Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Двухсахарный агар (среда Ресселя) также позволяет изучать ферментацию лактозы и глюкозы. Среда имеет исходный зеленый цвет. Ферментация глюкозы и отсутствие разложения лактозы проявляется тем, что столбик агара приобретает желтый цвет, а “язычок” среды становится синим. Трехсахарный агар (среда Олькеницкого) предназначена для определения ферментации лактозы, глюкозы, сахарозы и выявления уреазы. Готовая среда имеет красный цвет. Ферментация глюкозы и отсутствие разложения лактозы и сахарозы проявляется изменением цвета столбика среды на желтый с сохранением красного цвета “язычка” среды. Отсутствие черного преципитата указывает на то, что шигеллы не продуцируют сероводород. Утилизацию цитрата определяют на среде Симмонса. Готовая среда имеет травянисто-зеленую окраску. Шигеллы не утилизируют цитрат (рост отсутствует), поэтому цвет среды не изменяется. Реакцию с метиловым красным проводят, выращивая культуру на среде Кларка. Положительная реакция проявляется красным окрашиванием среды при добавлении к культуре индикатора. При исследовании биохимических свойств необходимо помнить, что некоторые представители S. flexneri расщепляют глюкозу до кислоты и газа, а S. sonnei способна медленно (в течение 72 часов) ферментировать лактозу. Среди шигелл встречаются как ферментирующие маннит виды (S. flexneri, S. sonnei, S. boydii), так и виды, не ферментирующие маннит (S. dysenteriae). Антигенная структура. Шигеллы обладают соматическим термостабильным О-антигеном и термолабильным К-антигеном. Соматический О-антиген представляет собой липополисахарид клеточной стенки и является групповым. В зависимости от строения О-антигена шигеллы подразделяются на серотипы. Внутри серотипов выделяют подтипы. Серотипы обозначаются арабскими цифрами, а подтипы - арабскими цифрами с добавлением строчных латинских букв. К-антигены маскируют О-антигены и препятствуют агглютинации бактерий О-антисыворотками. К-антигены отсутствуют у шигелл Зонне и Флекснера. Факторы патогенности шигелл. Основные факторы патогенности шигелл: - эндотоксин - липополисахаридный комплекс; - экзотоксины (цитотоксин или токсин Шига, термостабильный и термолабильный энтеротоксины); - белки наружной мембраны; - факторы персистенции; - ферменты агрессии (гиалуронидаза, фибринолизин, плазмокоагулаза, нейраминидаза, муциназа); - структурные компоненты клетки (микрокапсула, пили). Патогенность наиболее выражена у S. dysenretiae серовара 1 (бактерии Григорьева-Шига), меньше у S. flexneri и еще меньше у других видов шигелл. Гены, кодирующие патогенность шигелл, располагаются в хромосомах и плазмидах: Эндотоксин выделяется при разрушении микробных клеток, обусловливает развитие интоксикационного синдрома. Он защищает также бактерии от действия кислой среды желудка и желчи. Цитотоксин повреждает мембраны эпителиальных клеток. S. Dysenteriae серовара 1 продуцирует белковый токсин Шига (SLT-1), остальные шигеллы продуцируют шигаподобные токсины (SLT-2). Токсин Шига кодируется хромосомным геном stx. Эти токсины состоят из субъединиц А и В. Субъединица В связывается с гликолипидом Gb3 мембраны клетки, а затем субъединица А проникает внутрь клетки и блокирует синтез белка на рибосомах (цитотоксическое действие). Кроме цитотоксичности токсин Шига оказывает энтеротоксическое, нейротоксическое и нефротоксическое действие, что проявляется нарушением вводно-солевого обмена, деятельности ЦНС, гибелью эпителиальных клеток толстого кишечника и поражением почечных канальцев. Энтеротоксины ShET-1 и ShET-2 усиливают секрецию жидкости и солей в просвет кишечника, обусловливая диарею. Синтез токсина ShET-1 кодируется хромосомными генами. Его продуцирует только S. flexneri серотипа 2а. Синтез токсина ShET-2 кодируют плазмидные гены, его синтезируют другие виды шигелл. Пили и белки наружной мембраны способствуют адгезии бактерий на эпителиальных клетках и их инвазии в клетки эпителия. Адгезии и колонизации способствуют бактериальные ферменты, разрушающие