Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
u полученное по п испытаниям; d - среднее значение диаметра зон задержки роста для контрольной s концентрации, полученное по тем же n испытаниям. Число степеней свободы величины S равно 3. lgCu Пример. Вычислим S с использованием данных примера, приведенного lgCu в основном тексте статьи для иллюстрации вычисления параметров стандартной кривой. 2 Расчеты S удобно проводить с помощью следующей таблицы. 0 ┌─────────┬────────┬─────────┬────────────┬─────────────────────┬─────────┐ │ │ │ │ │ 2 │ 2 │ │ Ci, │ lgCi │ di │a + b lg Ci,│[di - (a + b lg Ci) │ Ig Ci │ │ │ │ │ │ │ │ ├─────────┼────────┼─────────┼────────────┼─────────────────────┼─────────┤ │ 3,2 │ 0,5051 │ 17,64 │ 17,63 │ 0,0001 │ 0,2551 │ │ 4,00 │ 0,6021 │ 18,15 │ 18,26 │ 0,0121 │ 0,3625 │ │ 5,00 │0,69900,│ 19,03 │ 18,90 │ 0,0169 │ 0,4886 │ │ 6,25 │ 0,7959 │ 19,58 │ 19,53 │ 0,0025 │ 0,6334 │ │ 7,8 │ 0,8921 │ 20,09 │ 20,16 │ 0,0049 │ 0,7958 │ ├─────────┼────────┼─────────┼────────────┼─────────────────────┼─────────┤ │Суммы по │ 3,4942 │ │ │ 0,0365 │ 2,5354 │ │столбцам │ │ │ │ │ │ └─────────┴────────┴─────────┴────────────┴─────────────────────┴─────────┘ При вычислении значений а + b lg Ci необходимо брать достаточное число знаков для a и b. Пусть число испытаний образца в опыте n = 1, d = 18,61 и d - 18,44. s u _ _ Тогда d = d = 18,61; d = d = 18,44. S s u u Найдем S : lgCu 2 S = 0,0365 : 3 = 0,01217; 0 ------------------------------------------------- / 2 /0,01217 5 x (18,44 - 18,61) S = / ------- x (0,2 + 1 + -----------------------------) = 0,0185. lg C / 2 2 2 U \/ 6,532 6,532 x (5 х 2,5355 - 3,4943) Приложение N 2 Объединение результатов и опытов, выполненных с одним и тем же разведением образца гамма , проводится с усреднением значений логарифмов u активностей испытуемого с учетом ошибок их определения в каждом опыте по формуле: _ N N lg C = (SUM gj lg C ) : SUM gj, U j=1 Uj j=1 2 где gj = 1 : S lg C . Uj _ Ошибка определения величины lg C при этом будет равна: U ------ _ / N S lg C = 1 : / SUM gj. U \/ j=1 Доверительный интервал для величины логарифма истинной активности записывается с учетом значения критерия Стьюдента, взятого из таблиц для N доверительной вероятности P = 0,95 и числа степеней свободы f = SUM fj, где j=1 fj - число степеней свободы величины S lg C : Uj Пример. Проведены два опыта по определению активности препарата. Разведение испытуемого гамма = 200. В первом опыте два испытания дали u следующие результаты: lg С1 = 0,6221; S = 0,0170 при f1 = 3. lg С1 Во втором опыте по четырем испытаниям имели: lg C2 = 0,6305; S = 0,0099 при f2 = 3. lg C2 Для объединения результатов проводят следующие вычисления: 2 g1 = 1 : 0,017 = 3460; 2 g2 = 1 : 0,0099 = 10203; g1 + g2 = 13663; _ lg С = (3460 х 0,6221 + 10203 х 0,6305) : 13663 = 0,6284; U ----- S lg С = 1 : \/13663 = 0,0086. U Границы доверительного интервала для логарифма истинной активности образца получают с использованием величины t (0,95; 6) = 2,45: 0,6284 +/- 2,45 х 0,0086 = 0,6284 +/- 0,0211. Таким образом, нижняя граница - 0,6073, верхняя граница - 0,6495. Потенцируя, найдем среднее значение и границы доверительного интервала для истинной активности основного рабочего раствора испытуемого: 4,250; 4,049; 4,462. Учет степени разведения при получении основного рабочего раствора позволяет получить среднее значение, а также нижнюю и верхнюю границу несимметричного доверительного интервала для истинной активности испытуемого: 850; 810; 892. Точность определения должна быть такова, чтобы доверительные границы при Р = 95% отклонялись от среднего значения не более чем на +/- 5%. В данном случае, используя верхнюю границу доверительного интервала, имеем: 892 - 850 42 --------- х 100% = ----- х 100% = 4,94% < 5%. 850 850 34. