Краткий курс микробиологии. Общая микробиология
 Скачать 379 Kb.
|
|
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. Морских свинок заражают подкожно суспензией материала. Животные погибают при картине экспериментальной газовой гангрены (местный отек с газообразованием, расплавление подкожно-жировой клетчатки). Посевом органов можно выделить культуру. Экспресс-метод: а) данные микроскопии препаратов; б) реакция иммунофлуоресценции; в) учет роста на средах с посевом нативного материала через 3-6 часов (для определения Cl. perfringens); г) определение антигена в материале методом встречного иммуноэлектрофореза. Бактерии рода Clostridium (главным образом Cl. perfringens типа А) могут вызывать клостридиальные гастроэнтериты и некротические энтериты. Микробиологический диагноз устанавливают изоляцией культуры клостридий из испражнений, рвотных масс, остатков пищевых продуктов по такой же схеме, что и при анаэробной газовой инфекции с учетом массивности содержания бактерий в материале. В фильтрате материала определяют (пробой нейтрализации) экзотоксин при септической форме, возбудитель выделяют из крови. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БОТУЛИЗМА Возбудитель ботулизма - Cl. botulinum - крупная палочка с субтерминальной овальной спорой («теннисная ракетка»), грам+, подвижная, без капсулы, обладает выраженными протеолитическими свойствами. Основную роль играют серовары А, В, Е. Материалом для исследования служат кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, моча, испражнения, подозрительные на заражение пищевые продукты. Микробиологическая диагностика проводится аналогично для других клостридиозов. Наиболее информативный метод диагностики - реакция нейтрализации на белых мышах с использованием противоботулинических сывороток. Эту реакцию ставят непосредственно с исследуемым материалом, либо с выделенной культурой. Животные, не защищенные сыворотками, погибают при явлениях общей слабости, отдышки, порезов и параличей конечностей, западение мышц живота («осиная талия»). ДИАГНОСТИКА СТОЛБНЯКА Возбудитель столбняка - Cl. tetani - крупная тонкая палочка с круглой спорой на конце (барабанная палочка), грам+, подвижная, без капсулы. Обладает слабыми протеолитическими свойствами. Диагностика проводится по той же схеме, что и газовая гангрена. Наибольшее значение имеет биопроба на мышах и опыт нейтрализации. Картина экспериментального столбняка: хвост мыши становится ригидным, задняя конечность вытягивается, туловище искривляется (восходящий столбняк), животное погибает. Для ускоренного выделения палочек столбняка используют засев материала (или смешанной культуры со среды Китта-Тароцци) конденсационную воду скошенной свернутой сыворотки(метод Филдса). Благодаря активной подвижности клостридий столбняка за 24 часа вырастают на верхней части косяка. Культура исследуется микроскопически и ею заражают белых мышей. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХОЛЕРЫ Обследованию подлежат не только больные, но обязательно все люди в очаге для выявления скрытых форм и бактерионосителей. Забор материала проводится в условиях, обеспечивающих полную безопасность персонала и внешней среды, обязательно медицинским работником. Материал от больного берется индивидуально, от подозреваемых лиц - можно объединять по несколько проб. Материал для исследования: испражнения, кусочки кишечника от трупов, пищевые продукты, вода, объекты внешней среды. Пересылка материала осуществляется медицинским работником в течение не более 3,5 часов в системе стекло - впитывающий материал - металл с приложением сопроводительного письма (в нем указаны паспортные данные, предполагаемый диагноз, время взятия материала) и пометкой «бактериологическое загрязнение». Используют два метода: главный - бактериологический, дополнительный - серологический. Бактериологическое исследование проводят в специальных лабораториях с соблюдением строгого противоэпидемического режима. Методы диагностики подразделяются на классические и ускоренные. Классическое исследование проводится поэтапно, через каждые 6 часов. 1 этап. а) посев материала для обогащения на 1% пептонную воду; б) микроскопия материала (окраска по Граму и фуксином); в) посев материала на щелочной агар и среду TCBS (тиосульфатцитрат-бром-тимоловый синий, сахароза). Посевы помещают в термостат. 2 этап (через 6 часов). а) вырастает пленка на пептонной воде, делают пересев на вторую пептонную воду для дальнейшего обогащения; б) пересев из первой пептонной воды на щелочной агар и среду TCBS. 3 этап (через 12 часов исследования). а) исследование роста на второй пептонной воде (аналогично первой); б) изучение чашек первичного посева: - описание колоний (жел-тые на TCBS, прозрачные голубоватые на щелочном агаре; - микроскопия; - определение подвижности; - постановка РА на стекле с 0-1, Инаба и Огава сыворотками; просмотр колоний в стереоскопическом микроскопе (голубоватый цвет); - пересев на двухсахарную лактозо-сахарозную среду. На этом этапе может быть дан предварительный ответ. 4 этап (через 18 часов исследования). Изучение выросшей культуры: а) учет изменения лактозо-сахарозной среды (разложение сахарозы в столбике без газа); б) мазок по Граму; в) идентификация по ряду признаков. 1. Для постановки окончательного диагноза и отличия выделенных вибрионов от нехолерных:
