Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
│Четвертичные │Яичный желток │5,0-50,0 мл/л │Добавляют в │ │соединения │ │ │стерильный │ │аммония │ │ │буферный раствор │ │ │ │ │с натрия хлоридом│ │ │ │ │и пептоном pH 7,0│ └─────────────┴──────────────────────┴──────────────────┴─────────────────┘ В качестве растворителя для устранения антимикробного действия используют также нейтрализующую жидкость лабораторного или промышленного изготовления следующего состава: Твина-80 - 30,0 г Лецитина (яичного или соевого) - 3,0 г Гистидина гидрохлорида - 1,0 г Пептона (мясного или казеинового) - 1,0 г Натрия хлорида - 4,3 г Калия фосфата однозамещенного - 3,6 г Натрия фосфата двузамещенного - 7,2 г Воды очищенной - 1000 мл Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации pH после стерилизации - 7,6 +/- 0,2 Если в связи с природой лекарственного средства, нерастворимого в воде или изопропилмиристате, нельзя использовать метод мембранной фильтрации, а все вышеперечисленные методы устранения его антимикробного действия в отношении конкретного тест-микроорганизма неэффективны, этот вид испытания не проводят. 2. Особенности отбора и подготовки образцов для анализа От каждой исследуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, отбирают образец для анализа из достаточного количества разных упаковок препарата (не менее 3-5). 2.1. Твердые лекарственные формы 2.1.1. Образец для анализа При анализе препарата используют 10 г образца для определения общего числа бактерий и грибов в 1 г препарата, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus и E.coli, 10 г образца - для определения Salmonella, 10 г - для количественного определения других энтеробактерий, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. 2.1.2. Таблетки, драже, гранулы, порошки и др. 10 г образца (если другое количество не указано в частной фармакопейной статье) измельчают (в случае необходимости) в стерильных фарфоровых ступках или с помощью специального оборудования и переносят в 100 мл буферного раствора. Далее проводят количественное и качественное определение микроорганизмов. 2.1.3. Капсулы 10 г образца переносят в 100 мл буферного раствора, содержащего не более 5% твина-80 и нагретого до температуры не выше 40 град. C. После суспендирования капсул в буферном растворе проводят количественное и качественное определение микроорганизмов. 2.2. Мягкие лекарственные формы 2.2.1. Образец для анализа При анализе используют 10 г препарата для определения общего числа бактерий и грибов, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus, E.coli в 1 г препарата, 10 г образца - для испытания на наличие бактерий сем. Enterobacte-riaceae в 1 г препарата, если нет других указаний в частной фармакопейной статье. 2.2.2. Мази, линименты, кремы, суппозитории, легко смешиваемые с водой 10 г образца помещают в стерильную колбу, содержащую 100 мл буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов. 2.2.3. Мази, линименты, кремы, суппозитории, трудно смешиваемые с водой 10,0 г образца смешивают со стерильным твином-80, количество которого не должно быть более 1/2 объема образца (в данном случае 5 г). Смесь нагревают на водяной бане или в термостате до температуры не выше 40 град. C (в исключительных случаях - до 45 град. C) и осторожно перемешивают. При этом время нагревания не должно превышать 30 мин. Добавляют необходимое количество предварительно нагретого до соответствующей температуры стерильного фосфатного буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь осторожно перемешивают для получения гомогенной эмульсии в разведении 1:10, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов. При необходимости готовят последующие десятикратные разведения, используя фосфатный буферный раствор, содержащий соответствующую концентрацию стерильного твина-80. 2.3. Жидкие лекарственные формы 2.3.1. Образец для анализа При анализе препарата используют 10 мл образца для определения общего числа бактерий и грибов в 1 мл препарата, для испытания на наличие P.aeruginosa, S.aureus и E.coli, 10 мл образца - для количественного и качественного определения E.coli и других энтеробактерий, 10 мл - для определения Salmonella. 2.3.2. Растворы, суспензии, сиропы, микстуры 10 мл образца переносят в 90 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов. 2.3.3. Растворы в маслах, эмульсии 10 мл образца помещают в стерильную колбу, содержащую 90 мл буферного раствора с твином-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов. 2.4. Аэрозоли 2.4.1. Образец для анализа При анализе препарата используют 3 г образца для определения общего числа аэробных бактерий и грибов в 1 г препарата и испытания на наличие Raeruginosa, S.aureus, 3 г образца - для испытания на наличие бактерий семейства Enterobacteriaceae. Образец отбирают путем многократных нажатий на шток клапана (насадку). 2.4.2. Аэрозоли на основе спиртов 3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов. 2.4.3. Аэрозоли на основе масел 3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора с твином-80 в количестве не более 5% и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм. Смесь нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C и энергично встряхивают до получения гомогенной эмульсии, которую используют для количественного и качественного определения микроорганизмов. 