Общая микробиология
 Скачать 0.8 Mb.
|
|
Патогенез холеры. Входными воротами инфекции при холере является пищеварительный тракт. Попав в организм человека, значительная часть вибрионов погибает в желудке под действием соляной кислоты. Оставшаяся часть возбудителя достигает тонкой кишки, щелочная среда которой является благоприятной для размножения холерного вибриона. Холера является неинвазивной инфекцией, так как вибрионы локализуются на поверхности слизистой оболочки и в просвете тонкого кишечника, не проникая внутрь энтероцитов. Но энтероциты тонкой кишки являются мишенью для холерного экзотоксина. Для достижения клеток-мишеней холерному вибриону необходимо преодолеть слой слизи на поверхности энтероцитов. Преодолению этого барьера способствует подвижность возбудителя, его способность к хемотаксису, образование гемагглютинина-протеазы и муциназы. Гемагглютининпротеаза вызывает агглютинацию эритроцитов, расщепляет фибронектин и субъединицу А холерного токсина, отщепляет вибрионы от поверхности энтероцитов, способствуя распространению бактерий по кишечнику и выделению с калом. Преодолев слой слизи на поверхности тонкой кишки, холерные вибрионы прикрепляются к слизистой оболочке посредством токсин-корегулируемых пилей. После адгезии возбудитель утрачивает подвижность и усиленно размножается, образуя своеобразные колонии в виде бляшек на поверхности энтероцитов и обусловливая колонизацию кишечного эпителия. Размножаясь на слизистой оболочке тонкого кишечника, холерный вибрион продуцирует экзотоксин, который с помощью компонента В связывается с рецепторами Gm1, расположенными на наружной мембране энтероцитов. Нейраминидаза, отщепляя от рецептора Gm1 сиаловую кислоту, способствует прочному связыванию компонента В экзотоксина с поверхностью энтероцита. Затем компонент А путем эндоцитоза проникает в цитоплазму клетки и под действием внутриклеточных ферментов высвобождает активный фрагмент А1. Этот фрагмент взаимодействует с белком G, локализованном на внутренней поверхности клеточной мембраны, и устраняет его тормозящего влияния на аденилатциклазу. В результате последовательных реакций в клетке образуется цАМФ. Накопление большого количества цАМФ нарушает в энтероцитах функцию трансмембранного электролитного насоса: открываются каналы для выхода в просвет кишки ионов хлора, натрия, калия, гидрокарбонат-ионов и воды. Нарушение вводно-солевого баланса приводит к рвоте и диарее, при которой организм теряет до 2 л воды в час. С 1 л испражнений организм теряет 5 г хлорида натрия, 4 г гидрокарбоната натрия, 1 г хлорида калия. Объем испражнений может достигать 20-30 л в сутки. В результате этого происходит обезвоживание организма. Стул при этом приобретает характерную консистенцию “рисового отвара” из-за присутствия в солевом растворе эпителиальных клеток кишечника. Потеря воды и электролитов приводит к развитию тяжелого обезвоживания, шока в результате гиповолемии, гипокалиемии и метаболического ацидоза, судорог, холерного алгида, пареза кишечника. Эндотоксин холерного вибриона воздействует на арахидоновую кислоту, входящую в состав фосфолипидов клеточных мембран. В результате этого происходит синтез простагландинов, которые вызывают сокращение гладкой мускулатуры тонкого кишечника и обусловливают тенезмы (ложный позыв к дефекации). Клиническая картина холеры. Течение холеры может быть типичным или атипичным. Типичное течение заболевания в зависимости от степени обезвоживания организма может протекать в легкой форме (дегидратация составляет до 3% от массы тела), среднетяжелой форме (дегидратация составляет 4-6% от массы тела), тяжелой форме (дегидратация составляет 7-9% от массы тела) и крайне тяжелой форме (дегидратация составляет свыше 9% от массы тела). В 80-90% случаев холера протекает в легкой или среднетяжелой форме. Атипичное течение холеры может протекать в стертой форме, в форме геморрагической или сухой (без диареи) холеры. Менее чем в 20% случаев развивается типичная холера с признаками умеренного или тяжелого обезвоживания. Инкубационный период при холере варьирует от нескольких часов до 6 суток, чаще всего - 1-2 дня. В первый период заболевания (легкая степень, холерный энтерит) на фоне нормальной температуры отмечается редкий жидкий стул и рвота. Самочувствие больного удовлетворительное. Больные жалуются на сухость во рту, жажду, мышечную слабость. Заболевание продолжается 1-2 дня. Во второй период заболевания (среднетяжелая степень, острый гастроэнтерит) наблюдается частая рвота, урчание в животе, частый