Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Лабораторная диагностика пищевых интоксикаций бактериальной природы: 1. Материалом для определения стафилококкового энтеротоксина являются рвотные массы, промывные воды желудка больных, остатки пищи (чаще кремы, сметана, мороженое, а также мясные продукты, в которых хорошо размножаются стафилококки). С целью выделения чистой культуры стафилококка исследуемые материалы, которые могут содержать жизнеспособные бактерии, засевают в чашки с ЖСА. Для эпидемиологического анализа массовых стафилококковых интоксикаций проводят фаготипирование выделенных культур с помощью набора стафилококковых фагов. 2. Материалом для выявления энтеротоксина клостридий С. perfringens являются мясные, рыбные консервы и другие продукты, из которых экстрагируют токсин изотоническим раствором хлорида натрия. Экстракт центрифугируют и надосадочную жидкость вводят внутрибрюшинно белым мышам или внутрикожном морским свинкам. Гибель животных в течение первых 3-4 дней появление некроза на месте внутрикожных инъекций свидетельствует о наличии токсина. Для его идентификации ставят реакцию нейтрализации с антитоксическими сыворотками С. perfringens. Выделение чистой культуры С. perfringens и С. botulinum производят, используя методы выделения анаэробных бактерий. 3. Материалом для выявления ботулотоксина служат сыворотка крови, моча, испражнения, промывные воды желудка больного, остатки пищи или подозреваемые продукты (колбасы, мясные, рыбные, фруктовые, овощные консервы и др.). Для обнаружения ботулотоксина в сыворотке крови больного ставят реакцию нейтрализации таксина антитоскической сывороткой в биопробе на белых мышах. (с , моновалентными антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, Е. F,C В качестве контроля берут нормальную сыворотку крови. При нейтрализации токсина гомологичной антитоксической сывороткой мыши остаются живыми. 9 вопрос. Возбудители холеры и вибриозов, их биологические свойства. Патогенез холеры. Иммунитет. Микробиологическая диагностика. Препараты для специфической терапии и специфической профилактики холеры. Классификация возбудителя. Вид V. cholerae относится к роду Vibrio семейству Vibrionaceae отделу Cracilicutes. Род Vibrio насчитывает 55 видов, из которых наибольшее значение для человека имеют V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. alginalyticus, V. vulnificus и V. fluvialis. Эти виды вибрионов вызывают у человека различные по клиническим признакам заболевания (холеру, гастроэнтериты, отиты, раневую инфекцию, менингит). Вид V. cholerae включает 206 серогрупп, которые различаются по структуре соматического О-антигена. Их разделяют на агглютинирующиеся типовой холерной О1-сывороткой (V. cholerae O1) и на неагглютинирующиеся типовой холерной О1- сывороткой (V. cholerae non O1). Вибрионы, неагглютинирующиеся О1-сывороткой, называются неагглютинирующимися (НАГ) вибрионами. “Классическая” холера вызывается холерным вибрионом серогруппы О1 (V. cholerae O1). К этой серогруппе относятся 2 биовара: классический (V. Cholerae биовар cholerae или V. cholerae биовар asiaticae) и Эль-Тор (V. cholerae биовар eltor). Биовары V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor включают по 3 биотипа: Инаба (Inaba), Огава (Ogawa) и Гикосима (Hikojima). Кроме представителей серогруппы О1 холеру вызывает вибрион серогруппы О139 (V. cholerae bengal). Вибрионы, относящиеся к другим серологическим группам (О2-О138, О140- О206), могут вызывать у людей спорадические или групповые случаи диарейных заболеваний, не склонных к эпидемическому распространению. Морфологические и тинкториальные свойства. V. cholerae представляет собой изогнутые короткие подвижные палочки. Для холерных вибрионов характерен полиморфизм – в клиническом материале обнаруживаются типичные изогнутые формы, а в препаратах с питательных сред преобладают прямые палочковидные формы. Холерный вибрион является монотрихом, так как имеет один длинный жгутик, расположенный на конце клетки (подвижный). Подвижность холерных вибрионов является одним из диагностических признаков возбудителя. Пили (фимбрии) представляют собой тонкие гибкие нитевидные образования на поверхности бактериальной клетки. Пили являются рецепторами для фага СТХφ. Они необходимы для колонизации микроворсинок тонкого кишечника и принимают участие в образовании биопленки на поверхности тела гидробионтов. Клетки