слизь - нейраминидаза, гиалуронидаза, муциназа. Способность к инвазии и межклеточному распространению связана с наличием у шигелл крупной плазмиды. Эта плазмида детерминирует синтез ipa-инвазинов (invasion plasmide antigen) - белков, входящих в состав наружной мембраны. Факторы персистенции способствуют внутриклеточному размножению шигелл и их межклеточному распространению шигелл. Эти факторы представляют собой белки, вызывающие лизис мембран эпителиальных клеток. Внутриклеточному паразитированию способствуют также антилизоцимная, антиинтерфероновая и антииммуноглобулиновая активность шигелл. Патогенез дизентерии. Шигеллы, проникнув в организм через рот, частично разрушаются в желудке с высвобождением эндотоксина. Оставшиеся в живых бактерии проникают в тонкий кишечник, где находятся в течение нескольких суток. В тонкой кишке шигеллы прикрепляются к энтероцитам и секретируют энтеротоксины, вызывающие повышенную секрецию жидкости и солей в просвет кишки. Однако основной патологический процесс при шигеллезах развивается в дистальном отделе толстого кишечника – в сигмовидной и прямой кишке. Шигеллы, проникнув в толстый кишечник, колонизируют слизистую оболочку. Этому способствуют пили, микрокапсула, ферменты агрессии шигелл (муциназа, нейраминидаза, гиалуронидаза). С помощью ipa-белков (инвазинов) шигеллы прикрепляются к М-клеткам и проникают в них путем эндоцитоза. В составе вакуоли шигеллы транспортируются через М-клетку, достигают подслизистой кишечника и поглощаются макрофагами. Внутри макрофагов происходит размножение шигелл. Активное размножение возбудителя в макрофагах сопровождается выделением цитотоксинов (токсина Шига или шигаподобных токсинов), вызывающих воспалительный процесс в подслизистом слое. После гибели макрофагов шигеллы проникают через базальную мембрану в энтероциты. Размножающиеся внутри энтероцитов бактерии распространяются на соседние эпителиальные клетки через пальцеобразные выросты клеточной поверхности. Эти выросты “фагоцитируются” соседними клетками, поэтому шигеллы достигают цитоплазмы новых клеток, не выходя во внеклеточное пространство. Продвижению возбудителя из клетки в клетку способствует то, что при внутриклеточном перемещении на одном из полюсов клетки формируют хвост из коротких пучков актина, который в качестве псевдожгутика проталкивает бактерии в соседние клетки. Внутриклеточное размножение бактерий и выделение токсина Шига или шигаподобных токсинов приводит к гибели клеток. В месте поражения развивается отек, катаральное или фиброзно-некротическое воспаление, образуются эрозии и язвы. В результате этого в испражнениях появляются слизь, кровь, гной. Гибель шигелл приводит к выделению эндотоксина и поступлению его в кровь (эндотоксинемия). Эндотоксин вызывает интоксикацию, усиление перистальтики кишечника, понос. Бактериемии при шигеллезах не наблюдается. Патологический процесс ограничивается кишечником. При хронической дизентерии ведущая роль принадлежит не интоксикации, а прогрессирующему нарушению функций желудочно-кишечного тракта. Выздоровление при дизентерии в основном сопровождается освобождением организма от возбудителя. Однако у части больных очищение организма от бактерий затягивается до 1 месяца и более (реконвалесцентное носительство), а иногда болезнь приобретает хроническое течение. Эпидемиология. Шигеллез является антропонозной инфекцией с фекально-оральным механизмом передачи. Заболевание, вызываемое S. dysenteriae, имеет контактнобытовой путь передачи возбудителя, S. flexneri - водный, а S. sonnei - алиментарный. Восприимчивость людей высокая. Заболевания распространены повсеместно, чаще всего проявляются в виде вспышек алиментарного или водного характера. Для бактериальной дизентерии характерна летне-осенняя сезонность. Инфицирующая доза при шигеллезе составляет 200-300 микробных клеток. Источник инфекции – больные лица с острой, хронической или субклинической формами болезни и бактерионосители. Они выделяют возбудителя во внешнюю среду с фекалиями. Особую опасность представляют больные и бактерионосители из числа работников питания и водоснабжения. Больные дизентерией заразны с начала болезни, а иногда – с конца инкубационного периода. Длительность выделения возбудителя больными составляет 1 неделю, иногда затягивается до 2-3 недель. Факторы передачи – зараженная пища, вода, руки и другие объекты. Клиника. Выделяют следующие формы и варианты течения болезни: 1. Острая дизентерия (колитический и гастроэнтероколитический варианты). По тяжести течения выделяют легкие, среднетяжелые и тяжелые формы. 