Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
│ │подвергаются стерилизации │ 2 │ │ │ │10 в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие энтеробактерий │ │ │ │в 1 г или в 1 мл │ │ │В. Нестерильных лекарственных │- Отсутствие Pseudomonas │ │ │препаратов, относящихся к │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │ │ │Категории 2 │- Отсутствие Staphylococcus │ │ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │ ├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤ │2.2 │Субстанции синтетического │- Общее число аэробных бактерий │ │ │происхождения для производства│ 3 │ │ │нестерильных лекарственных │не более 10 в 1 г или в 1 мл │ │ │препаратов │- Общее число грибов не более │ │ │ │ 2 │ │ │ │10 в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │ │ │ │1 г или в 1 мл │ ├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤ │3.2 │Субстанции природного │- Общее число аэробных бактерий │ │ │происхождения (растительного, │ 4 │ │ │животного или минерального) │не более 10 в 1 г или в 1 мл │ │ │для производства нестерильных │- Общее число грибов не более │ │ │лекарственных препаратов │ 2 │ │ │ │10 в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │ │ │ │1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Salmonella в 10 г │ │ │ │или в 10 мл │ │ │ │- Отсутствие Pseudomonas │ │ │ │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Staphylococcus │ │ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │ │ │ │ 2 │ │ │ │- Энтеробактерий не более 10 │ │ │ │в 1 г или в 1 мл │ ├─────────┼──────────────────────────────┼────────────────────────────────┤ │4.2 │Вспомогательные вещества (мука│- Общее число аэробных бактерий │ │ │пшеничная, крахмал, тальк и │ 3 │ │ │т.д.) │не более 10 в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Общее число грибов не более │ │ │ │ 2 │ │ │ │10 в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Escherichia coli в │ │ │ │1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Salmonella в 10 г │ │ │ │или в 10 мл │ │ │ │- Отсутствие Pseudomonas │ │ │ │aeruginosa в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Отсутствие Staphylococcus │ │ │ │aureus в 1 г или в 1 мл │ │ │ │- Других энтеробактерий не более│ │ │ │ 2 │ │ │ │10 в 1 г или в 1 мл │ └─────────┴──────────────────────────────┴────────────────────────────────┘ Примечания к табл. 32.1 и 32.2 1. В нормативных документах могут быть указаны в виде исключения и другие нормы в зависимости от состава препарата и особенностей технологического процесса производства. 2. В нормативных документах на препараты для детей должны быть введены более жесткие нормы, а именно: количество аэробных бактерий в 1 г или в 1 мл - в пределах от 100 до 500, количество грибов - от 10 до 50, отсутствие бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. 3. При обнаружении во время проведения испытания других патогенных бактерий, кроме указанных выше, считают, что качество лекарственных средств, субстанций и вспомогательных веществ не соответствует требованиям по показателю "микробиологическая чистота". Испытание на микробиологическую чистоту включает способы подготовки образцов различных лекарственных форм перед испытанием, отбор образцов для анализа, методы количественного определения жизнеспособных бактерий и грибов, выявление и идентификацию отдельных видов бактерий, наличие которых недопустимо или ограничено в нестерильных лекарственных средствах, а также питательные среды, растворы и реактивы. Испытание проводят в асептических условиях, чтобы предотвратить контаминацию исследуемых образцов. 1. Определение антимикробного действия лекарственного средства Перед проведением контроля необходимо определить, обладает ли исследуемое лекарственное средство в условиях испытания на микробиологическую чистоту антимикробным действием, подавляющим рост отдельных видов бактерий и грибов, так как это может привести к неправильной оценке результатов анализа. Для определения антимикробного действия используют тест-микроорганизмы, представленные в табл. 32.3. Таблица 32.3 Тест-микроорганизмы для определения антимикробного действия
Кроме вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать и другие микроорганизмы из различных коллекций, типичные по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства. КонсультантПлюс: примечание. Нумерация абзацев дана в соответствии с официальным текстом документа. 1.2. Работа с тест-микроорганизмами Ампулы с лиофилизированными культурами бактерий и грибов вскрывают в асептических условиях и вносят в них около 0,5 мл соответствующей жидкой питательной среды (например, среда N 8 - для бактерий, жидкая среда Сабуро - для C.albicans). Полученную взвесь тест-культур переносят в пробирки с теми же жидкими питательными средами и инкубируют при соответствующей температуре в течение 24 ч (бактерии) или 48 ч (C.albicans). После 2-3-х пассажей с бульона на бульон культуру микроорганизмов пересевают с помощью бактериологической петли на питательный агар в чашках Петри для получения изолированных колоний. Выросшую культуру каждого тест-штамма проверяют визуально на чистоту роста, изучают культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические свойства. Типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный агар того же состава и инкубируют, как было указано выше, считая