2.4.4. Аэрозоли на основе твердых веществ 3 г образца (после испарения пропеллента) переносят в 30 мл буферного раствора, перемешивают и проводят количественное и качественное определение микроорганизмов. 2.5. Трансдермальные пластыри 2.5.1. Образец для анализа При отборе трансдермальных пластырей используют образец, состоящий из 20 единиц. 2.5.2. С каждого из 10 пластырей снимают защитную пленку, пользуясь стерильными инструментами. При необходимости разрезают пластырь стерильными ножницами на более мелкие фрагменты, которые переносят в колбу емкостью 1000 мл, содержащую 500 мл стерильного буферного раствора и стеклянные бусы диаметром 5-6 мм, нагревают на водяной бане до температуры не выше 40 град. C, энергично встряхивают в течение 30 мин. 50 мл полученного смыва используют для количественного определения микроорганизмов методом мембранной фильтрации, а также для выделения Raeruginosa, S.aureus. Для выделения и количественного определения энтеробактерий используют следующие 10 пластырей, которые вносят в лактозный бульон (среду N 11). Если известно, что пластырь обладает антимикробным действием, в разбавитель добавляют подходящий инактиватор (твин-80 и/или лецитин). Если смыв с трансдермальных пластырей нерастворим и нельзя использовать метод мембранной фильтрации, применяют метод прямого посева на питательные среды. 2.6. Лекарственные растительные средства Особенности пробоподготовки цельного, измельченного сырья, фильтр-пакетов, брикетов представлены в ОФС "Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья или нескольких (сборов) - фасованная продукция, а также растительного сырья "ангро". 3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов Представленные методы предназначены для количественного определения мезофильных бактерий и грибов, которые растут в аэробных условиях. КонсультантПлюс: примечание. Нумерация абзацев дана в соответствии с официальным текстом документа. 3.2. Количественное определение микроорганизмов В зависимости от природы лекарственного средства и его физико-химических свойств используют один из вариантов чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный, поверхностный, модифицированный глубинный), метод мембранной фильтрации или пробирочный метод наиболее вероятных чисел (НВЧ). 3.2.1. Чашечный агаровый метод Для культивирования микроорганизмов используют агаризованные питательные среды: соево-казеиновый агар или среду N 1, сухую, для контроля микробной загрязненности - для выращивания бактерий, агар Сабуро или среду N 2, сухую, для контроля микробной загрязненности - для выращивания грибов. Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, посевы на среде для выращивания бактерий инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C, а на среде для грибов - при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C. Для каждого разведения образца используют не менее 2-х чашек Петри с определенной средой. После расплавления среды охлаждают до температуры (45 +/- 5) град. C и вносят в чашки Петри в необходимом количестве. Глубинный метод Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 15-20 мл агаризованной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют посевы. Двухслойный метод Агаризованные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в пробирку с 4 мл соответствующей расплавленной и охлажденной питательной среды, быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят на поверхность застывшего и подсушенного агара в чашке Петри, равномерно распределяя верхний слой среды вращательными движениями. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации. Поверхностный метод Расплавленные и охлажденные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. Поверхность агара в чашках подсушивают. Образец, приготовленный для анализа, наносят на агар в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды. Чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации. Модифицированный глубинный метод Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 7-10 мл расплавленной и охлажденной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют. Учет результатов производят через 48-72 ч. Учет результатов посевов чашечными методами Посевы просматривают ежедневно. Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительный результат) и через 5 сут. (окончательный результат). Для получения достоверных результатов отбирают чашки, где число колоний бактерий находится в пределах от 30 до 300, а колоний грибов - от 10 до 100. Если при учете результатов двух последующих разведений число колоний на чашках находится в указанных выше пределах, рассчитывают результаты из меньшего разведения. Если в среднем на чашках выросло более 300 колоний бактерий или более 100 колоний грибов, делают ряд дальнейших последовательных разведений образца, выбирая подходящее для посева. Если в среднем на чашках выросло менее 30 колоний бактерий и менее 10 колоний грибов, делают расчет количественного содержания бактерий и грибов по имеющимся результатам. Если на питательной среде отсутствует рост микроорганизмов, результаты отмечают следующим образом: при посеве лекарственного средства в разведении 1:10 - "В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 10 бактерий (или грибов)", при посеве лекарственного средства в разведении 1:100 -"В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 100 бактерий (или грибов)" и т.