2. Для определения серовара: РА с сыворотками Огава и Инаба (в пробирках). 3. Для определения биовара холерного вибриона:
Все три последних положительны для вибриона Эль-Тор. Длительность исследования - 36-48 часов в зависимости от скорости обогащения. Ускоренный метод диагностики подразделяется на: ускоренный метод индикации микроба, антигена и ускоренную идентификацию. А. Ускоренная индикация - поиск микроба непосредственно в материале или после подращивания в пептонной воде следующими методами: а) микроскопия (по Граму и фуксином); б) прямая РИФ; в) р. иммобилизации под действием сыворотки 0-1; г) р. агглютинации растущих культур (материал засевается в 2 пробирки с пептонной водой, в одну из них добавляют диагностическую сыворотку, отмечается рост и одновременно склеивание микробов в пробирке с сывороткой); д) проба с бактериофагами. Б. Поиск антигена в материале серологическими методами: а) р. энзим-меченных антител; б) РПГА с антительным диагностикумом; в) РТПГА. В. Ускоренная идентификация осуществляется на 3-ем этапе бактериологического исследования путем изучения свойств выросших колоний (мазок по Граму, р. агглютинации с сывороткой 0-1, посев в малые объемы трех углеводов по Хейбергу, проба с бактериофагом. Серологический метод диагностики. Чаще носит ретроспективный характер, помогает в неясных случаях и для выявления переболевших и вибриононосителей. Используют РА и определение вибриоцидных антител. Рекомендуют использовать парные сыворотки. Положительный ответ дают при наличии высокого титра (в РА - 1:180-1:3200) или при нарастании его в парных сыворотках. КАМПИЛОБАКТЕРИИ. КАМПИЛОБАКТЕРИОЗЫ. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ. Кампилобактерии - род Campylobacter семейства Spirillaceae - это тонкие изогнутые грам- палочки, образующие один или несколько завитков, могут быть S-образными или похожими на «крылья чайки». Толщина клеток - 0,2-0,5 мкм, длина - 0,5-8 мкм. Спор и капсул не образуют, подвижны, имеют полярно расположенный жгутик на одном конце или по жгутику на обоих концах клетки. Для них характерны быстрые винтообразные движения. Хемоорганотрофы, микроаэрофилы (растут при пониженном парциальном давлении кислорода). Род включает более 10 видов. Некоторые виды патогенны для человека, вызывают кишечный кампилобактериоз. Патогенные виды отличаются от непатогенных продукцией каталазы. Каталаза-отрицательные кампилобактерии входят в состав нормальной микрофлоры полости рта и кишечника человека и различных животных. Наибольшее значение в развитии заболеваний у людей имеет C. jejuni (95%), реже - C. coli, еще реже - C. fetus и C. laridis. Заболеваемость кампилобактериозом носит спорадический характер, возникает при употреблении в пищу инфицированного мяса птицы, телят, свиней, могут быть вспышки молочного или водного характера. Болеют дети и взрослые, в наибольшей степени заболеванию подвержены дети в возрасте до 4 лет ( в 90% случаев). Кампилобактерии поражают тонкий кишечник. Они прикрепляются к поверхности энтероцитов, оказывают цитотоксическое действие (выделяют энтеротоксин); обладают высокой инвазивностью, что приводит к бактериемии (у ослабленных лиц может быть сепсис). Клинически заболевание проявляется острым гастроэнтеритом, который по тяжести варьирует от кратковременной диареи до тяжелого кровавого поноса с высокой температурой и явлениями интоксикации. Летальность невелика. Иммунитет изучен плохо. Диагностика кампилобактериоза может проводиться по короткой или полной схеме. Материал - испражнения, рвотные массы, ПВЖ (промывные воды желудка). Короткая схема включает широкое бактериоскопическое исследование :
На практике при наличии характерной клиники (диареи) достаточно короткой схемы исследования. Полная схема (бактериологический метод) проводится только с материалами, в которых при микроскопии обнаружены кампилобактерии. При этом, во многих случаях достаточно идентификации до группы C. Jejuni - coli. При проведении исследования необходимы условия: 1. Наличие высококачественных питательных сред, содержащих редуцирующие вещества (активированный уголь), витамины, 5% лизированной крови (источник гемина), 5% свежей крови (эритроциты - дополнительный сорбент метаболитов), антибиотики (амфоте-рицин и др.) для подавления сопутствующей микрофлоры. 2. Культивирование в присутствии СО 42 0 или специальных газовых смесей (5% кислорода, 10% СО 42 0, любой инертный газ). Можно использовать эксикаторы со свечей или надувать двойные полиэтиленовые пакеты выдыхаемым воздухом.
