Фармакопея 12 - 1 часть. Научный центр экспертизы средств медицинского применения
 Скачать 3.93 Mb.
|
|
Растворы B - серия разведений КСЭ в растворе испытуемого лекарственного средства (выявление возможности ингибирования или усиления реакции). Растворы C - серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива). Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Таблица 27.2 Схема эксперимента "Мешающие факторы"
Опыт проводят, как описано в разделе Процедура анализа. Результаты и интерпретация. Результаты эксперимента считаются достоверными, если: - для раствора D получены отрицательные результаты во всех повторностях; - для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда; - для раствора A получены отрицательные результаты во всех повторностях. По результатам, полученным для каждой из повторностей растворов B, рассчитывают среднее геометрическое значение чувствительности ЛАЛ-реактива. Расчет проводят, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. Если полученное среднее значение оказалось не менее 0,5 лямбда и не более 2 лямбда, испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении не содержит мешающих факторов, способных ингибировать и/или усиливать реакцию ЛАЛ-реактива с бактериальными эндотоксинами, и может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов. Если присутствие мешающих факторов обнаружено для испытуемого лекарственного средства, которое проверялось в разведении, меньшем МДР, анализ повторяют в большем разведении, вплоть до разведения, равного МДР. В большинстве случаев дополнительное разведение испытуемого лекарственного средства способно снять действие мешающих факторов. Использование ЛАЛ-реактива большей чувствительности позволяет увеличить степень разведения. Действие мешающих факторов может быть преодолено соответствующей обработкой, например, фильтрацией, нейтрализацией, диализом или температурной обработкой. Выбранный способ удаления мешающих факторов не должен изменять концентрацию бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, поэтому КСЭ к раствору испытуемого лекарственного средства добавляют перед проведением такой обработки, после чего проводят анализ Мешающие факторы. Если после обработки выбранным способом результаты анализа Мешающие факторы окажутся удовлетворительными, то испытуемое лекарственное средство может быть подвергнуто анализу на содержание бактериальных эндотоксинов. Если испытуемое лекарственное средство нельзя освободить от мешающих факторов, оно не может быть исследовано на предмет содержания бактериальных эндотоксинов с помощью ЛАЛ-теста. КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД А) Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье. Анализ проводят с лекарственным средством в одном разведении, в котором был проведен анализ Мешающие факторы, или в большем разведении, но не превышающем значения МДР. Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.3. Раствор A - испытуемое лекарственное средство в разведении, в котором отсутствуют мешающие факторы, или в большем разведении, не превышающем МДР. Раствор B - испытуемое лекарственное средство в выбранном разведении, к которому добавлен КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства). Раствор C - раствор КСЭ в воде для ЛАЛ-теста с конечной концентрацией 2 лямбда (положительный контроль). Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа. Таблица 27.3 Схема эксперимента "Качественный анализ"
Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если: - для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях; - для раствора C (положительный контроль) во всех повторностях получены положительные результаты; - для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) в обеих повторностях получены положительные результаты. Если для раствора A в обеих повторностях получены отрицательные результаты, лекарственное средство считают выдержавшим испытания. Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, меньшем МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, анализ следует повторить в разведении, равном МДР. - Если для испытуемого лекарственного средства в разведении, равном МДР, в обеих повторностях получены положительные результаты, то лекарственное средство не соответствует требованиям раздела "Бактериальные эндотоксины" частной фармакопейной статьи. Если положительный результат получен в одной из повторностей для раствора A, то проводят повторный анализ. Лекарственное средство считается выдержавшим испытания, если в повторном анализе для обеих повторностей получены отрицательные результаты. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (МЕТОД B) Задачей этого анализа является определение содержания бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве. Для этого используется серия последовательных разведений испытуемого лекарственного средства, начиная с того разведения, для которого был проведен анализ Мешающие факторы, или большего, но не превышающего МДР. Процедура. Для проведения анализа готовят растворы A-D по схеме, приведенной в табл. 27.4. Растворы A - разведение испытуемого лекарственного средства, начиная с разведения, в котором отсутствуют мешающие факторы, до наибольшего разведения, не превышающего МДР. Раствор B - испытуемое лекарственное средство в наименьшем из проверяемых в тесте разведений, к которому добавлен раствор КСЭ. Конечная концентрация эндотоксина в анализируемом растворе должна составлять 2 лямбда (положительный контроль испытуемого лекарственного средства). Растворы C - серия разведений КСЭ в воде для ЛАЛ-теста (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива). Раствор D - вода для ЛАЛ-теста (отрицательный контроль). Анализ проводят, как описано в разделе Процедура анализа. Таблица 27.4 Схема эксперимента "Количественный анализ"
