ВРТ1. Название Стр
 Скачать 1.93 Mb.
|
|
Хирургические методы получения сперматозоидов. Сперматозоиды для экстракорпорального оплодотворения могут быть получены хирургическим путем: при необструктивной азооспермии (НОА), обусловленной тестикулярной недостаточностью, при обструктивной азооспермии (ОА), при расстройствах эякуляции: аспермии, ретроградной эякуляции и др., 54 при 100% некрозооспермии в эякуляте. Выбор оптимального способа получения сперматозоидов осуществляется врачом- урологом. Применяют чрескожные аспирационные биопсии придатков яичек и яичек (ПЕСА, ТЕСА), открытые биопсии яичек (ТЕСЕ), открытые биопсии придатков яичек с микрохирургическим контролем (МЕСА), открытые биопсии яичек с микрохирургическим контролем (микро-ТЕСЕ), аспирации сперматозоидов из семявыносящего протока. Мужчинам, которым для применения ВРТ может потребоваться получение сперматозоидов хирургическим путем, необходима консультация генетика, даже при нормальных результатах генетического тестирования (1). Уровень убедительности рекомендаций А (уровень достоверности доказательств –1b). Операции по получению сперматозоидов рекомендуется проводить только тогда, когда возможна криоконсервация полученного материала (1). Уровень убедительности рекомендаций А (уровень достоверности доказательств –1b). Перед проведением криоконсервации необходимо принять меры предосторожности для предотвращения передачи вирусов, возбудителей инфекций, передаваемых половым путем и любых других инфекций от донора к реципиенту, а также инфицирования других криоконсервированных образцов. Для этого требуется проведение соответствующего обследования пациентов и возможность при необходимости обеспечить хранение образцов в карантине. Нельзя хранить образцы криоконсервированного материала пациентов, у которых были выявлены ВИЧ и вирусы гепатита в одних контейнерах с другими образцами, полученными у неинфицированных пациентов (1). Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: o При НОА сперматогенез может быть сохранен фокально, при исследовании полученного при биопсии материала сперматозоиды могут быть обнаружены и использованы для ИКСИ примерно в 50% случаев. Вероятность обнаружения сперматозоидов, пригодных для ИКСИ, зависит от гистопатологического диагноза (130). o Пороговых значений уровней ФСГ и ингибина В, а также объема яичек, указывающих на успешное получение сперматозоидов хирургическим путем у мужчин с НОА, установить не удалось. При мультифокальной ТЕСЕ сперматозоиды получают чаще, чем при традиционной ТЕСЕ с забором одного фрагмента яичка, поэтому при НОА она является методом 55 выбора (131). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Микро-ТЕСЕ рекомендуется применять при тяжелых случаях НОА, так как она обеспечивает наибольшую вероятность обнаружения сперматозоидов (131). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Мужчинам с НОА проведение ТЕСЕ и микро-ТЕСЕ рекомендуется также для диагностики внутрипротоковой герминогенной неоплазии неклассифицированного типа (1). Уровень убедительности рекомендаций А(уровень достоверности доказательств– 1b). При полных микроделециях локусов AZFa и AZFb Y-хромосомы вероятность того, что при биопсии яичка будут обнаружены сперматозоиды, минимальная (132). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств –4). Комментарии: При использовании сперматозоидов мужчин с НОА для ИКСИ вероятность оплодотворения яйцеклетки, частота наступления беременности и рождения ребенка оказались ниже по сравнению с аналогичными показателями применения в ВРТ сперматозоидов эякулята или сперматозоидов, полученных хирургическим путем у мужчин с ОА (133,134). Согласно результатам проведенных исследований, лишь у одного из семи мужчин с НОА после ТЕСЕ и ИКСИ удается получить генетическое потомство (135). Выполнение ТЕСЕ и микро-ТЕСЕ при синдроме Клайнфельтера в молодом возрасте повышает вероятность обнаружения сперматозоидов (136), однако, проведение этих вмешательств у мальчиков в период полового созревания и ранее следует рассматривать как экспериментальное лечение, в настоящее время допустимое только в рамках клинических протоколов (137). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств –4). 56 2.0 Лабораторный этап 2.1 Оплодотворение ооцитов 2.1.1 Инсеминация ооцитов in vitro – экстракорпоральное оплодотворение (метод ЭКО) Инсеминация ооцитов - метод экстракорпорального оплодотворения, заключающийся в совместном культивировании ооцитов и сперматозоидов, прошедших капацитацию in vitro. Показатели эякулята для проведения классического ЭКО. Рекомендуется использовать классический метод ЭКО при нормозооспермии и умеренной патозооспермии. Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Общепризнанные критерии, по которым эякулят можно считать пригодным для классического ЭКО, на данный момент отсутствуют. Одни специалисты ориентируются на количество подвижных сперматозоидов в нативном эякуляте (более 1×10 6 (138)), другие – на количество подвижных сперматозоидов в обработанной сперме (более 0,2×10 6 (139) или 0,5×10 6 (140)), третьи – на концентрацию и морфологию сперматозоидов в нативном образце (более 0,5×10 6 морфологически нормальных, прогрессивно-подвижных сперматозоидов в миллилитре (141)). Подготовка сперматозоидов для инсеминации. Для обработки спермы рекомендуется использовать такие методы, как центрифугирование в градиенте плотности и swim-up («всплытие») (142). