Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Лабораторная диагностика пневмококковой инфекции. Основным методом лабораторной диагностики пневмококковой инфекции является бактериологический метод. Он основан на выделении S. pneumoniae. Исследуемый материал – кровь, спинномозговая жидкость (при диагностике инвазивных форм пневмококковой инфекции), мокрота, жидкость из полости среднего уха (при неинвазивных заболеваниях). Микроскопическое исследование окрашенного по Граму мазка, приготовленного из исследуемого материала, позволяет обнаружить капсульные грамположительные диплококки. Для выделения пневмококков материал высевают на кровяной агар и инкубируют в атмосфере углекислого газа при температуре 37ОС в течение суток. Дальнейшему исследованию подвергают сероватые колонии, образующие α-гемолиз (зеленое окрашивание агара вокруг колоний). Пневмококки, имеющие сильно развитую капсулу, на кровяном агаре образуют выпуклые сероватые слизистые (напоминающие капли масла) колонии несколько миллиметров в диаметре. Характерным для S. pneumoniae является ингибирование роста культуры оптохином (чувствительность к оптохину). Для этого культуру высевают на кровяной агар и сверху на засеянную поверхность помещают бумажные диски, содержащие 5 мкг оптохина. Инкубирование проводят в течение 18-24 часов при температуре 35ОС в атмосфере с 5-7% углекислого газа. Зона задержки роста ≥14 мм (диск диаметром 6 мм) или ≥16 мм (диск диаметром 10 мм) свидетельствует о присутствии пневмококка. Зона задержки роста <14 мм (<16 мм) требует проведения других тестов, в частности, теста лизиса в присутствии солей желчных кислот. Соли желчных кислот обладают способностью избирательно лизировать колонии S. pneumoniae на агаре или в бульоне. При этом происходит активация пневмококковых аутолизинов – ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки. Для проведения этого теста к микробной суспензии добавляют 10% раствор дезоксихолата натрия, тщательно перемешивают и инкубируют в течение 0,5-2 часов при температуре 35ОС. У большинства штаммов пневмококков в течение этого времени наступает визуальный лизис культуры, выявляемый по изменению мутности суспензии (просветление жидкости). Серологическое типирование пневмококка проводится с помощью реакции латексной агглютинации (РЛА) или реакции набухания капсулы по Нейфельду. Для реакции латекс-агглютинации используют групповые диагностические сыворотки (например, наборы PNEUMOTEST LATEX). Образование крупных хлопьев на фоне полного просветления указывает на положительную реакцию. Феномен набухания капсулы проявляется в резком увеличении размеров капсулы в присутствии противокапсульной сыворотки. Результат реакции наблюдают с помощью фазово-контрастного микроскопа. Антигены пневмококка в сыворотке крови, спинномозговой жидкости, моче можно обнаружить с помощью латекс-агглютинации, встречного иммуноэлектрофореза, иммунохроматографического теста. ПЦР основана на выявлении фрагментов специфических генов, кодирующих синтез аутолизина, пневмолизина, поверхностных белков клеточной стенки и др. При лабораторной диагностике сепсиса кровь, взятую шприцем из локтевой вены в объеме 5-10 мл, с соблюдением правил асептики сеют у постели больного во флакон с сахарным бульоном (в соотношении 1: 10) или комбинированной средой (скошенный сахарный агар + сахарный бульон). Микроскопия выросшей культуры дает предварительный ответ. С сахарного бульона производят пересев на кровяной агар. Профилактика пневмококковой инфекции. С целью специфической профилактики пневмококковой инфекции в Российской Федерации зарегистрированы 7-валентная, 10-валентная, 13-валентная конъюгированные вакцины и поливалентная пневмококковая вакцина. Вакцина пневмококковая конъюгированная адсорбированная 7- валентная содержит коньюгаты генно-модифицированного нетоксичного дифтерийного белка CRM197 с пневмококковыми полисахаридами серотипов 4, 6В, 9V, 14, 18C, 19F и 23F. Вакцина пневмококковая 10-валентная конъюгированная с D-протеином нетипируемой Haemophilus influenzae, столбнячным и дифтерийным анатоксинами адсорбированная содержит полисахариды 1, 4, 5, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19F, 23F. К таким препаратам относится вакцина Синфлорикс. Вакцина пневмококковая полисахаридная конъюгированная адсорбированная 13-валентная представляет собой комплекс полисахаридов 13 серотипов пневмококка (1, 3, 4, 5, 6А, 6В, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F), индивидуально конъюгированных