Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
2. Испытание ИП на гистамин Предварительное испытание После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение стандартного образца в разведении 3, проводят испытание ИП на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин. однократно, в случайном порядке вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП. Циклы "введение-экспозиция-два отмывания" такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе. В случае если пик, полученный в ответ на введение ИП, по высоте не меньше, чем пик стандартного образца в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИП (2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИП, меньше пика стандартного образца в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (2.2). 2.1. Количественное испытание ИП на гистамин В случайном порядке поочередно вводят стандартный образец в разведении 1, разведении 3 и ИП до получения не менее чем четырех пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на стандартный образец от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют, какой концентрации гистамина в разведении ИП соответствует средняя высота его пика и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном ИП (см. подраздел "Статистическая обработка результатов испытания на гистамин" общей фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний"). ИП считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое нормативной документацией (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038). 2.2. Контрольное испытание Схема его проведения такая же, как и при количественном определении содержания гистамина в ИП, за исключением того, что вместо ИП используют стандартный образец в разведении 2. Если средняя высота его пика соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном -6 разведении (2,50 x 10 г/мл), то результаты опыта следует признать достоверными. Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих случаев: 1) Средняя высота пика стандартного образца в разведении 2 не соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном -6 разведении (2,50 x 10 г/мл). 2) При количественном определении содержания гистамина в ИП отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИП. 3) В процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4). В каждом из этих трех случаев следует провести испытание ИП на вещества депрессорного действия (см. "Испытание на депрессорные вещества"). Примечания 1. Состав и приготовление гипокальциевого раствора Тироде Состав: NaCl 80,00 г NaHCO3 10,00 г D-глюкоза 11,00 г KCl 2,00 г CaCl2 x 2H20 1,30 г MgCl2 x 6H20 2,10 г NaH2PO4 x H20 0,58 г Воды дистиллированной до 10 л Приготовление В мерном цилиндре объемом 1 л растворяют в дистиллированной воде навески NaCl, NaHCO3 и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объем раствора водой до 1 л и переливают содержимое цилиндра в 10-литровый стеклянный или полиэтиленовый сосуд с притертой пробкой или завинчивающейся крышкой. Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды дистиллированной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка: 1) KCl 2) CaCl2 x 2H20 3) MgCl2 x 6H20 4) NaH2PO4 x H2O Затем доливают воду дистиллированную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор может храниться при температуре от +3 до +5 град. C не более 24 ч. Помутнение недопустимо. Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать дистиллированной водой. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя. 2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед тем как отрезки использовать в опыте, их следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин. выдерживают при комнатной температуре и в течение 20 мин. в термостате (35 град. C). После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается легкими поглаживающими движениями в продольном направлении. 3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причем направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной. Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты - 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа, писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись. 4. Каждую серию, состоящую не менее чем из четырех пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять на дрейф с помощью теста Нойманна: n - 1 2 n SUM (x - x ) i = 1 1 i + 1 D = -------------------------, n 2 2 n SUM x - (SUM x ) i = 1 i где: x - высота пика на введение одного и того же раствора; n - число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора. Значение D должно быть (p < 0,05): при n = 4 - меньше 0,78; при n = 5 - меньше 0,82; при n = 6 - меньше 0,89. 