,2 +/- 0,2 Среду нагревают при 100 град. C в течение 30 мин. с последующим быстрым охлаждением. Отечественная среда обогащения для энтеробактерий - среда N 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Агар Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agai) Дрожжевого экстракта 3,0 г Панкреатического гидролизата казеина 7,0 г Солей желчи 1,5 г Лактозы моногидрата 10,0 г Натрия хлорида 5,0 г Глюкозы моногидрата 10,0 г Агара 15,0 г Нейтрального красного 0,03 г Кристаллического фиолетового 0,002 г Воды очищенной 1000 мл pH 7,4+/-0,2 Нагревают до кипения. Нельзя нагревать в автоклаве. Отечественная среда для выделения энтеробактерий - среда N 4 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных пооизводителей. - Бульон Мак-Конки (MacConkey Broth) Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г Лактозы моногидрата 10,0 г Бычьей желчи сухой 5,0 г Бромкрезолового пурпурного 10,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2 Отечественная среда обогащения для энтеробактерий - среда N 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Агар Мак-Конки (MacConkey Agar) Панкреатического гидролизата желатина 17,0 г Пептона (мясного и казеинового) 3,0 г Лактозы моногидрата 10,0 г Натрия хлорида 5,0 г Солей желчи 1,5 г Агара 13,5 г Нейтрального красного 0,03 г Кристаллического фиолетового 0,001 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,1 +/-0,2 Перед стерилизацией кипятят 1 мин., постоянно встряхивая. Отечественная среда для выделения энтеробактерий - среда N 4 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Дезоксихолат цитрат агар (Deoxycholate Citrate Agar) Мясного экстракта 10,0 г Мясного пептона 10,0 г Лактозы моногидрата 10,0 г Натрия цитрата 20,0 г Железа цитрата 1,0 г Натрия дезоксихолата 5,0 г Агара 13,5 г Нейтрального красного 0,02 г Воды очищенной 1000 мл pH 7,3 +/- 0,2 Доводят до кипения на медленном огне и кипятят в течение 1 мин., охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри. Нельзя нагревать в автоклаве. - Ксилоза, лизин, дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar) Ксилозы 3,5 г L-лизина 5,0 г Лактозы моногидрата 7,5 г Сахарозы 7,5 г Натрия хлорида 5,0 г Дрожжевого экстракта 3,0 г Фенолового красного 0,08 г Агара 13,5 г Натрия дезоксихолата 2,5 г Натрия тиосульфата 6,8 г Железа аммоний цитрата 0,8 г Воды очищенной 1000 мл pH 7,4 +/- 0,2 Доводят до кипения, охлаждают до 50 град. C и разливают в чашки Петри. Нельзя нагревать в автоклаве. - Агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, лактозой и сахарозой (Brilliant Green Agar Medium) Пептона (мясного и казеинового) 10,0 г Дрожжевого экстракта 3,0 г Натрия хлорида 5,0 г Лактозы моногидрата 10,0 г Сахарозы 10,0 г Агара 20,0 г Фенолового красного 0,08 г Бриллиантового зеленого 0,0125 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 6,9 +/- 0,2 Кипятят 1 мин. Используют сразу после автоклавирования. - Висмут-сульфит агар (Bismuth Sulfite agar) Мясного экстракта 5,0 г Мясного пептона 10,0 г Глюкозы моногидрата 5,0 г Натрия фосфата двузамещенного 4,0 г Железа сульфата 0,3 г Бриллиантового зеленого 0,025 г Висмута сульфита 8,0 г Агара 15,0 г Воды очищенной 1000 мл pH 7,6 +/- 0,2 Среду не автоклавируют. Приготовленная среда мутная, зеленого цвета. Отечественная среда для выделения сальмонелл - среда N 5 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Бульон с глюкозой (Dextrose Broth) Мясного пептона 10,0 г Мясного экстракта 3,0 г Натрия хлорида 5,0 г Глюкозы моногидрата 10,0 г Бромкрезола пурпурного 0,02 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 Отечественная среда для идентификации энтеробактерий - среда N 6 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Нитратный бульон (Nitrate Broth) Мясного пептона 8,6 г Натрия хлорида 6,4 г Калия нитрата 1,5 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 Отечественная среда для идентификации энтеробактерий - среда N 7 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth) Панкреатического гидролизата казеина 17,0 г Папаинового гидролизата бобов сои 3,0 г Натрия хлорида 5,0 г Калия фосфата двузамещенного 2,5 г Глюкозы моногидрата 2,5 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,3 +/- 0,2 Отечественная среда для выращивания бактерий - среда N 8 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Цетримидный агар (Cetrimide Agar) Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г Магния хлорида 1,4 г Калия сульфата