полученную культуру исходной. Культуру A.niger пересевают на агар Сабуро и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут. до появления конидий (экзогенных спор черного или темно-коричневого цвета). Культуры бактерий пересевают каждый месяц, грибов - каждые 3 месяца, делая не более 5 пассажей с агара на агар, после чего используют новую ампулу или исходную культуру со среды хранения. Тест-штаммы бактерий хранят при температуре (5 +/- 1) град. C в лиофилизированном состоянии или под слоем стерильного вазелинового масла на среде Романова. Тест-культуру C.albicans хранят под слоем стерильного вазелинового масла на среде N 2 (агар Сабуро), в которой количество агара уменьшено до 0,5%. Тест-культуру A.niger хранят на среде N 2. При пересеве культур со сред хранения предварительно удаляют слой масла над агаром, бактериологической петлей снимают верхний слой агара с выросшей культурой и переносят его в пробирки со средой N 8 для бактерий, жидкой средой Сабуро - для C.albicans. Посевы на среде N 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 18-24 ч, посевы на жидкой среде Сабуро - при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч для C.albicans. Для получения конидий культуру A.niger пересевают на среду N 2 и инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5-7 сут. 1.2.1. Приготовление спор B.subtilis Если не удается получить гомогенную взвесь клеток B.subtilis, используют споры, получаемые следующим образом. Культуру B.subtilis выращивают в пробирке на скошенном соево-казеиновом агаре или среде N 1 в течение 24 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Смывают 5 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида со стерильными стеклянными бусами. Взвесь бактерий переносят в матрац с 300 мл скошенного питательного агара, содержащего для ускорения спорообразования марганца сульфат в количестве 1 мг/л среды. Посевы инкубируют в течение 7 сут. при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C. Для подтверждения достаточного образования спор выросшую культуру микроскопируют. Если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в поле зрения 80-90% спор, делают смыв культуры, внося в матрац 45 мл стерильного 0,9% изотонического раствора натрия хлорида. Нагревают полученную взвесь 30 мин. на водяной бане при температуре 65 град. C, центрифугируют при 4300 об./мин. в течение 15 мин., отмывают не менее 3 раз стерильным 0,9% изотоническим раствором натрия хлорида до полной прозрачности надосадочной жидкости. Снова нагревают на бане при температуре 65 град. C в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 15 мин., ресуспендируют осадок (споры) в том же растворе, определяют количество спор в 1 мл чашечным агаровым методом. Хранят суспензию спор при (5 +/- 1) град. C в запаянных ампулах или пробирках не менее 8 недель. 1.3. Проведение испытания Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов. 1.3.1. Разведение лекарственного средства Готовят необходимые разведения лекарственного средства 1:10, 1:50, 1:100, 1:500 и 1:1000 методом последовательных разведений, используя фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном pH 7,0 (п. 4.2.). 1.3.2. Приготовление инокулята 24-часовые бульонные культуры бактерий на соево-казеиновом бульоне или среде N 8 и 48-часовую культуру C.albicans на бульонной среде Сабуро разводят стерильным раствором натрия хлорида 0,9% изотоническим 1:1000 (B.cereus, C.albicans) и 1:100000 (E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus) 4 до концентрации около 10 КОЕ/мл. Взвесь спор B.subtilis также разводят до 4 концентрации 10 в 1 мл. Культуру A.niger смывают со скошенного агара Сабуро или со среды N 2 фосфатным буферным раствором с 0,05% твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или 4 чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 10 КОЕ/мл. 1.3.3. Метод определения антимикробного действия в условиях испытания на микробиологическую чистоту Каждое разведение препарата в количестве 1 мл вносят в 6 чашек Петри диаметром 90 мм, в две из которых добавляют по 0,2 мл взвеси спор B.subtilis, в две другие - по 0,2 мл взвеси культуры C.albicans, в 2 последние - 0,2 мл взвеси конидий A.niger. Чашки с бактериями заливают 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (47,5 +/- 2,5) град. C питательного агара, чашки с культурами грибов - тем же количеством среды Сабуро. По 1,0 мл каждого разведения препарата вносят в пробирки с 10 мл жидких сред N 3 и N 8 (или аналогичных), куда затем добавляют по 1 мл взвеси Е.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus соответственно средам, каждый микроорганизм отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений препарата вносят такое же количество растворителя. Опыт ставят в двойной повторности. Посевы на средах N 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч (среды N 3, 8) и 5 сут. (среда N 1). Посевы на среде N 2 инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут. После окончания сроков инкубации отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках без препарата и наличие или отсутствие роста тест-штаммов на средах с различными разведениями препарата. В случае помутнения или изменения окраски среды, затрудняющих учет результатов, делают пересевы на агаризованные среды. При росте типичных колоний E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus отмечают отсутствие антимикробного действия исследуемого препарата. 