холерного вибриона хорошо окрашиваются основными анилиновыми красителями, грамотрицательные. Широко используется окраска препаратов разведенным карболовым фуксином Циля. При этом вибрионы приобретают интенсивный розовый цвет. Холерный вибрион не образует спор. Клетки V. cholerae серогруппы О1 не образуют капсулы, а клетки V. cholerae серогруппы О139 имеют полисахаридную капсулу. Культуральные свойства. Холерные вибрионы являются факультативными анаэробами, но предпочитают аэробные условия выращивания. Оптимальная температура культивирования составляет 37°С. Холерные вибрионы относятся к группе щелочелюбивых микроорганизмов. Они хорошо растут на простых питательных средах с высоким значением рН (7,6-8,2). Это свойство используется при подборе питательных сред для выращивания холерного микроба. Элективными питательными средами для культивирования холерного вибриона являются щелочной МПА, ТСВS-агар (питательный агар с тиосульфатом натрия, цитратом, бромтимоловым синим и сахарозой), среда СЭДХ (сухая элективнодифференциальная среда для выделения холерного вибриона) или СЭДХ-М (модернизированная среда СЭДХ), среда Монсура (таурохолат-теллуритовый агар с желатином). Состав питательных сред, применяемых для выращивания холерного вибриона, представлен в приложении №1. Чаще всего используют щелочной МПА, на котором холерный вибрион образует круглые гладкие стекловидно-прозрачные с голубоватым оттенком и слабой опалесценцией колонии S-формы вязкой консистенции (рисунок 20). Размер колоний на щелочном агаре через 10-12 часов культивирования не превышает 1 мм в диаметре, а через 18-24 часа достигает 2-3 мм. На TCBS-агаре возбудитель холеры образует плоские полупрозрачные желтые колонии размером 2-3 мм в диаметре на сине-зеленом фоне среды. На среде Монсура (желтого цвета) через 12-18 часов культивирования формируются колонии серого или черного цвета (за счет восстановления теллурита) диаметром 2,0-2,5 см. В щелочной пептонной воде (рН 8,6-9,0), содержащей 0,5-1,0% натрия хлорида, холерный вибрион уже через 6-8 часов вызывает легкое помутнение и образование нежной голубоватой плёнки на поверхности среды, края пленки приподняты вдоль стенок пробирки, при встряхивании пленка легко разрушается и оседает на дно пробирки. Пептонная вода с добавлением 0,5-1% натрия хлорида является оптимальной средой накопления при выделении возбудителя холеры из исследуемого материала. Биохимические свойства. Возбудители холеры обладают сахаролитической и протеолитической активностью. Холерные вибрионы сбраживают с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, маннозу, маннит, лактозу (медленно), крахмал. Ферментация глюкозы может протекать как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эта способность выявляется на среде Хью-Лейфсона. Среда содержит питательный агар, глюкозу и индикатор. Посев производится вглубь столбика агара в две пробирки. В одну из пробирок вносят вазелиновое масло для создания анаэробных условий. При росте холерного вибриона цвет среды за счет разложения глюкозы до кислоты изменяется в обеих пробирках. Холерный вибрион не ферментируют арабинозу, лактозу и инозит. Холерные вибрионы относятся к первой группе Б. Хейберга (ферментируют маннозу и сахарозу и не разлагают арабинозу). Протеолитическая активность холерного вибриона выявляется при посеве культуры уколом в столбик желатина. Холерные вибрионы обладают плазмокоагулирующим (свёртывают плазму крови) и фибринолитическим (разжижают свёрнутую сыворотку) действием. Они свёртывают молоко, разлагают белки до аммиака и индола, сероводорода не образуют, восстанавливают нитраты в нитриты (положительная нитрозо-индоловая реакция). Биовар Эль-Тор обладает гемолитической активностью в отношении эритроцитов барана. Лизис эритроцитов барана определяется в пробе Грейга. Гемолизин действует как порообразующий токсин. Однако в настоящее время выделяются штаммы V. cholerae eltor, утратившие гемолитические свойства. Такие штаммы отличаются от классических холерных вибрионов только способностью агглютинировать эритроциты и устойчивостью к полимиксину В. Вибрионы серогруппы О139 также не обладают гемолитической активностью и устойчивы к полимиксину В, но в отличие от V. cholerae eltor имеют капсулу. Биохимические признаки позволяют дифференцировать возбудителей холеры.