Результаты и интерпретация. Анализ считают достоверным, если: - для раствора D (отрицательный контроль) получены отрицательные результаты в обеих повторностях; - для растворов C (контроль чувствительности ЛАЛ-реактива) среднее геометрическое значение концентрации бактериальных эндотоксинов составляет не менее 0,5 лямбда, и не более 2 лямбда; - для раствора B (положительный контроль испытуемого образца) получены положительные результаты в обеих повторностях; - для растворов A конечной точкой реакции является положительный результат, полученный для наибольшего разведения испытуемого лекарственного средства. Значение произведения фактора этого разведения на величину чувствительности ЛАЛ-реактива (лямбда) равно концентрации эндотоксина в растворе A, полученной для данной повторности. Среднее геометрическое значение концентрации эндотоксина рассчитывают, как описано в разделе Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива. Если во всех повторностях серии растворов A получены отрицательные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве менее чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наименьший фактор разведения. Если во всех повторностях серии растворов A получены положительные результаты, то концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве более чувствительности ЛАЛ-реактива, умноженной на наибольший фактор разведения. Лекарственное средство считают выдержавшим испытания, если определенное в эксперименте среднее значение содержания бактериальных эндотоксинов менее значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в частной фармакопейной статье. 28. ИСПЫТАНИЕ НА ГИСТАМИН (ОФС 42-0063-07) Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения. Подготовка изолированного органа В опыт берут морскую свинку-самца с массой тела 200-350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют воду. После эвтаназии свинку обескровливают путем декапитации. Вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место ее перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1-2 см до этого места. Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают ее основание и отрезают ножницами. Отсеченный конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая ее, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая ее. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10-15 см, ближайшие к слепой кишке. Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Им осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от +2 до +4 град. C (примечание 2). Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механического рычага и кимографа). Приготовление разведений стандартного образца и испытуемого лекарственного средства <*> -------------------------------- <*> В дальнейшем, для удобства, испытуемое лекарственное средство будет называться "испытуемый препарат". 1. Разведения стандартного образца В качестве стандартного образца используют гистамина дигидрохлорид в -6 трех разведениях: разведение 1 (1,25 x 10 г/мл); разведение 2 (2,50 x -6 -6 10 г/мл) разведение 3 (5,00 x 10 г/мл), вызывающие 50, 75 и 100% сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида. 2. Разведение испытуемого препарата (ИП) Испытанию подвергают неразведенный ИП, когда максимально допустимая нормативной документацией концентрация гистамина в неразведенном -6 лекарственном средстве находится в диапазоне от 1,25 x 10 г/мл до 2,50 x -6 10 г/мл. При необходимости ИП разводят 0,9% раствор натрия хлорида таким образом, чтобы предполагаемая концентрация гистамина дигидрохлорида в -6 разведении ИП составляла 2,50 x 10 г/мл. Регистрирующая система Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение стандартного образца и ИП используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде (35 град. C), а также электронного датчика с самописцем или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% O2 и 5% CO2) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500-800 мг. В случае использования механического рычага, для ее вычисления следует применять правило равновесия: Сила x Плечо силы = Нагрузка x Плечо нагрузки. Проведение опыта Изолированный отрезок подвздошный кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один - к крючку на дне ванночки, а другой - к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее трех раз сменить в ванночке раствор Тироде. 1. Адаптация изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки к субмаксимальной дозе гистамина В термостатируемую ванночку вводят стандартный образец в разведении 3 в объеме, равном 1/100 от ее емкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объемом раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объемом раствора. Не менее чем через 4 мин. после первого введения снова повторяют цикл "введение-экспозиция-два отмывания". Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее двух одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными. |