1.3.4. Метод репликаций Для водонерастворимых (суспензии, эмульсии и др.) или окрашенных соединений предпочтительно использовать метод репликаций. В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого препарата. В контрольные чашки вносят по 1 мл разбавителя, используемого для получения разведений. В чашки Петри как в эксперименте, так и в контроле, добавляют по 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (45 +/- 2) град. C соево-казеинового агара или среды N 1, в другие - такое же количество среды Сабуро и тщательно перемешивают. Опыт ставят в двойной повторности. После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды, на которую затем бактериологической петлей, пипеткой или репликатором наносят инокулят (п. 1.3.2.) каждого тест-штамма бактерий и грибов в виде бляшек на среды N 1 и N 2 (или аналогичные) соответственно. Чашки с соево-казиновым агаром или средой N 1 инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 48 ч. Чашки со средой Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение не более 5 сут. 1.4. Учет и интерпретация результатов Наличие такого же роста тест-микроорганизмов, как в контроле, обозначают знаком "+", отсутствие роста - знаком "-", слабый, замедленный или угнетенный рост - знаком "+/-". Если по сравнению с контролем на средах с препаратом наблюдают заметное уменьшение количества колоний на чашках (более 70%) или отсутствие роста тест-микроорганизмов, делают заключение о наличии антимикробного действия. Первое из последовательных разведений препарата, в котором отсутствует антимикробное действие, используют для посева на соответствующую питательную среду. 1.5. Способы устранения антимикробного действия лекарственных средств Для устранения антимикробного действия препаратов применяют следующие методы: - Используют соответствующие специфические инактиваторы (например, парааминобензойную кислоту (ПАБК) и бета-лактамазу), нейтрализующие антимикробное действие препарата, но не угнетающие рост микроорганизмов, контаминирующих НЛС. - Используют неспецифические инактиваторы, добавляя в буферный раствор и/или в питательные среды: твин-20, твин-80, соевый или яичный лецитин и др. Для разведения лекарственного средства перед испытанием на микробиологическую чистоту можно использовать стерильную нейтрализующую жидкость. Если разведение в вышеприведенном растворе не инактивирует антимикробные свойства лекарственного средства, увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина. Альтернативно допускается добавление в буферный раствор других веществ, инактивирующих антимикробное действие лекарственных средств. - Увеличивают разведение препарата, взяв больший объем растворителя в пределах норм допустимой микробной загрязненности. - Применяют метод мембранной фильтрации с последующей промывкой фильтров, если позволяет природа исследуемого лекарственного средства, т.е. препарат растворим в воде или в изопропилмиристате (ИПМ). 1.5.1. Инактивация некоторых антибиотиков Для инактивации пенициллинов и цефалоспоринов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспендирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды перед их употреблением, асептически вносят стерильный раствор бета-лактамазы в количестве, указанном в частной фармакопейной статье. 1.5.2. Инактивация сульфаниламидных препаратов Для инактивации сульфаниламидных препаратов, независимо от их лекарственной формы, в буферный раствор, используемый для растворения, суспен-дирования или эмульгирования образца, а также в питательные среды до стерилизации вносят парааминобензойную кислоту (ПАБК) из расчета 0,05 г/л среды, если антимикробное действие не удается устранить путем разведения. 1.5.3. Инактивация консервантов, входящих в состав лекарственных средств Для инактивации консервантов, входящих в состав ряда лекарственных препаратов, в буферный раствор, в котором эмульгируют образец, а также в питательные среды до стерилизации вносят следующие неспецифические инактиваторы: 3% твина-80 или 0,3% лецитина (яичного или соевого) от объема среды. В случае, если в препарате имеется более 2 консервантов различной химической структуры, в среду вносят 0,3% лецитина; 3% твина-80; 0,1% L-гистидина и 0,5% натрия тиосульфата одновременно. Инактиваторы антимикробного действия консервантов лекарственных средств указаны в табл. 32.4. Таблица 32.4 Инактиваторы антимикробного действия консервантов лекарственных средств ┌─────────────┬──────────────────────┬──────────────────┬─────────────────┐ │ Химические │ Инактиватор │ Концентрация │ Примечание │ │ соединения │ │ │ │ ├─────────────┼──────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤ │Фенолы │- Натрия лаурилсульфат│4,0 г/л │Добавляют в │ │ │- Твин-80 и лецитин │30,0 г/л и 3,0 г/л│стерильный │ │ │- Яичный желток │5,0-50,0 мл/л │буферный раствор │ │ │ │ │с натрия хлоридом│ │ │ │ │и пептоном pH 7,0│ ├─────────────┼──────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤ │Ртутно- │Натрия тиогликолят │0,5-5,0 г/л │ │ │органические │ │ │ │ │соединения │ │ │ │ ├─────────────┼──────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤ │Галогены │Натрия тиосульфат │5,0 г/л │ - │ ├─────────────┼──────────────────────┼──────────────────┼─────────────────┤ |