Восстановление нитратов и образование индола учитывает нитрозоиндоловая реакция (холера-рот-реакция). Для постановки этого теста в пептонную воду добавляют 0,1% калия или натрия нитрата и высевают исследуемую культуру. К выросшей культуре добавляют 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Положительная реакция проявляется в изменении первоначального желтого цвета среды на ярко-красный, что свидетельствует об образовании нитрозоиндола. Механизм реакции заключается в том, что холерный вибрион восстанавливает нитрат в нитрит, а добавленная серная кислота вытесняет из нитрита азотистую кислоту, которая соединяется с индолом с образованием нитрозоиндола, придающего среде красный цвет. Протеолитические свойства определяются путем посева культуры уколом в столбик желатина. Положительный результат проявляется разжижением желатина после культивирования при температуре 37 ОС. Антигенная структура. У вибрионов выделяют термостабильные О-антигены и термолабильные Н-антигены. По структуре О-антигена выделяют 206 серологических групп вибрионов (О1 – О206). Возбудителями холеры являются вибрионы, относящиеся к серогруппам О1 и О139. В составе О1-антигена холерных вибрионов выделяют компоненты А, В и С. По сочетанию этих компонентов различают три серотипа V. cholerae - серотип Огава (компоненты А и В), серотип Инаба (компоненты А и С) и серотип Гикосима (компоненты А, В и С). Возбудители классической холеры и холеры Эль-Тор объединяют в О1-серогруппу. Серогруппу О139 представляют V. cholerae bengal. Н-антиген представляет собой термолабильный белок флагеллин. Этот антиген является общим для всего рода Vibrio. В стадии диссоциации холерный вибрион имеет OR-антиген. Сыворотка против OR-антигена используется наряду с О-сывороткой и типоспецифическими сыворотками Инаба и Огава для идентификации V. Cholerae. Факторы патогенности холерного вибриона. К факторам патогенности холерного вибриона относятся: - подвижность и хемотаксис (способность бактерий двигаться по направлению к аттрактантам, то есть к питательным веществам); - факторы адгезии и колонизации: токсин-корегулируемые пили (toxin coregulated pilus, TCP); гемагглютинины; белки внешней мембраны; - токсины: экзотоксин – холероген (СТ – cholera toxin) и эндотоксин; - ферменты агрессии: фибринолизин, гиалуронидаза, нейраминидаза, муциназа, протеаза и др. Благодаря подвижности за счет жгутиков и хемотаксису холерный вибрион преодолевает слой слизи на поверхности энтероцитов кишечника и вступает во взаимодействие с эпителиальными клетками. У мутантов холерных вибрионов, утративших подвижность или способность к хемотаксису, вирулентность резко снижается. Основными компонентами микробной клетки, обеспечивающими адгезию (прикрепление) возбудителя холеры к энтероцитам, являются токсинкорегулируемые пили, гемагглютинины и белки внешней мембраны. Токсин-корегулируемые пили (ТСР) или фимбрии представляют собой тонкие гибкие нитевидные образования на поверхности бактериальной клетки. Они состоят из белковых повторяющихся субъединиц с молекулярной массой 20,5 кД. С помощью ТСР холерные вибрионы прикрепляются к энтероцитам. После адгезии вибрионы утрачивают подвижность и интенсивно размножаются, колонизируя микроворсинки тонкого кишечника. ТСР кодируются кластером генов, входящих в состав островка патогенности VPI. Непосредственно за синтез ТСР отвечают гены tcpA-F, причем за биосинтез основной субъединицы пилей отвечает ген tcpA. Вместе с ТСР в колонизации энтероцитов принимают участие белки внешней мембраны холерного вибриона. Основная роль при этом принадлежит белку OmpU, который защищает микробную клетку от бактерицидного действия содержимого кишечника. Кроме того, белки ТСР и OmpU являются важными протективными антигенами возбудителя холеры. Антитела к ним прекращают инфекционный процесс, предотвращая адгезию и колонизацию энтероцитов. Вслед за адгезией и колонизацией происходит синтез холерного экзотоксина холерогена – СТ (cholera toxin) и его секреция в окружающую среду. Холероген является главным фактором патогенности возбудителя холеры. Он секретируется в окружающую среду системой секреции II типа. СТ состоит из компонентов А и В. Компонент А имеет молекулярную массу 27,2 кД и состоит из 2 пептидов – А1 и А2, связанных дисульфидными мостиками. Пептид А2 служит для связи фрагментов А и В. Компонент В имеет молекулярную массу 58 кД и состоит из пяти кольцевидно соединенных субъединиц. Компонент В выполняет функцию связывания