2. Хроническая дизентерия (рецидивирующая и непрерывная). 3. Бактерионосительство (реконвалесцентное и транзиторное). Основным клиническим проявлением заболевания является колитический вариант. Инкубационный период составляет от 1 до 7 дней (в среднем - 2-3 дня). Начало заболевания острое и связано с развитием синдрома общей интоксикации. Температура тела повышается до 38-39ОС. Отмечается озноб, головная боль, чувство разбитости, тошнота, рвота, режущие схваткообразные боли в животе. У больного отмечается частый жидкий стул. Первоначально частота стула достигает 10 раз в сутки и более. Со временем стул становится редким и скудным с примесью слизи, крови и гноя. Дефекация, как правило, не приносит облегчения. Характерно при дефекации выделение небольшого количества слизи с прожилками крови (“ректальный плевок”). Дефекация сопровождается тенезмами (мучительными тянущими болями в прямой кишке). Период разгара болезни продолжается от 1 до 9 дней. Полное выздоровление наступает через 3-6 недель. Острая форма заболевания примерно в 3% случаев переходит в хроническую инфекцию. Развитию хронической формы заболевания способствует внутриклеточный паразитизм шигелл. Примерно в 2% случаев после острой формы заболевания формируется длительное бактерионосительство. Осложнениями шигеллезов являются дисбактериоз, кишечные кровотечения, прободение стенки кишечника. Летальность при бактериальной дизентерии в настоящее время достигает 0,3-1%. Наиболее тяжело протекает шигеллез, вызванный S. Dysenteriae серовара 1. S. sonnei вызывает заболевание в легкой форме, часто в виде бактерионосительства. Выделение шигелл у лиц, перенесших острую дизентерию, в течение 3 месяцев при отсутствии симптомов болезни и при нормальных результатах ректороманоскопии называется реконвалесцентным бактерионосительством. Транзиторное бактерионосительство – это однократное выделение шигелл практически здоровыми лицами, не болевшими дизентерией и не имевшими дисфункций кишечника на протяжении 3 месяцев. После перенесенного заболевания формируется непродолжительный видо- и типоспецифический иммунитет. Возможны повторные заболевания. Иммунитет. В защите от инфекции основная роль принадлежит факторам местного иммунитета слизистой кишечника: секреторным IgA, Т-лимфоцитам, нейтрофилам. Эти факторы препятствуют адгезии шигелл на энтероцитах и способствуют их уничтожению. Исследования последних лет показали, что нейтрофилы “выбрасывают” сетевидные образования, в которых задерживаются и погибают микроорганизмы. Эти новые структуры получили название нейтрофильных экстрацеллюлярных ловушек - НЭЛ Диагностика. Лабораторная диагностика шигеллезов включает следующие методы: 1. Экспресс-методы - РНГА, РКоА, РИФ. 2. Бактериологический метод: - посев на среды Плоскирева, Левина, Эндо; - выделение чистой культуры (пересев типичных колоний на среду Олькеницкого, агар Клиглера, цитратный агар Симмонса, среду Кларка); - изучение свойств культуры (окраска по Граму, ферментативные свойства, антибиотикограмма, чувствительность к фагу). 