стул (15-20 раз в сутки), который постепенно теряет каловый характер и принимает вид “рисового отвара” - мутная жидкость с плавающими в ней клетками эпителия и слизью. Характерной чертой является сладковатый “рыбный” (не фекальный) запах испражнений (запах сырого тертого картофеля). Появляются судороги отдельных групп мышц. Голос становится сиплым. Тургор кожи уменьшается. Больные жалуются на сухость во рту, жажду, слабость. В третий период заболевания (тяжелая степень, холерный алгид) у больных отмечается частый обильный водянистый стул, рвота, выраженные судороги мышц, падение артериального давления, одышка, цианоз кожных покровов. В результате обезвоживания черты лица заостряются, глаза западают, голос становится сиплым, иногда наблюдается афония. Характерный признак обезвоживания – “гиппократово лицо” (facies hippocratica): запавшие глаза, заострённые черты лица с резко выступающими скулами. Тургор кожи сильно снижен, в результате чего кожная складка не расправляется – симптом “руки прачки”. Температура тела падает ниже нормы. У больных резко снижается объём мочи с развитием острой почечной недостаточности. В результате обезвоживания происходит сгущение крови, развивается цианоз, кислородное голодание, артериальная гипотензия, гипотермия, сердечная недостаточность, анурия, судороги мышц конечностей, живота, лица, нарушение сознания. Это состояние называется холерным алгидом (лат. algidus – холодный). Микробиологическая диагностика. Диагностические исследования при холере проводятся в специализированных лабораториях, имеющих разрешение на проведение работ с возбудителем холеры. Основным методом диагностики холеры является бактериологический. Материалом для исследований служат испражнения, рвотные массы, жёлчь, секционный материал (фрагменты тонкой кишки и жёлчного пузыря), загрязненное испражнениями постельное и нательное бельё, вода, ил, сточные воды, гидробионты, смывы с объектов окружающей среды, пищевые продукты. Для выявления бактерионосительства исследуют испражнения. Испражнения отбирают резиновыми катетерами, стеклянными трубочками с оплавленными краями или ректальными тампонами. Из объектов внешней среды чаще всего исследуют воду открытых водоемов и сточные воды. При отборе и транспортировке материала необходимо соблюдать следующие правила: - материал следует доставлять в лабораторию не позднее 2 часов после забора, так как возбудитель быстро погибает, особенно в испражнениях. При невозможности быстрой доставки материала в лабораторию пробы помещают в транспортные среды (1% пептонная вода с рН 8,2-8,6); - ёмкости для материала нельзя обеззараживать химическими веществами, так как возбудитель чувствителен даже к следовым количествам дезинфектантов; - после доставки в лабораторию исследуемый материал в возможно короткие сроки высевают на питательные среды. Основными критериями лабораторной диагностики холеры являются: - обнаружение в мазках из испражнений тонких изогнутых грамотрицательных палочек, располагающихся в виде “стайки рыб”; - активная подвижность вибрионов при исследовании раздавленной капли; - мгновенная иммобилизация (обездвиживание) вибрионов при добавлении О-холерной сыворотки; - образование голубоватой нежной пленки на пептонной воде через 5-6 часов и характерных колоний на щелочном МПА через 12 часов после посева исследуемого материала; - агглютинация вибрионов при использовании противохолерных сывороток; - лизис вибрионов типовыми холерными бактериофагами. Исследования материала проводят по схеме: I этап. Из испражнений и рвотных масс готовят мазки, высушивают на воздухе, фиксируют в смеси Никифорова (смесь равных объемов этилового спирта и безводного серного эфира) и окрашивают водным раствором фуксина или по Граму. Подвижность бактерий определяют методом раздавленной капли. Исследуемый материал высевают в первую среду накопления - пептонную воду (ПВ), на щелочной МПА и на элективную среду (СЭДХ или TCBS). Посевы инкубируют при температуре 37ОС. По результатам проведенных исследований выдают первое предварительное заключение о наличии в исследуемом материале вибрионов. II этап. Через 6-8 часов инкубирования посевов в термостате производят пересев с первой среды накопления во вторую среду накопления (пептонную воду). Высеваемость холерного вибриона в этом случае повышается на 10%. С первой среды накопления производят также пересев на плотные питательные среды (щелочной МПА, среду TCBS). Из пленки на поверхности ПВ готовят мазки и препараты раздавленной капли. Пленку на ПВ исследуют в