двузамещенного 10,0 г Цетримида (цетилпиридиния бромида) 0,3 г Агара 13,6 г Глицерина 10,0 мл Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 Отечественная среда для выделения синегнойной палочки - ЦПХ-агар для выделения синегнойной палочки, сухая. - ЦПХ-агар Пептона сухого ферментативного 20,0 г Калия сернокислого 7,6 г Магния сернокислого семиводного 2,4 г Соды кальцинированной 1,0 г Фенозан-кислоты 0,2 г ЦПХ (N-цетилпиридиния хлористого 1-водного) 0,3 г Агара 8 г Воды очищенной 1000 мл рН 7,2 +/- 0,2 Среду не стерилизуют. - Агар для выявления пиоцианина Pseudomonas (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin) Панкреатического гидролизата желатина 20,0 г Магния хлорида безводного 1,4 г Калия сульфата безводного 10,0 г Агара 15,0 г Глицерина 10,0 мл Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде. Нагревают при перемешивании и кипятят 1 мин. Добавляют глицерин и стерилизуют. Отечественная среда для идентификации синегнойной палочки - среда N 9 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Агар Берда-Паркера (Baird-Parker Agar) Панкреатического гидролизата казеина 10,0 г Мясного экстракта 5,0 г Дрожжевого экстракта 1,0 г Лития хлорида 5,0 г Агара 20,0 г Глицина 12,0 г Натрия пирувата 10,0 г Воды очищенной 950 мл pH после стерилизации 6,8 +/- 0,2 После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 10 мл стерильного 1% раствора калия теллурита и 50 мл коммерческой желточной эмульсии. - Агар Фогеля-Джонсона (Vogel-Johnson Agar Medium) Панкреатического гидролизата казеина 10,0 г Дрожжевого экстракта 5,0 г Маннита 10,0 г Калия фосфата двузамещенного 5,0 г Лития хлорида 5,0 г Глицина 10,0 г Агара 16,0 г Фенолового красного 0,025 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 После стерилизации охлаждают до 45-50 град. C и добавляют 20 мл 1% стерильного раствора калия теллурита. Отечественная среда для выделения золотистого стафилококка - среда N 10 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Лактозный бульон (Lactose Monohydrate Broth) Мясного экстракта 3,0 г Панкреатического гидролизата желатина 5,0 г Лактозы моногидрата 5,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 6,9 +/- 0,2 После стерилизации следует быстро охладить среду. Отечественная среда для предварительного обогащения энтеробактерий - среда N 11 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Тетратионатный желчный бульон с бриллиантовым зеленым (Tetra-thionate Bile Brilliant Green Broth) Пептона 8,6 г Бычьей желчи сухой 8,0 г Натрия хлорида 6,4 г Кальция карбоната 20,0 г Калия тетратионата 20,0 г Бриллиантового зеленого 0,07 г Воды очищенной 1000 мл рН 7,0 +/- 0,2 Нагревают до кипения. Нельзя перегревать. Перед употреблением к 1000 мл среды добавляют 20 мл раствора йода с калия йодидом (6 г йода металлического, 5 г калия йодида, 20 мл воды очищенной). Отечественная среда для выделения сальмонелл - среда N 12 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar-Iron -Agar) Мясного экстракта 3,0 г Дрожжевого экстракта 3,0 г Пептона (казеинового и мясного) 20,0 г Натрия хлорида 5,0 г Лактозы моногидрата 10,0 г Сахарозы 10,0 г Глюкозы моногидрата 1,0 г Железо-аммоний цитрата 0,3 г Натрия тиосульфата 0,3 г Фенолового красного 0,025 г Агара 12,0 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,4 +/- 0,2 Среду разливают в пробирки, наполняя их на 1/3 объема. После стерилизации среду скашивают таким образом, чтобы образовались столбик и косяк. Отечественная среда для идентификации сальмонелл - среда N 13 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. - Цитратный агар Симмонса Натрия хлорида 5,0 г Магния сульфата 0,2 г Аммония дигидрофосфата 1,0 г Калия гидрофосфата 1,0 г Натрия цитрата 3,0 г Бромтимолового синего 0,08 г Агара 20 г Воды очищенной 1000 мл pH после стерилизации 7,2 +/- 0,2 Отечественная среда для идентификации E.coli - среда N 14 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей. Примечание. Входящие в состав питательных сред индикаторы и красители добавляют в виде растворов определенной концентрации. 6.2. Ростовые и селективные свойства питательных сред Основными биологическими критериями качества питательных сред являются их ростовые и селективные свойства, определяемые с помощью микроорганизмов и стандартных питательных сред. В качестве стандартных используют среды, готовые к употреблению, с сертификатом производителя, а также аттестованные в лаборатории среды высокого качества. |