д. Количество микроорганизмов в 1 г или в 1 мл рассчитывают по формуле: с N = ---- x d, n где: N - количество микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл; c - сумма колоний на всех чашках; n - число чашек; d - коэффициент разведения образца. При подсчете количества микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл образца, полученный результат выражают в виде числа в пределах от 1,0 до 9,9, x умноженного на 10 , где x - соответствующий показатель степени основания 10. -2 Пример. При посеве из разведения 10 на двух чашках выросло 168 и 215 колоний: 168 + 215 2 N = ---------- х 10 = 19150. 2 Полученный результат округляют до двух значащих цифр - 19000 и 4 записывают как 1,9 х 10 . Интерпретация результатов При необходимости подсчета общего количества микроорганизмов (бактерий и грибов суммарно) в 1 г или в 1 мл лекарственного средства следует сложить число аэробных бактерий с числом грибов. 3.2.2. Метод мембранной фильтрации Метод мембранной фильтрации используют для количественного определения микроорганизмов в лекарственных средствах, обладающих или не обладающих антимикробным действием. Метод применим только для растворов и водорастворимых лекарственных средств, а также для жиросодержащих препаратов, растворимых в изопропилмиристате. Для посева используют мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,45 мкм, способные эффективно задерживать микроорганизмы, что подтверждается валидацией. Установка для мембранной фильтрации должна быть такой конструкции, из которой можно извлечь фильтры и перенести их на питательные среды. Материал мембраны следует выбирать таким образом, чтобы компоненты исследуемого препарата не влияли на его эффективность. Фильтры из нитрата целлюлозы используют для водных, масляных и разбавленных спиртовых растворов (менее 30%), из ацетата целлюлозы - для спиртовых растворов (более 30%), кислот, щелочей. Мембранную фильтрацию проводят в асептических условиях с помощью вакуума. Образец, как правило, растворяют в буферном растворе в соотношении 1:10. В воронку фильтровальной установки вносят сначала промывную жидкость (примерно 5 мл) для смачивания фильтра. Добавляют 10 мл препарата в разведении 1:10, соответствующее 1 г образца, и немедленно фильтруют. В случае наличия антимикробного действия лекарственного средства для отмывания мембраны используют жидкости N 1, 2 или 3. Через фильтр пропускают минимум три порции по 100 мл подходящей стерильной промывной жидкости. При необходимости к промывной жидкости могут быть добавлены поверхностно-активные вещества (например, твин-80) или инактиваторы антимикробного действия. Через одну мембрану можно пропустить не более 1000 мл жидкости. Допускается использование для отмывания мембран менее трех порций промывной жидкости при условии валидации метода. Смыв с трансдермальных пластырей пропускают через мембранные фильтры по 50 мл (соответствует 1 пластырю) через каждую мембрану. По окончании процесса фильтрации мембраны переносят на соответствующие питательные среды, разлитые в чашки Петри. Чашки с фильтрами переворачивают и инкубируют в термостате. Учет результатов Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительные результаты) и через 5 сут. (окончательные результаты). Отбирают чашки, где число колоний бактерий на фильтрах не превышает 100, а грибов - 50, и рассчитывают число микроорганизмов на 1,0 г, или на 1,0 мл образца, или на 1 пластырь. Если на фильтре большее количество микроорганизмов, то делают ряд последовательных разведений образца и выбирают подходящее. Для того, чтобы определить, полностью ли отмыты мембраны от фильтруемого препарата, обладающего антимикробным действием, после фильтрации раствора в последнюю порцию промывной жидкости вносят по отдельности по 1 мл взвеси B.subtilis ATCC 6633 и С.albicans ATCC 885-653, содержащей от 10 до 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Рост тест-штаммов на фильтрах подтверждает отсутствие антимикробного действия лекарственного средства. Напротив, отсутствие роста определенного микроорганизма свидетельствует о сохранении антимикробного действия лекарственного средства в отношении данного вида микроорганизмов. В этом случае используют специфические или неспецифические инактиваторы или увеличивают объем промывной жидкости. Жидкости для промывания фильтров Раствор натрия хлорида изотонического 0,9% стерильного pH 7,0. Жидкость N 1: 1 г мясного пептона растворяют в 1000 мл воды, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации - 7,0 +/- 0,2. Жидкость N 2: 1 мл твина-80 добавляют к 1000 мл жидкости N 1, разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации - 6,9 +/- 0,2. Жидкость применяют, если в составе препарата имеется масло. Жидкость N 3: 5 г мясного пептона, 3 г мясного экстракта и 10 г твина-80 растворяют в 1000 мл воды. Разливают во флаконы и стерилизуют. pH после стерилизации - 6,9 +/- 0,2. 3.2.3. Метод наиболее вероятных чисел (НВЧ) Исследуемый образец готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, используя подходящий растворитель. Жидкую питательную среду разливают в 12 стерильных пробирок, по 9 мл в каждую. Пробирки ставят в штатив в 4 ряда по 3 пробирки. |