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНЫХ КОНСЕРВАНТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (ОФС 42-0069-07) Антимикробные консерванты - это вещества, обладающие антимикробным действием, которые добавляют в лекарственные средства для предотвращения роста и развития микроорганизмов, которые могут попасть в них во время технологического процесса или при неоднократном употреблении лекарственного средства. Консерванты входят в состав лекарственных средств. Для защиты пациента эффективная концентрация консерванта в готовом лекарственном средстве должна быть значительно ниже дозы, токсичной для человека. Испытание эффективности антимикробных консервантов состоит из искусственного заражения лекарственного средства суспензиями определенных тест-микроорганизмов, инкубации контаминированных образцов при определенной температуре, отбора проб через указанные интервалы времени и подсчете жизнеспособных клеток микроорганизмов в 1 г или в 1 мл лекарственного средства на протяжении периода испытания. Предлагаемый метод определения эффективности консервантов применяется для готовых лекарственных средств в неповрежденной упаковке. Все лекарственные средства, в состав которых входят консерванты, разделены на четыре категории (табл. 34.1). Таблица 34.1 Категории лекарственных средств, в состав которых входят консерванты
Тест-микроорганизмы Антимикробное действие консервантов определяют в отношении некоторых видов бактерий и грибов: Escherichia coli ATCC 25922, Pseu-domonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Candida albicans NCTC 885-653, Aspergillus niger ATCC 9642. Примечания 1. Помимо вышеперечисленных тест-штаммов можно использовать другие типовые штаммы одноименных видов микроорганизмов из национальных коллекций. 2. Набор тест-микроорганизмов может быть уменьшен или увеличен в зависимости от способа применения или состава испытуемого лекарственного средства. Все культуры микроорганизмов, полученные из Национальных коллекций в ампулах, следует оживлять согласно прилагаемым инструкциям. Условия культивирования тест-микроорганизмов для приготовления инокулята представлены в табл. 34.2. Таблица 34.2 Условия культивирования тест-микроорганизмов для приготовления инокулята
-------------------------------- <*> Допускается использование альтернативных жидких и агаризованных питательных сред отечественного и зарубежного производства, зарегистрированных в РФ. Приготовление инокулята Выросшие культуры тест-штаммов бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным изотоническим раствором натрия 9 хлорида 0,9%. Концентрацию клеток бактерий доводят до 10 , a C.albicans до 7 10 КОЕ в 1 мл, используя отечественный стандартный образец мутности 10 ЕД ОСО 42-28-59-85 или международный стандарт мутности (The International Reference Preparation of Opacity of 10 International Units), или инструментальный, в том числе турбодиметрический метод. Для смыва конидий A.niger используют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,05% твина-80. Количество конидий A.niger в 1 мл смыва определяют с помощью камеры Горяева или чашечным агаровым методом. Полученную взвесь разводят до концентрации 107 конидий в 1 мл. Стандартизованные суспензии всех тест-микроорганизмов разводят до 7 8 концентрации 10 -10 КОЕ/мл. Техника испытания Отбирают препараты в конечной, неповрежденной упаковке. В 5 стерильных флаконов помещают по 20 мл исследуемого препарата. В каждый флакон вносят по 0,1 мл одного из приготовленных инокулятов тест-микроорганизмов: E.coli, P.aeruginosa, S.aureus, C.albicans, A.niger и перемешивают. Лекарственные средства категорий 1,2, 3 (табл. 34.1) контаминируют тест-микроорганизмами 5 6 в конечной концентрации 10 -10 КОЕ в 1 мл или 1 г. Для категории 4 (табл. 34.1) конечные концентрации тест-микроорганизма для искусственной 3 4 контаминации лекарственного средства должны быть в пределах от 10 до 10 КОЕ в 1 мл или 1 г. Лекарственные средства, приготовленные на твердой мазевой основе, нагревают до температуры от (47,5 +/- 2,5) град. C. Используя стерильные стеклянные бусы или шпатель, смешивают каждый инокулят стандартизованной микробной суспензии с образцом лекарственного средства в течение не менее 1 мин. до достижения гомогенной эмульсии. Для