с дифтерийным белком CRM197 и адсорбированных на фосфате алюминия. Конъюгированные вакцины предназначены, в первую очередь, для вакцинации детей с первого года жизни. Полисахаридная поливалентная пневмококковая вакцина содержит капсульные полисахариды S. pneumoniae 23 серотипов (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 33F). Вакцину Пневмо 23, содержащую полисахариды 23 серотипов, применяют детям старше 2 лет. Для вакцинации необходима всего одна доза вакцины. Длительность иммунитета после вакцинации составляет от 3-5 лет до 10 лет. Прививка особенно рекомендуется пациентам из групп риска: - лицам в возрасте старше 65 лет (летальность от пневмококковой пневмонии у них достигает 40%); - пациентам с хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой, дыхательной систем, сахарным диабетом, циррозом печени; - детям в возрасте до 5 лет, часто болеющим инфекциями дыхательных путей. Лечение пневмококковой инфекции проводится с использованием антибиотиков. Однако в последние годы возросло количество сообщений о распространении пневмококков, устойчивых к пенициллинам, макролидам, триметоприму/сульфаметоксазолу, цефалоспоринам III поколения. Прививка особенно рекомендуется пациентам из групп риска: - лицам в возрасте старше 65 лет (летальность от пневмококковой пневмонии у них достигает 40%); - пациентам с хроническими заболеваниями сердечно-сосудистой, дыхательной систем, сахарным диабетом, циррозом печени; - детям в возрасте до 5 лет, часто болеющим инфекциями дыхательных путей. Энтерококки. Таксономия. Энтерококки относятся к порядку Lactobacillales, семейству Streptococcaceae, роду Enterococcus. До 1984 г. энтерококки относились к стрептококкам группы Д, а с 1984 г. на основе анализа геномной ДНК энтерококки выделены в отдельный род. Род Enterococcus включает более 25 видов. Клиническое значение имеют виды E. faecalis, E. faecium, E. durans, E. gilvus, E. pallens. Энтерококки входят в состав нормальной микробиоты кишечника человека и животных. Основными представителями нормальной микробиоты кишечника человека являются E. Faecalis и E. faecium. Морфологические и тинкториальные свойства энтерококков. Энтерококки представляют собой овальные клетки. По Граму они окрашиваются в фиолетовый цвет (грамположительные), в мазках располагаются парами или короткими цепочками. Энтерококки не образуют спор и капсул, в большинстве случаев неподвижные, но некоторые виды имеют от 1 до 4 жгутиков. Культуральные и биохимические свойства энтерококков. Энтерококки являются факультативными анаэробами. Они хорошо растут на простых питательных средах, образуя через 24 часа мелкие серовато-белые колонии. Способны расти на средах, содержащих 6,5% хлористого натрия. На кровяном агаре большинство энтерококков не вызывают гемолиза. Однако некоторые виды энтерококков способны вызывать гемолиз (α- или β-гемолитические свойства) в зависимости от типа используемой крови (кролика, лошади, барана, человека). На агаре с кровью энтерококки образуют мелкие кремовые или белые колонии с ровным краем и гладкой поверхностью. У энтерококков выражены редуцирующие свойства: они изменяют окраску молока с метиленовым синим. Различные углеводы энтерококки расщепляют до кислоты без газа. Каталазоотрицательные. Все штаммы продуцируют фермент лейцинаминопептидазу (ЛАП). Энтерококки обладают высокой устойчивостью к различным факторам внешней среды и дезинфицирующим средствам. Они длительное время сохраняются на предметах домашнего обихода, выдерживают нагревание до 60ОС в течение 30 минут. Факторы патогенности энтерококков. Энтерококки являются представителями нормальной микробиоты желудочно-кишечного тракта, поэтому их можно отнести к условно-патогенным микроорганизмам. Многие факторы, способствующие выживанию энтерококков в определенной экологической нише, можно отнести и к факторам патогенности. Например, адгезины энтерококков участвуют в колонизации слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, а гидролаза желчных кислот позволяет им выживать в двенадцатиперстной кишке. Гены, кодирующие факторы патогенности, располагаются в особых регионах генома, которые называются островками патогенности (pathogenicity islands, PAI). Энтерококки способны изменять свою вирулентность путем удаления или приобретения отдельных элементов PAI. Островки патогенности являются мобильными элементами и могут передаваться от одного штамма другому. Эта способность позволяет энтерококкам перемещаться в различные биотопы хозяина и вызывать