реакции агглютинации с О-холерной сывороткой. Выдают второе заключение о природе выделенного вибриона. Подозрительные колонии с плотных питательных сред пересевают на среды Ресселя или Клиглера для выделения чистых культур. III этап. Через 12-16 часов от начала исследования производят пересев со второй среды накопления на щелочной МПА, повторно изучают морфологию, подвижность и агглютинабельность культуры, выросшей на второй среде накопления и на плотных питательных средах. При положительных результатах исследования агглютинабельности колоний выдают третье заключение о результатах исследования. IV этап. Через 18-24 часа с начала проведения работ подозрительные колонии с плотных питательных сред исследуют в реакции агглютинации с холерными сыворотками (О1, О139, Инаба, Огава) и пересевают на двууглеродные среды (лактозосахарозная, глюкозолактозная, Клиглера) и щелочной агар для выделения чистой культуры и ее идентификации. V этап. Через 24-36 часов от начала исследования отбирают подозрительные колонии и проводят идентификацию культур по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, подвижности, агглютинации с помощью диагностических агглютинирующих сывороток О, ОR, Инаба и Огава, фаголизабельности с холерными диагностическими фагами. VI этап. Через 36-48 часов от начала исследования учитывают результаты идентификации выделенных культур и выдают окончательный ответ о возбудителе. При подозрении на холеру часто проводят ускоренную диагностику по З.В. Ермольевой. Для этого исследуемый материал (испражнения) высевают в пептонную воду, пептонную воду с О-сывороткой и пептонную воду с крахмалом. При положительном результате в пептонной воде наблюдается характерный рост культуры в виде нежной голубоватой пленки на поверхности среды, в среде с О-сывороткой отмечается агглютинация вибрионов, а среда с крахмалом не изменяет своего цвета при добавления йода в результате разложения крахмала. В настоящее время для экспрессной диагностики применяют метод флюоресцирующих антител (МФА), полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакцию иммобилизации вибрионов (РИВ), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). МФА позволяет идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры серогруппы О1 при его содержании в исследуемом материале не менее чем 105 микробных клеток в 1 мл. МФА используют для исследования нативного материала от больных (испражнения и рвотные массы), материала после подращивания на питательной среде, для выявления холерных вибрионов в воде и смывах. ПЦР основана на определении генов холерного токсина (ctxAB) и токсинкорегулируемых пилей (tcpA). Этот метод используют для исследования испражнений, рвотных масс, воды, смывов, стоков, чистых культур вибрионов. РИВ основана на утрате подвижности холерных вибрионов под влиянием специфических сывороток. Эта реакция позволяет обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации в исследуемом материале не менее 10 5 микробных клеток в 1 мл. Для постановки РИВ на предметное стекло наносят 2 капли исследуемого материала. Первая капля служит контролем, ее накрывают покровным стеклом. Вторая капля является опытной. К ней добавляют каплю холерной О1 или О139 сыворотки, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленные капли просматривают под микроскопом. При наличии в исследуемом материале холерных вибрионов в первой капле наблюдается характерная подвижность, а во второй капле отмечается иммобилизация микробных клеток. РИВ позволяет дать ответ через 15-20 минут. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) проводится с использованием антительного эритроцитарного холерного диагностикума. РНГА позволяет дать ответ о наличии специфического антигена уже через 2-3 часа. Принадлежность холерных вибрионов к О1 или О139 серогруппе определяют в реакции слайд-агглютинации (реакции агглютинации на стекле) или в развернутой реакции агглютинации с холерными агглютинирующими сыворотками О1, Инаба, Огава, и О139. В последние годы в идентификации холерных вибрионов используют новые серологические методы: реакцию коагглютинации (РКОА) и реакцию агглютинации объемную (РАО). Реакция коагглютинации (РКОА) проводится на стекле с помощью диагностикумов, коагглютинирующих О1 и О139 холерные вибрионы. Эти диагностикумы представляют собой препараты, содержащие белок А стафилококков, сенсибилизированный кроличьими О1 и О139 холерными сыворотками. Холерные антитела, сорбированные на стафилококковом белке, при соединении с холерными антигенами