улучшения смешивания можно добавить стерильное поверхностно-активное вещество, например твин-80, если оно не влияет на жизнеспособность микроорганизмов или на эффективность консерванта. Фактическую исходную концентрацию бактерий и грибов в контаминированных образцах определяют сразу после контаминации чашечным агаровым методом посева на соответствующие питательные среды (табл. 34.2), используя подходящие разведения для получения на чашке от 30 до 300 колоний бактерий и от 10 до 100 колоний грибов. Можно также применять для этой цели метод мембранной фильтрации. Контаминированные образцы лекарственного средства выдерживают при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в защищенном от света месте. Через 7, 14 и 28 сут. после инокуляции для препаратов 1 категории и через 14,28 сут. для препаратов 2-4 категории определяют количество жизнеспособных микроорганизмов в 1 мл образца. В случае необходимости вводят инактиватор (нейтрализатор) на определенное антимикробное вещество в чашки с питательной средой или в соответствующее разведение лекарственного средства перед посевом на чашки. Результаты испытания и их интерпретация Чашечным агаровым методом определяют количество КОЕ/мл для каждого тест-микроорганизма через указанные выше сроки инкубации контаминированного лекарственного средства. Изменение количества микробных клеток по сравнению с исходной концентрацией в 1 мл выражают в десятичных логарифмах (log10). Для оценки эффективности антимикробного действия консервантов используют критерии, указанные в табл. 34.3. Увеличение КОЕ/мл не фиксируется, если последующее измерение превышает предыдущее менее чем на 0,5 log10 единицы измерения. Консерванты считают эффективными, если они соответствуют критериям, описанным в табл. 34.3. Таблица 34.3 Критерии оценки эффективности антимикробных консервантов лекарственных средств
РЕАКТИВЫ 35. РЕАКТИВЫ. ИНДИКАТОРЫ (ОФС 42-0070-07) Агар. Пористые пластины толщиной не более 20 мм или пленки толщиной не более 0,5 мм белого или светло-желтого цвета; допускается слегка сероватый оттенок. Потеря в массе при высушивании - не более 20%. Содержание тяжелых металлов - не более 40 ppm Pb. Агароза для хроматографии. 4% суспензия в воде набухших гранул диаметром от 60 до 140 мкм. Используют в гель-хроматографии для разделения 4 6 белков с молекулярными массами от 6 x 10 до 20 x 10 и полисахаридов с 3 6 молекулярными массами от 3 x 10 до 5 x 10 . Агароза поперечно-сшитая для хроматографии (1) Получают из агарозы реакцией с 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. 4% суспензия в воде набухших гранул диаметром от 60 до 140 мкм. Используют в гель-хроматографии для разделения белков с молекулярными 4 6 массами от 6 x 10 до 20 x 10 и полисахаридов с молекулярными массами от 3 6 3 x 10 до 5 x 10 . Агароза поперечно-сшитая для хроматографии (2) Получают из агарозы реакцией с 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. 4% суспензия в воде набухших гранул диаметром от 60 до 140 мкм. Используют в гель-хроматографии для разделения белков с молекулярными 4 6 массами от 7 x 10 до 40 x 10 и полисахаридов с молекулярными массами от 5 7 1 x 10 до 2 x 10 . Агароза для электрофореза Нейтральный линейный полисахарид, основной компонент которого получают из агара. Порошок белого или почти белого цвета. Практически нерастворима в холодной воде, очень мало растворима в горячей воде. Агароза-ДЭАЭ для ионообменной хроматографии Поперечно-сшитая агароза, с замещенными дизтиламиноэтильными группами, в виде шарообразных гранул. Агароза/поперечно-сшитый полиакриламид Агароза в поперечно-сшитой полиакриламидной матрице. Используют для 4 разделения глобулярных белков с молекулярными массами от 2 x 10 до 4 35 x 10 . Аденозин. C10H13N5O4. (М.м. 267,25). 6-Амино-9-бета-D-рибофуранозил-9Н-пурин. Кристаллический порошок белого цвета. Мало растворим в воде, практически нерастворим в ацетоне, спирте 96% и эфире; растворяется в разведенных растворах кислот. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||