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Существуют альтернативные методы обработки спермы (миграция- седиментация, фильтрация через стекловолокно, магнитная сепарация, микрожидкостные камеры и др.), однако практически все они имеют существенные ограничения либо находятся на стадии апробации (143). Процедура оплодотворения ооцитов. Рекомендуется выбирать время инсеминации с учетом момента введения триггера овуляции и/или пункции фолликулов (2-5 часов после пункции) (144). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Для процедуры инсеминации рекомендуется использовать капли со взвесью обработанных сперматозоидов с концентрацией подвижных форм в интервале от 0,1 до 0,5×10 6 /мл. На одну яйцеклетку должно приходиться от 10 тысяч до 50 тысяч 57 сперматозоидов (144). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Рекомендуется проводить совместное культивирование ооцитов и сперматозоидов в течение 3 часов («короткая инкубация»), хотя допускается традиционный вариант длительной инкубации (16-20 часов) (144). Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – 1a). Комментарии: Согласно систематическому обзору 2013 года, «короткая инкубация» имеет преимущества перед традиционной: увеличение частоты наступления клинической и продолжающейся беременности (145). Оценка оплодотворения. Рекомендуется проводить оценку оплодотворения (подсчёт пронуклеусов в каждой зиготе) через 16-20 часов после инсеминации (144). Уровень убедительности рекомендаций A (уровень достоверности доказательств – 1a). Комментарии: Перенос эмбрионов, развивающихся из зигот с тремя и более пронуклеусами, строго запрещен. Перенос эмбрионов, развивающихся из зигот 1PN или 0PN, не рекомендован. 2.1.2 Инъекция сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (метод ИКСИ) ИКСИ – инъекция сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки является вариантом экстракорпорального оплодотворения, которое достигается путем введения одного сперматозоида в ооцит с помощью специальных микроинструментов. Сперматозоид отбирается эмбриологом из множества других в обработанной сперме на основании нескольких параметров: степень подвижности и морфология, однако могут использоваться и другие характеристики (поверхностный электрический заряд мембраны, способность связываться с гиалуроновой кислотой, экспрессия маркеров апоптоза, оценка морфологии под большим увеличением). Показания к проведению ИКСИ. ИКСИ является инвазивной, технически сложной и дорогостоящей манипуляцией по сравнению с классическим ЭКО. К признанным большинством специалистов показаний можно отнести: мужской фактор бесплодия, использование размороженных ооцитов, проведение ПГТ. Метод ИКСИ рекомендован при мужском факторе бесплодия, который проявляется в значительном снижении параметров эякулята: концентрации, подвижности и 58 морфологии сперматозоидов. Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Общепризнанные характеристики эякулята, при которых показано ИКСИ, отсутствуют. Одни специалисты ориентируются на количество подвижных сперматозоидов в нативном эякуляте (менее 1×10 6) (138)), другие – на количество подвижных сперматозоидов в обработанной сперме (менее 0,2×10 6 (139) или 0,5×10 6 (140)), третьи – на концентрацию и морфологию сперматозоидов в нативном образце (менее 0,5×10 6 морфологически нормальных, прогрессивно-подвижных сперматозоидов на миллилитр (141)). Метод ИКСИ рекомендован при использовании сперматозоидов, полученных хирургическим путем. Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: В большей части случаев материал, полученный оперативным путем, характеризуются низким качеством сперматозоидов (концентрация, степень подвижности и зрелости, количество морфологически нормальных форм). Метод ИКСИ рекомендован при использовании ооцитов после криоконсервации. Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4) Комментарии: Считается, что удаление кумулюса перед криоконсервацией, и сама криоконсервация ведут к изменениям в блестящей оболочке, что может снизить вероятность оплодотворения при классическом ЭКО. Результаты научных исследований по данной теме немногочисленны и противоречивы (146,147). Метод ИКСИ рекомендован при проведении преимплантационного генетического тестирования методом ПЦР (148). Уровень убедительности рекомендаций С (уровень достоверности доказательств - 4). Комментарии:Технология ИКСИ предполагает полное удаление кумулюса с поверхности ооцита и введение единичного сперматозоида. Это снижает возможный риск контаминации образца для генетического тестирования ДНК кумулюсных клеток и сперматозоидов, прикрепленных к внешней поверхности блестящей оболочки. Ниже перечислены показания, в отношении которых нет консенсуса или имеются сведения об их необоснованности: Метод ИКСИ рекомендован при проведении преимплантационного генетического тестирования, включающего этап полногеномной амплификации (a-CGH, NGS). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). 