29. ИСПЫТАНИЕ НА ДЕПРЕССОРНЫЕ ВЕЩЕСТВА (ОФС 42-0064-07) Настоящая статья распространяется на определение веществ депрессорного действия in vivo в лекарственных средствах для парентерального применения. Подготовка животного к опыту В опыт берут здоровых кошек любого пола массой не менее 2 кг. Самки не должны быть беременными или лактирующими. За 24 ч до опыта животное лишают корма, но оставляют свободный доступ к воде. В качестве наркоза используют гексенал в дозе 350-400 мг/кг, который вводят внутримышечно. Можно использовать любой другой наркоз, не оказывающий существенное влияние на величину артериального давления. Животное фиксируют в станке в положении на спине. Препарируют сонную артерию, в которую вставляют канюлю, заполненную раствором, предупреждающим свертывание крови (в качестве антикоагулянта используют 25% раствор магния сульфата или раствор гепарина, содержащий 50 ЕД в 1 мл и др.). Канюлю соединяют при помощи системы трубок, заполненных тем же раствором, с ртутным манометром или электронным датчиком для регистрации кровяного давления. Запись давления производят на ленте кимографа или другого регистрирующего устройства. Испытуемое лекарственное средство <*> вводят через иглу, вставленную в отпрепарированную бедренную вену. -------------------------------- <*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат". Приготовление разведений стандартного образца испытуемого препарата (ИП) В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид. Все разведения следует проводить в пересчете на гистамин-основание (коэффициент пересчета с гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038). Для разведения стандартного образца используют тот же растворитель, что и для ИП: воду для инъекций или 0,9% изотонический раствор натрия хлорида для инъекций, в зависимости от растворителя, указанного в соответствующем частном нормативном документе. Концентрация рабочих разведений стандартного образца в пересчете на гистамин-основание должна составлять 0,5 мкг/мл (разведение 1) и 1,0 мкг/мл (разведение 2). Проведение опыта Введение растворов на протяжении всего опыта проводят со скоростью 0,1 мл в секунду и интервалом между введениями не менее 5 мин. В начале опыта проверяют чувствительность животного к гистамину. Для этого в вену последовательно вводят стандартный образец в разведении 1 и разведении 2 в объеме 0,2 мл на 1 кг массы. Животных, у которых при введении стандартного образца в разведении 2 в дозе 0,2 мкг на 1 кг массы величина артериального давления снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают. После проверки чувствительности животного к гистамину определяют величину гипотензивной реакции введением стандартного образца в разведении 1 в объеме 0,2 мл раствора на 1 кг массы тела. Введение гистамина повторяют, пока при двух последовательных введениях не будет получено одинаковое снижение артериального давления, которое принимают за стандартное в данных условиях опыта. Затем кошке однократно вводят раствор ИП. Тест-доза и растворитель указаны в частном нормативном документе. ИП считают выдержавшим испытание, если снижение артериального давления после введения тест-дозы не превышает реакции на введение стандартного образца в разведении 1. При испытании на одном животном двух и более ИП необходимо периодически проводить определение величины снижения артериального давления в ответ на введение стандартного образца в разведении 1. В случае значительного уменьшения величины реакции артериального давления по сравнению со стандартной величиной, полученной в начале опыта, необходимо вновь проверить чувствительность животного к действию стандартного образца в разведении 2, как описано выше. Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм рт. ст., испытание ИП продолжают в соответствии с указанными выше требованиями. 30. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ (ОФС 42-0065-07) Биологической оценке подлежат: 1. Листья наперстянки пурпуровой, крупноцветковой и их лекарственные препараты. 2. Лекарственные препараты наперстянки шерстистой. 3. Трава, лекарственные препараты горицвета. 4. Трава, листья, цветки ландыша, лекарственные препараты ландыша, сложные лекарственные формы, содержащие настойку ландыша. 5. Семена и лекарственные препараты строфанта. 6. Трава и семя желтушника раскидистого (серого), сложные лекарственные формы, содержащие лекарственные препараты желтушника серого. Принцип метода биологической оценки Биологическая оценка указанных выше лекарственных средств основана на способности сердечных гликозидов вызывать в токсических дозах систолическую остановку сердца животных. Активность сердечных лекарственных средств оценивают по сравнению с активностью стандартных образцов и выражают в единицах действия (ЕД). Испытания проводят на лягушках или кошках. Устанавливают наименьшие дозы стандартного образца и испытуемого лекарственного средства <*>, вызывающие систолическую остановку сердца подопытных животных. Затем рассчитывают содержание единиц действия в 1 г испытуемого препарата (ИП), если испытываются лекарственное растительное сырье или сухие концентраты; в одной таблетке - при испытании таблеток или в 1 мл, если испытываются жидкие лекарственные формы. -------------------------------- <*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат". Стандартные образцы и понятие единицы действия Стандартным образцом при испытании травы, листьев, цветков ландыша, лекарственных препаратов ландыша, сложных лекарственных форм, содержащих настойку ландыша, служат специально изготовленные спиртовые экстракты ландыша, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ. Стандартными образцами при испытании листьев и лекарственных препаратов наперстянки пурпуровой и крупноцветковой, травы, цветков, листьев и лекарственных препаратов служат специально изготовленные спиртовые экстракты наперстянки названных видов, содержащие сумму гликозидов и очищенные от сопутствующих веществ. Стандартными образцами при испытании других лекарственных растений и полученных из них лекарственных препаратов служат индивидуальные кристаллические гликозиды: при испытании лекарственных препаратов наперстянки шерстистой - целанид-стандарт; при испытании травы, лекарственных препаратов горицвета - цимарин-стандарт; при испытании семян и лекарственных препаратов строфанта - строфантин G-стандарт; при испытании травы и семян желтушника серого - эризимин-стандарт. Биологическую активность стандартных образцов устанавливают на лягушках-самцах (Rana temporaria) массой 28-33 г при подкожном введении в октябре-ноябре (таких лягушек условно называют "стандартными" или "нормальными"), а также на кошках в определенных условиях опыта. При испытании на лягушках, разведения стандартных образцов подбирают с таким расчетом, чтобы одна лягушачья единица действия (1 ЛЕД) соответствовала дозе стандартного образца, вызывающей в определенных условиях опыта систолическую остановку сердца у большинства стандартных подопытных лягушек. Под 1 ЛЕД ландыша или наперстянки подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртового образца, разведенного в 4 раза водой. Неразведенные стандартные образцы наперстянки и ландыша содержат в 1 мл 13,33 ЛЕД. Под 1 ЛЕД цимарина, целанида подразумевают специфическую биологическую активность 0,3 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации: цимарина 1:13333 целанида 1:5000 Под 1 ЛЕД строфантина G, эризимина подразумевают специфическую биологическую активность 0,4 мл стандартного спиртоводного раствора кристаллического гликозида в следующей концентрации: строфантина G 1:20000 эризимина 1:25000 При испытании сердечных лекарственных средств на кошках активность ИП выражают в кошачьих единицах действия. Под одной кошачьей единицей действия (1 КЕД) подразумевают дозу стандартного образца или ИП из расчета на 1 кг массы животного, вызывающую систолическую остановку сердца кошки и устанавливаемую в определенных условиях опыта. Эта доза является смертельной. Разведения стандартного образца или ИП подбирают с таким расчетом, чтобы 1 КЕД содержалась примерно в 15 мл раствора. 1. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА ЛЯГУШКАХ Отбор лягушек и их содержание Для опытов пригодны лягушки-самцы видов: травяная (Rana temporaria) массой 28-40 г; водяная - озерная (Rana ridibunda) и прудовая (Rana esculenta) массой 30-70 г. Лягушек содержат в течение зимы в бассейне с проточной водой, в полутемном помещении при температуре от 3 до 8 град. C. Сохраняемые зимой в бассейне лягушки могут быть сразу использованы для опыта. Весной и летом свежепойманные лягушки должны быть выдержаны до начала опыта в бассейне с проточной водой в течение 2-3 сут. Температура воды в бассейне в теплое время года не должна превышать 15 град. C. Помещение лаборатории, где проводят биологические испытания, должно быть светлым, но защищенным от попадания прямых солнечных лучей, температура воздуха в нем - 15-22 град. C. В лаборатории должна быть раковина для содержания подопытных лягушек, в которую их помещают за 1-1,5 ч до проведения опыта. Техника испытания и принцип расчета Отбирают партию лягушек одного вида, возможно близких друг к другу по массе. Взвешивание животных проводят непосредственно перед опытом с точностью до 0,5 г с отклонениями от средней массы в группе не более чем на +/- 2,5 г: 28-33, 30-35, 35-40 и до 65-70 г. Лягушек по 5 штук укрепляют на досках брюшком кверху с предельно вытянутыми конечностями, булавки вкалывают в верхнюю часть морды и в суставы передних и задних конечностей. Пинцетом захватывают кожу на груди и вырезают в ней треугольное отверстие. Вырезанный лоскут кожи откидывают в сторону. При этом становится отчетливо видимой грудина, просвечивающая через мышцы в виде белой пластины, напоминающей по форме песочные часы. Приподняв пинцетом грудину в узкой части, тонкими ножницами перерезают ее поперек выше и ниже места наложения пинцета, так что образуется узкое поперечное оконце, через которое видны дуги аорты и предсердия. Тонким (глазным) пинцетом проникают в разрез (осторожно, чтобы не поранить предсердия и крупные сосуды), слегка вытягивают сердечную сорочку и рассекают ее ножницами. Затем легкими надавливаниями на брюшко лягушки выводят сердце наружу. При препарировании следят за тем, чтобы через образованное отверстие не выступали наружу печень и легкие и чтобы сердце свободно помещалось на лишенном кожи участке, не прикасаясь к наружной поверхности кожи. В течение опыта обнаженное сердце каждые 15-20 мин. смачивают 0,6% раствором натрия хлорида (наносят пипеткой 2-3 капли на обнаженное сердце). Испытания на травяных лягушках следует проводить, вводя растворы в лимфатические бедренные мешки (под кожу) или в сердце (в полость желудочка); на водяных - в сердце (в полость желудочка) или в вену; под кожу - только растворы, содержащие гликозиды ландыша. Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят одинаковые дозы испытуемого раствора. Испытуемые препараты предварительно разводят водой с таким расчетом, чтобы 0,3 или 0,4 мл испытуемого раствора содержали 1 ЛЕД. Для этого среднее количество единиц действия лекарственного средства умножают на количество миллилитров, соответствующее 1 ЛЕД. Например, если в 1 мл препарата "Коргликон раствор 0,06% для инъекций" содержится в среднем 13,3 ЛЕД (13,3 x 0,3 = 3,99), то препарат следует развести 1:4. 1. Метод испытания при введении под кожу. Растворы вводят шприцем с тонкой иглой в бедренные лимфатические мешки лягушек. Дозы, не превышающие 0,35 мл, вводят в одну конечность, большие дозы (но не более 0,7 мл) вводят равными частями в обе конечности. |