развитие патологического процесса. Для энтерококков характерна природная способность приобретать, аккумулировать и трансформировать экстрахромосомные элементы, кодирующие патогенные свойства. Энтерококковые поверхностные белки (Esp, Asa1, EfaA) участвуют в процессах адгезии и инвазии. Энтерококковый поверхностный белок Esp увеличивает антибиотико-резистентность энтерококков, способствует фиксации бактерий к эпителию мочевого пузыря и формированию биопленок. Липотейхоевая кислота клеточной стенки индуцирует образование фактора некроза опухоли и интерферона. Агрегирующая субстанция (AS) является поверхностным белком, способствующим прикреплению микробных клеток к эпителию. У E. faecalis этот белок способствует образованию агрегатов во время конъюгации бактерий, что облегчает обмен плазмидами. В развитии патологического процесса этому белку отводится роль адгезина к клеткам хозяина и белкам внеклеточного матрикса. Кроме того, энтерококки, обладающие AS, более резистентны к фагоцитозу, чем AS-отрицательные штаммы. Цитолизины (CylA, CylM) поражают эритроциты и некоторые другие эукариотические клетки. Гемолизин представляет собой белок, способный лизировать эритроциты человека. Гемолитическая активность проявляется четкой зоной гемолиза вокруг колоний на кровяном агаре. Желатиназа (GelE) гидролизует желатин, коллаген и другие низкомолекулярные пептиды, способствуя инвазии. Желатиназная активность энтерококков проявляется образованием зон опалесценции вокруг колоний на агаре с желатином. Гиалуронидаза разрушает гиалуроновую кислоту соединительной ткани, что способствует распространению бактерий в организме. Феромон (FsrB) представляет собой низкомолекулярный пептид, который способствует конъюгационной передаче плазмид между бактериальными клетками. Он также является хемоаттрактантом для нейтрофилов, поэтому участвует в регулировании воспалительной реакции. Бактериоцины (энтероцины) проявляют литическую активность по отношению к широкому кругу грамположительных и грамотрицательных бактерий: стафилококки, патогенные кишечные палочки, листерии. При контакте с бактериями они способны вызывать повреждение клеточной стенки с последующей гибелью клетки. Экология энтерококков. Энтерококки являются представителями нормальной микробиоты кишечника, ротовой полости и мочеполовой системы человека. Они играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых. Основными представителями микробиоты кишечника человека являются E. faecalis (90-95%) и E. faecium (5-10%). Энтерококки обладают выраженной антагонистической активностью в отношении стафилококков и кишечных палочек. Основная причина этого – способность энтерококков продуцировать короткие пептиды – энтероцины. Однако в последние годы возросло количество инфекционных заболеваний человека, вызванных энтерококками. Инфекции, вызываемые энтерококками, носят чаще всего эндогенный характер. Энтерококки вызывают оппортунистические инфекции при значительном снижении резистентности макроорганизма, особенно при травмах кишечника и мочеполового тракта или в результате инструментального обследования. В этих случаях бактерии проникают в стерильные в нормальных условиях органы и ткани и вызывают развитие инфекции. Энтерококки обладают природной устойчивостью к большинству антибиотиков, особенно к β-лактамным антибиотикам и аминогликозидам. Многие антибиотики действуют на энтерококки бактериостатически. В последние годы появились штаммы энтерококков с высокой вирулентностью, обладающие устойчивостью к ванкомицину (vancomycin-resistant enterococcus, VRE). VRE способны вызывать внутрибольничные инфекции (инфекции, связанные с оказанием медицинской помощи). В санитарной микробиологии энтерококки относятся к группе санитарнопоказательных микроорганизмов. Эпидемиология и патогенез энтерококковых инфекций. Энтерококки вызывают заболевания у человека только при значительном снижении резистентности организма, при травматизации или инструментальном обследовании кишечника и мочеполового тракта. В этих случаях энтерококки способны вызывать эндокардит, инфекции кожи и мягких тканей, инфекции мочевыводящих путей, остеомиелит, септический артрит, бактериемию, сепсис и другие заболевания. Они способны инфицировать ожоговые раны и имплантированные устройства. В последние годы возросла роль энтерококков в развитии внутрибольничных инфекций. При этом все более широкое распространение получают энтерококки, обладающие множественной устойчивостью к антибиотикам (бета-лактамным антибиотикам, аминогликозидам, тетрациклинам, ванкомицину и др.). Диагностика энтерококковых инфекций. Основной метод диагностики энтерококковых инфекций – бактериологический. Материалом для исследований служит гной, кровь, моча. Исследуемый материал высевают на кровяной агар. Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Характерные колонии пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры. Используют также энтерококк-агар, Enterococcus Agar, HiCrome UTI Agar. На чашках с хромогенным агаром (HiCrome UTI Agar) можно одновременно дифференцировать колонии голубовато-зеленого цвета Enterococcus faecalis от пурпурных колоний Escherichia coli, бесцветных колоний Staphylococcus aureus и мукоидных колоний голубого цвета Klebsiella pneumoniae и др. Чистую культуру энтерококков высевают на желчно-щелочной агар (ЖЩА) или желчно-эскулиновый агар и в молоко с 0,1% раствором метиленового синего. На ЖЩА через сутки проявляется рост в виде круглых блестящих синеватого цвета слегка выпуклых колоний. На желчно-эскулиновом агаре образуются серые колонии, окруженные черным ободком. В пробирках с молоком происходит редукция метиленового синего и изменение цвета среды с голубого на белый. Способность культуры расти на ЖЩА и редуцировать метиленовый синий в молоке указывает на ее принадлежность к энтерококкам. Идентификацию видовой принадлежности энтерококков проводят для назначения эффективной антибиотикотерапии или в целях эпидемиологического наблюдения. Профилактика. Средства специфической профилактики энтерококковых инфекций отсутствуют. Основное внимание должно уделяться соблюдению правил стерилизации и асептики при выполнении медицинских лечебно-диагностических процедур и оперативных вмешательств. Лечение энтерококковых инфекций осуществляют с помощью антибиотиков с учетом чувствительности выделенного клона к антимикробным препаратам. Чаще всего используют ампициллин, ванкомицин, тетрациклины, хинолоны. Однако с середины 90-х годов ХХ века получили распространение штаммы энтерококка, устойчивые к ванкомицину, что снижает эффективность лечения энтерококковой инфекции. 3 вопрос. Менингококки, основные свойства. Заболевания, вызываемые менингококками. Патогенез. диагностика менингококковых инфекций. Специфическая профилактика. Таксономия. Вид Neisseria meningitidis относится к семейству Neisseriaceae роду Neisseria. В составе этого вида по капсульным полисахаридным антигенам выделяют более 13 серогрупп (A, B, C, D, X, Y, Z, W и др.). По белковым и полисахаридным антигенам клеточной стенки выделяют 20 сероваров или серотипов. Наиболее частыми возбудителями генерализованной менингококковой инфекции являются серогруппы A, B и C. Морфологические и тинкториальные свойства. Мелкие диплококки. Характерно расположение в виде пары кофейных зерен, обращенных вогнутыми поверхностями друг к другу. Неподвижны, спор не образуют, грамотрицательные, имеют пили, капсула непостоянна. Менингококки по Граму окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). В мазках часто наблюдается неравномерное окрашивание: молодые клетки окрашиваются интенсивно, а старые клетки воспринимают краситель очень слабо. Культуральные свойства. Менингококки являются строгими аэробами и капнофилами. Они очень требовательны к условиям культивирования и хорошо растут в присутствии 5-7% углекислого газа. На простых питательных средах менингококки не растут, для их культивирования используют среды, содержащие кровь, сыворотку крови, яичный желток, аминокислоты, витамины. Оптимальное значение рН среды составляет 7,2-7,4. Оптимальная температура выращивания 37°С. На сывороточном агаре менингококки образуют полупрозрачные нежные колонии с ровными краями и блестящей поверхностью диаметром 0,5-1,5 мм. На кровяном агаре формируются полупрозрачные сероватые колонии, гемолиз отсутствует. На шоколадном агаре менингококки растут в виде нежных полупрозрачных сероватых колоний с ровными краями, блестящей поверхностью, маслянистой консистенции размером 1-2 мм. На 0,1% полужидком сывороточном агаре менингококк вызывает интенсивное помутнение в верхней части столбика среды. В сывороточном бульоне менингококки вызывают гомогенное помутнение ближе к поверхности среды. Биохимическая активность менингококков низкая. Они разлагают глюкозу и мальтозу до кислоты без газа, не разжижают желатин, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты. На среде с сахарозой не образуют полисахарид, что отличает менингококки от условно-патогенных нейссерий. |