вибриона с энтероцитами, а компонент А – каталитическую (токсическую) функцию. Компонент В через 1-3 минуты после выделения токсина из микробной клетки распознает на поверхности энтероцита специфический рецептор (ганглиозид Gm1), связывается с ним и формирует внутримембранный канал для прохождения компонента А внутрь клетки. Внутри клетки белок А1 взаимодействует с протеином G, располагающимся на внутренней стороне мембраны энтероцита. Образующаяся АДФ-рибоза связывается с регуляторной субъединицей аденилатциклазы, в результате чего внутри клетки происходит повышение концентрации циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Эти изменения происходят в течение 30 минут после контакта токсина с клеточным рецептором. Гиперпродукция цАМФ приводит к выходу из энтероцитов в просвет кишечника изотонической жидкости с низким содержанием белка и высокойконцентрацией катионов и анионов (Na+ , НСО3- , К+ , Сl -). Все это приводит к развитию диареи, обезвоживанию и обессоливанию организма. Кроме того, в результате этого в просвете кишечника создается идеальная щелочная среда для размножения возбудителя. Эндотоксин V. cholerae представляет собой термостабильный липополисахарид (ЛПС). Он отвечает за общую интоксикацию организма и рвоту. Антитела, образующиеся против эндотоксина, обладают выраженным вибриоцидным действием (растворяют вибрионы в присутствии комплемента) и являются важным компонентом постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Ферменты агрессии разрушают вещества, содержащиеся в слизи и облегчают продвижение вибрионов к эпителиальным клеткам. В частности, муциназа разрушает муцин, облегчает проникновение вибрионов к поверхности эпителия и открывает доступ к рецептору – ганглиозиду Gm1. Нейраминидаза (сиалидаза), отщепляя от гликопротеинов эпителия сиаловую кислоту, способствует адгезии вибрионов на поверхности энтероцитов. Кроме того, она увеличивает количество рецепторов для холерогена путем модификации три- и дисиалоганглиозидов в моносиалоганглиозид Gm1, который служит рецептором для экзотоксина-холерогена. Ген nan, определяющий синтез нейраминидазы (NanH), входит в состав островка патогенности VPI-2. Основные факторы патогенности холерного вибриона детерминируются генами, расположенными на мобильных генетических элементах (МГЭ). К числу МГЭ относятся умеренный профаг СТХφ, два острова патогенности (VPI-1 и VPI-2), два острова пандемичности (VSP-1 и VSP-2), интегронный остров. Биосинтез холерного токсина определяется генами ctxAB, входящими в состав профага СТХφ. Бактериофаг фи вызывает лизогенную конверсию холерного вибриона. При этом холерные вибрионы классического биовара продуцируют холерный токсин 1-го типа, а вибрионы биовара eltor – холерный токсин 2-го типа. У нетоксигенных штаммов элемент СТХ отсутствует. МГЭ присутствуют на двух хромосомах V. cholerae: большой и малой Эпидемиология. Холера является типичной антропонозной инфекцией. Природный резервуар - загрязненная вода; источник инфекции – больной человек с первых дней заболевания и бактерионоситель. Опасность представляют как больные с типичной формой холеры, так и больные со стертыми, субклиническими и атипичными формами заболевания, а также реконвалесценты после типичной или субклинической формы холеры (вибриовыделители – реконвалесценты). При холере имеет место так называемый феномен “айсберга”, когда на 1 больного приходится до 100 носителей. Продолжительность вибриононосительства у реконвалесцентов редко превышает 2-4 недели, иногда длится до 3 лет. Известно транзиторное здоровое носительство, когда заболевание не развивается, но в фекалиях в течение длительного времени обнаруживается возбудитель (характерно для инфекции, обусловленной биоваром Эль-Тор). В литературе описан случай носительства холерного вибриона в течение 13 лет (“холерная” Долорес). Основные механизмы передачи - фекально-оральный и контактный. Факторы передачи – вода, пищевые продукты, объекты окружающей среды. В воде открытых водоемов холерный вибрион часто находится в ассоциациях с зоопланктоном (в частности, с веслоногими рачками) и водными растениями. Пути заражения холерой – водный (через воду, используемую для питья, купания и хозяйственно-бытовых нужд), алиментарный (пищевой) и контактно-бытовой. Определённую роль могут играть мухи, способные переносить возбудителя с испражнений больного человека на пищевые продукты. |