вызывают реакцию коагглютинации. Реакция агглютинации объемная (РАО) используется для выявления липазной активности холерных вибрионов с целью дифференциации гемолитических (атоксигенных) и негемолитических (токсигенных) штаммов V. cholerae eltor, выделенных из окружающей среды. РАО проводится в планшетах с использованием полимерного антилипазного иммуноглобулинового диагностикума. Диагностикум выпускается в комплекте с нормальной кроличьей сывороткой. Определение антител в крови больных (серологическая диагностика холеры) носит вспомогательный характер. Серологическое обследование позволяет подтвердить диагноз в случае атипичного течения заболевания, а также является важным методом ретроспективной диагностики холеры. Для серологической диагностики используют методы, позволяющие выявлять в сыворотке крови больных, вибриононосителей, реконвалесцентов, вакцинированных лиц специфические антитела (агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела). Специфические агглютинины к холерным вибрионам серогруппы О1 выявляют путем постановки объемной реакции агглютинации (РА), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антигенным поливалентным О1 холерным диагностикумом, реакции нейтрализации антигена (РНАг) с иммуноглобулиновым холерным диагностикумом. Антитоксины к холерным вибрионам серогрупп О1 и О139 выявляют в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием энтеротоксического холерного диагностикума. Вибриоцидные антитела обнаруживают с помощью реакции вибриоцидных антител (РВА). Иммунитет. Постинфекционный иммунитет при холере непродолжительный. Иммунитет носит антитоксический и антимикробный характер, обусловлен антителами, клетками иммунной памяти и фагоцитами. При этом антитоксические антитела сохраняются в организме дольше, чем антимикробные антитела. У больных холерой специфические антитела выявляются на 5-7 день от начала заболевания. Основная роль в иммунитете против холеры принадлежит антителам, продуцируемым местно (на слизистой оболочке кишечника). Антимикробные иммуноглобулины А слизистых оболочек блокируют лиганды на поверхности микробных клеток и препятствуют прилипанию вибрионов к энтероцитам. В результате этого снижается способность холерных вибрионов к адгезии и колонизации, что приводит к быстрому выведению возбудителя из организма при перистальтике кишечника. Антитоксические антитела взаимодействуют с В-субъединицей экзотоксина, в результате чего блокируют связывание холерогена с рецептором Gm1 на поверхности энтероцитов. Лечение холеры. При подозрении на холеру больных госпитализируют в специализированное отделение. Лечение больных холерой должно начинаться с восстановления нормального водно-солевого обмена (симптоматическое лечение). С этой целью рекомендуется использовать солевые растворы, содержащие хлорид натрия, бикарбонат натрия, глюкозу. Жидкости вводят как перорально, так и парентерально, внутривенно. Количество вводимого солевого раствора определяют с помощью специальных формул с учетом относительной плотности плазмы и концентрации калия в ней. Потери жидкости определяют, собирая рвотные массы и испражнения в специальную мерную посуду. Для этого больного помещают на так называемую “холерную” кровать Филипса, имеющую отверстие на уровне ягодиц больного, а транспортировку больного осуществляют на специальных носилках. Симптоматическое лечение солевыми растворами дополняют антибиотикотерапией, что позволяет снизить летальность при холере до 1% и менее. Из антибиотиков используют препараты тетрациклинового ряда (тетрациклин, доксициклин), фторхинолоны (ципрофлоксацин, ломефлоксацин, офлоксацин), эритромицин, левомицетин (хлорамфеникол). Профилактика холеры. Профилактика холеры складывается из неспецифических и специфических мероприятий. К мерам неспецифической профилактики холеры относятся санитарно-гигиенические мероприятия, предупреждающие занос заболевания; санитарно-просветительная работа среди населения; раннее выявление больных и бактерионосителей; карантинные мероприятия. Особое внимание уделяется снабжению населения качественной питьевой водой, хлорированию воды, соблюдению санитарно-гигиенического режима на пищевых предприятиях, в детских учреждениях, общественных местах. Осуществляется строгий бактериологический контроль воды в открытых водоемах. Экстренная профилактика холеры проводится путем массового профилактического назначения тетрациклина в районах эпидемической опасности. С этой же целью используют и другие антибиотики, эффективные против V. cholerae. |