3. Серологические методы (РА, РНГА). Основным методом диагностики является бактериологический, который позволяет выделить чистую культуру возбудителя (копрокультуру) и изучить ее свойства. Материалом для исследования служат испражнения, пищевые продукты, иногда – рвотные массы. Для исследования из средней порции кала отбирают стеклянной палочкой слизисто-гнойные образования. Фекалии можно отбирать непосредственно из прямой кишки с помощью ватного тампона или специальных ректальных трубок Цимана. Слизь (гной) из мест поражения слизистой оболочки можно получать непосредственно во время колоноскопии. Для отбора эпителиальных клеток используют петлю, которую вводят в прямую кишку на 10-20 см. Полученный соскоб со слизистой оболочки прямой кишки помещают в среду 199 с лизоцимом и инкубируют в термостате при 37ОС в течение 3-6 часов, после чего центрифугат высевают на питательные среды. Посуду, используемую для отбора материала, не обрабатывают дезинфицирующими растворами, так как шигеллы чувствительны ко многим дезсредствам. В первый день отобранный материал непосредственно у постели больного высевают в среду обогащения (селенитовый бульон) и в чашки Петри на лактозосодержащие дифференциальные плотные питательные среды (Плоскирева, Левина, Эндо). При невозможности посева материала на дифференциальные среды в течение первых двух часов используют консервант (глицериновая смесь, буферный раствор фосфорнокислых солей, желчный бульон, селенитовый бульон). Для посева используют слизисто-гнойные комочки испражнений. На второй день среди выросших колоний отбирают мелкие прозрачные бесцветные колонии, которые микроскопируют, исследуют на подвижность и пересевают на среду Олькеницкого для выделения чистой культуры. При наличии типичных колоний проводят ориентировочную реакцию агглютинации на стекле со смесью сывороток Флекснера и Зонне. На третий день учитывают характер роста культуры на среде Олькеницкого (столбик агара желтого цвета, скошенная часть агара не изменена, почернение отсутствует) и полученную чистую культуру исследуют по биохимическим свойствам (посев в среды Гисса). На четвертый день учитывают результаты изучения биохимических свойств выделенной культуры. Для изучения биохимической активности применяют также энтеротесты или пластинки с ячейками, содержащими высушенные питательные среды и субстраты для 24 тестов. Выделенные культуры шигелл идентифицируют до вида и серовара, культуры S. flexneri - до подтипов, а культуры S. sonnei - до хемоваров. энтеротубы. В частности, набор ЭНТЕРОтест 24 представляет собой пластмассовые Таксономия и классификация шигелл. Шигеллы относятся к порядку Enterobacteriales, семейству Enterobacreriaceae и роду Shigella. Род Shigella включает 4 серогруппы: - серогруппа А включает вид S. dysenteriae и объединяет 15 серотипов; - серогруппа В включает вид S. flexneri и объединяет 6 серотипов с подтипами и 2 варианта; - серогруппа С включает вид S. boydii и состоит из 19 серотипов; - серогруппа D включает вид S. sonnei и содержит 1 серотип, подразделяющийся на 7 биохимических вариантов (хемоваров). Представители серогрупп А, В и С имеют схожие биохимические признаки, а бактерии серогруппы D отличаются от них по биохимическим свойствам. В настоящее время Международная классификация шигелл построена с учетом их биохимических признаков и особенностей структуры О-антигена. Основное внимание в классификации уделено ферментации маннита и лактозы. Группу А составляют неферментирующие маннит шигеллы, группы В и С – ферментирующие маннит шигеллы, группу D – шигеллы, ферментирующие маннит и медленно разлагающие лактозу.
Для установления видовой принадлежности возбудителя используют реакцию агглютинации (РА) на стекле, которую сначала ставят с видовыми сыворотками Зонне и Флекснера, и при выделении палочки Флекснера – с типовыми сыворотками. Для этого используют поливалентные и моновалентные диагностические агглютинирующие сыворотки. Для быстрого обнаружения шигелл в исследуемом материале применяют РНГА, ПЦР, ИФА. Реакцию коагглютинации (РКоА) используют для определения вида шигелл. Эту реакцию можно проводить уже на второй день исследования при наличии на среде достаточного количества лактозонегативных колоний. С этой целью на типичную колонию наносят каплю протеина А стафилококка, сенсибилизированного антителами против шигелл. Чашку осторожно покачивают и через 15 минут под микроскопом наблюдают появление агглютината. |