В начале 80-х годов были выделены так называемые «желудочные» кампилобактерии, обозначенные как C. pyloridis. В дальнейшем они были исключены из рода Campylo-bacter и получили название Helicobacter pylori. Отличаются от кампилобактерий внутриклеточным паразитизмом и продукцией уреазы (кампилобактерии уреазу не продуцируют). Обладают цитотропизмом к клеткам эпителия желудка и кишечника, являются возбудителями язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. По современным представлениям, язвенная болезнь в 99% случаев - это хеликобактериоз. Лабораторная диагностика хеликобактериоза несколько отличается от кампилобактериоза : 1. Материал для исследования - биоптаты. 2. Гомогенизация материала. 3. Почти не применяется бактериологический метод. Для диагностики используется комплексная микроскопия и определение уреазы в исследуемом материале. Хеликобактеры плохо красятся по Граму и не красятся простыми методам, поэтому используют специальные методы окраски, а также проводят исследования в фазово-контрастном и люминесцентном микроскопе. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА Для серо- и ликвородиагностики сифилиса, а также для отборочных исследований на сифилис применяется следующий комплекс серологических реакций (КСР): 1. Микрореакция преципитации типа VDRL с кардиолипиновым АГ КЛАГ с плазмой крови или инактивированной сывороткой крови (экспресс-метод); 2. РСК с трепонемным и кардиолипиновым АГ (реакция Вассермана); 3. Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ); 4. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). 5. Иммуноферментный анализ. Профилактическое обследование населения на сифилис должно проводиться с помощью экспресс-метода или КСР. С помощью микрореакции преципитации обследуются лица, подлежащие периодическим медицинским осмотрам на венболезни, а также лица, помещенные в медицинские вытрезвители, спецприемники, изоляторы для временного содержания под стражей и др. Эта реакция является не диагностическим, а отборочным тестом, в связи с чем на основании ее позитивности диагноз сифилиса не устанавливается, а обследуемые направляются к дерматовенерологу, который должен подвергнуть их клиническому обследованию и организовать исследование их крови в КСР, РИТ, РИФ. Одной из основных серологических реакций при сифилисе является реакция Вассермана (РВ). Реакция Вассермана ставится в 3-х рядах пробирок с использованием 2-х антигенов: КЛАГ - неспецифический и трепонемный антиген - специфический. Принцип реакции: реагины, находящиеся в сыворотке крови больных сифилисом, обладают свойством вступать в соединение с КЛАГ. Специфические антитрепонемные АТ вступают в соединение со специфическим АГ (ультраозвученный трепонемный АГ). Образовавшиеся комплексы АГ+ АТ сорбируют комплемент. Индикация достигается введением гемсистемы. Испытуемую сыворотку крови, разведенную 1:5, разливают в три пробирки. В первую пробирку добавляется специфический трепонемный АГ. Во вторую - неспецифический кардиолипиновый АГ. В третью - физиологический раствор. В качестве контроля используют заведомо положительную (++++), слабо положительную (++) и отрицательную ( - ) сыворотки. Оценка результатов. Используют систему четырех плюсов: полная задержка гемолиза - ++++ (резко положительная реакция); значительная задержка гемолиза - +++ (положительная реакция); частичная задержка гемолиза - ++ (слабо положительная реакция); незначительная задержка гемолиза - +; сомнительная - -/+ . ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗОВ ХЛАМИДИОЗЫ - разнообразные по патогенезу и клиническим проявлениям распространенные заболевания человека и животных. Хламидии - грамотрицательные бактерии с облигатным внутриклеточным паразитизмом. Биологическое своеобразие хламидий, выражающееся в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития, определяет самостоятельное положение этих микроорганизмов в системе прокариотов. Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, включающий одно семейство Chlamydiaceae, содержащее один род Chlamydia, состоящий из 3 видов: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae. Вид C. trachomatis - микроорганизмы, вызывающие заболевания, главным образом, у человека (антропонозные хламидиозы). Они обусловливают разнообразную патологию урогенитального тракта, глаз и связанную с ней хламидийную инфекцию иной локализации. Вид С. psittaci - включает микроорганизмы, первично поражающие животных. У человека они могут вызвать зоонозные хламидиозы (орнитоз, генерализованные инфекции, связанные с сельскохозяйственными и домашними животными). Вид C. pneumoniae - включает микроорганизмы, вызывающие респираторную патологию, передающуюся от человека к человеку. Возбудитель недостаточно изучен. Хламидии имеют две стадии жизненного цикла: одна - инфекционная стадия, элементарного тельца (ЭТ). Эта форма приспособлена к внеклеточному существованию; другая - ретикулярное тельце (РТ) - внутриклеточная практически неинфекционная стадия, лабильна, обладает выраженной метаболической активностью. ЭТ имеют размеры 0,3 мкм, содержат нуклеоид, в клеточной стенке имеется слой - аналог пептидогликана грам/- бактерий. Эта форма проникает в клетку при фагоцитозе. Из поверхностных мембран клетки хозяина вокруг этой маленькой частицы образуется вакуоль и ЭТ превращается в крупное ретикулярное тельце (диаметр 0,5-1 мкм). Внутри образованной вакуоли РТ многократно делится. В конечном счете вся эта вакуоль через 8-12 циклов деления заполняется этими частицами и превращается во включение (микроколонию). На последней операции образуется ЭТ нового поколения. Затем мембрана, ограничивающая микроколонию, повреждается и хламидии выходят в цитоплазму и далее за пределы клетки. Помимо ЭТ и РТ имеются промежуточные или переходные формы хламидий, которые образуются на двух стадиях цикла развития, на ранней при преобразовании ЭТ в РТ и на поздней - РТ в ЭТ. Хламидии чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам (эрит-ромицин, рифампицин). Хламидии имеют сложную антигенную структуру. Выделяют три основных антигенных комплекса. Родоспецифический термостабильный, липополисахаридный комплекс, характерный для представителей рода, видоспецифические и типоспецифические термолабильные белковые фракции. Видоспецифический антиген определяет принадлежность штаммов к соответствующему виду. Типоспецифические антигены позволяют дифференцировать различные серовары (серотипы) хламидий внутри вида. Вид C. psitacci объединяет возбудителей болезней птиц: орнитоз и пситаккоз (инфи-цировано до 140 видов птиц) и некоторых млекопитающих (экзогенные аборты, пневмонии и др.). Возбудитель передается человеку от птиц и животных, вызывает разнообразную форму патологии (поражения легких, заболевания нервной системы, гепатолиенальный синдром). Среди генерализованных форм летальность достигает 20%. Вид C. trachomatis имеет наибольшую социально-медицинскую значимость. Он весьма неоднороден и представлен 15 серотипами, относящимися к 3 биоварам. Биовар 1 - возбудитель трахомы, известный с древности. Это хронический кератоконьюнктивит, протекающий с воспалением коньюнктивы и роговицы, образованием рубцов и слепотой. До настоящего времени в ряде стран трахома интенсивно распространена. На территории бывшего союза ликвидирована в 60-е годы. В мире поражено трахомой 400 млн. человек. Биовар 2 - возбудитель венерической лимфогранулемы. Заболевание передается половым путем. Развивается гнойный паховый лимфаденит. Активно циркулирует в Юго-Восточной Азии. Выделяется и у нас (завозные случаи). Биовар 3 - возбудитель урогенитальных и экстрагенитальных хламидиозов: пневмоний новорожденных и младенцев, коньюнктивитов у новорожденных, коньюнктивитов у взрослых (так называемых «бассейновых»). Проблема заболеваний мочеполовых органов, вызываемых C. trachomatis за последние десятилетия приобрела чрезвычайно важное значение, что связано с высоким распространением данного вида инфекции и значительным числом развивающихся после нее осложнений. Крайне высок удельный вес хламидиозных уретритов и цервицитов среди таковых другой природы, а также различных форм восходящей генитальной хламидийной инфекции. Так, восходящая инфекция C. trachomatis может приводить к развитию эндометрита. |