59 Комментарии: ИКСИ снижает возможный риск контаминации образца для генетического тестирования ДНК кумулюсных клеток и сперматозоидов, прикрепленных к внешней поверхности блестящей оболочки. При этом РКИ по данной теме в настоящее время отсутствуют, потенциальные риски контаминации оправдывают использование ИКСИ при ПГТ (149,150). Метод ИКСИ рекомендован при неудаче оплодотворения в предыдущей попытке со стандартным ЭКО (151–153). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: К неудаче оплодотворения относят частоту оплодотворения от 0 до 20%. Консенсус по данному показанию отсутствует. Результаты научных исследований по целесообразности использования ИКСИ противоречивы. Практический комитет ASRM полагает, что использование ИКСИ при неудачной первой попытке ЭКО может снизить риск неудач в повторных попытках (151). Одно проспективное исследование показало преимущество ИКСИ перед стандартным ЭКО в отношении частоты оплодотворения (48% против 11%). Однако исследуемая группа была небольшой – 38 пар, а данные по частоте наступления беременности не приводятся (152). По данным ретроспективного исследования, у 87% пар с неудачами оплодотворения методом ЭКО в первой попытке достигается оплодотворение в последующих попытках с ЭКО. А ЧНБ при этом сравнима с таковой для ИКСИ. Поэтому авторы полагают, что нужно предпринимать повторные попытки с классическим методом оплодотворения – менее инвазивным и дорогостоящим (153). Метод ИКСИ не рекомендован при бесплодии неясного генеза, если другие показания для ИКСИ отсутствуют (154). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Результаты исследований противоречивы, выборки невелики. Одна часть работ демонстрирует преимущество ИКСИ в отношении частоты оплодотворения и случаев полного отсутствия оплодотворения, другая – не выявила различий в отношении частоты оплодотворения, качества эмбрионов, частоты имплантации и клинической беременности (154). Метод ИКСИ не рекомендован при малом числе полученных ооцитов (менее 4-6), если другие показания для ИКСИ отсутствуют (155,156). Уровень убедительности рекомендаций B (уровень достоверности доказательств – 3). 60 Комментарии: Не выявлено преимуществ ИКСИ перед классическим ЭКО у пациенток с малым количеством полученных ооцитов в отношении частоты оплодотворения, качества эмбрионов, ЧНБ и выкидышей (155,156). Метод ИКСИ не рекомендован при низком качестве ооцитов, если другие показания для ИКСИ отсутствуют. Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Предполагается, что ИКСИ может являться более подходящим методом оплодотворения ооцитов низкого качества (согласно визуальной оценке морфологии яйцеклетки и кумулюса) (151). Однако нет опубликованных исследований, подтверждающих преимущество ИКСИ перед традиционным ЭКО. Метод ИКСИ не рекомендован при позднем репродуктивном возрасте женщины (старше 35 лет), если другие показания для ИКСИ отсутствуют (157). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: Нет исследований, в которых оценивалось преимущество ИКСИ в отношении качества эмбрионов и частоты имплантации для старшей возрастной группы. Частота оплодотворения ооцитов женщин старше 35 лет сравнима с таковой для более молодых пациенток (157). Метод ИКСИ может быть рекомендован в программах с созреванием ооцитов in vitro (158,159). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: манипуляции с ооцитами при проведении IVM могут вести к изменениям в zona pellucida, что, в свою очередь, снижает вероятность оплодотворения с применением традиционного метода ЭКО. Исследования демонстрируют более высокую частоту оплодотворения ооцитов, созревших in vitro, при использовании ИКСИ по сравнению с классическим методом инсеминации (158,159). Однако частота имплантации эмбрионов ниже в группе ИКСИ, а различия по ЧНБ между группами статистически не значимы (160). Подготовка ооцитов перед ИКСИ: При подготовке к ИКСИ рекомендуется проводить денудацию ооцитов ближе к моменту оплодотворения (144). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Комментарии: На данный момент нет доказательств в пользу того, что денудация ооцитов должна быть осуществлена в определенное время после пункции; однако, так как денудированные ооциты более чувствительны к изменениям уровня pH, рекомендуется проводить денудацию ближе к процедуре ИКСИ (144). 61 ИКСИ рекомендуется проводить только ооцитам на стадии МII (метафаза II). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). Данную манипуляцию рекомендуется проводить в условиях, близких к оптимальным: температура 37⁰С, время нахождения ооцитов вне инкубатора минимально (не более 10 мин). Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). При проведении ИКСИ рекомендуется выбирать морфологически нормальный, подвижный сперматозоид. Уровень убедительности рекомендаций C (уровень достоверности доказательств – 4). 2.1.3 Метод ИМСИ ИМСИ – инъекция морфологически нормального сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (intracytoplasmic morphologically selected sperm injection). Метод заключается в отборе сперматозоида для ИКСИ при большом увеличении (6000× и более). На данный момент метод ИМСИ не рекомендован для клинического применения (161). |